Name: הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: למד שיטת בידוד תאי סטרומה פריווסקולרית מכליה אנושית ברמת דרגה קלינית. השיטה כוללת הדממה של אנזימים ועשרור תאי NG2 לטיפולי תאים במחלות כליה ורפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה קיבל מימון מתוך תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (האיחוד FP7/2007-2013) תחת גרנט מספר הסכם 305436 סטלר.

הוועדה האתית הרפואית המקומית והמועצה המייעצת האתית של הקונסורציום האירופי (STELLAR) אישרו מחקר ואיסוף של כליות בדרגת השתלה אנושית שהושלכו בעיקר מסיבות כירורגיות. הסכמת המחקר ניתנה לכל הכליות.
1. הכנות לתרבית תאים
<ol>
	<li>הכינו בריכה של ליזטים טסיות דם.
	<ol>
		<li>אחסן את הטסיות שפג תוקפן פחות מ-2 יום ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (למשך שנה אחת לכל היותר). 
		הערה: הטסיות הגיעו במקור מספק מסחרי. הושגו עודפי חומר מבית החולים שחולק על ידי בנק הדם המקומי.</li>
		<li>הפשירו את הטסיות של לפחות 5 תורמים (רצוי 10) O/N ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>אחסנו את הטסיות בבקבוק סטרילי גדול, העבירו לצינורות צנטריפוגות חרוטיות וסובבו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 1,960 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס><.
		הערה: נפח הטסיות תלוי במספר התורמים ובכמות החומר העודף של בית החולים לכל תורם.</li>
		<li>פיפטה את הסופרנטנט לשקיות דם (50 מ"ל/שקית) דרך הקנה של מזרק 50 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת מדיום תרבית תאים.
	<ol>
		<li>יש להפשיר שקית אחת של טסיות דם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>יש להוסיף לשקית 1 ליטר (כלומר 2 בקבוקים) של Minimum Essential Medium - שינוי אלפא (alphaMEM), 5 מ"ל 200 מ"ל גלוטמין ו-20 מ"ל פניצילין (5,000 יחידות למטר)/סטרפטומיצין (5,000 מיקרוגרם/מ"ל) (עט/סטרפטוקוק).</li>
		<li>יש לדגור למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>נער את השקית להתפרקות על ידי הקשה עדינה על השקית כאשר התיק מונח על משטח ישר.</li>
		<li>מסננים את מדיום הליזאטים של 5% טסיות הדם על ידי משיכת הליזטים דרך המסנן של מערכת העירוי בעזרת מזרק סטרילי של 50 מ"ל.</li>
		<li>מניחים את המדיום בצינורות של 50 מ"ל ושומרים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. 
		הערה: כל אצווה חדשה של ליזטים טסיות נבדקת בתרבית תאים ומושווה לאצווה הקודמת על ידי גידול תאים מעניינים (bmMSCs או kPSCs) למפגש בשתי האצווה. במספר התאים ובכדאיות, ה-kPSCs או ה-bmMCs הגדלים באצווה החדשה לא צריכים להיות שונים ביותר מ-10%, וביטוי הסמנים של CD73, CD90, CD105 ו-CD31, CD34 ו-CD45 כפי שנותח על ידי ציטומטריית זרימה לא אמור להיות שונה. שיטות תרבית התאים מתוארות בסעיף 6 לפרוטוקול (תרבית kPSC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. הכנות לקצירת תאים
<ol>
	<li>הכנת פתרונות.
	<ol>
		<li>הכן את המדיום הרגיל על ידי הוספת 10 מ"ל עט/סטרפטוקוקוס ל-500 מ"ל (בקבוק אחד) של המדיום החיוני המינימלי (DMEM)-F12 של Dulbecco.</li>
		<li>הכן את אמצעי הכביסה על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום אנושי רגיל (NHS) ו-10 מ"ל של עט/סטרפטוקוקוס לבקבוק אחד של DMEM-F12.</li>
		<li>הכן את מאגר מלאי האנזים על ידי הוספת 2.9 מ"ל 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 1.2 מ"ל NaHCO3 2.5% [w/v] ו-160 מיקרוליטר CaCl2 (1 M) עד 160 מ"ל תמיסה של אוניברסיטת ויסקונסין.</li>
		<li>הכן את תמיסת הקולגנאז על ידי הוספה איטית של 20 מ"ל של חוצץ מלאי אנזימים לבקבוק קולגנאז בדרגת GMP המכיל קולגנאז של >2,000 יח' לבקבוק. ממיסים ב-4 מעלות צלזיוס למשך כ-40 דקות. יש לנער בעדינות מספר פעמים במהלך תקופת המסה.</li>
		<li>הכן את מדיום ההקפאה על ידי הוספת 5 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל-45 מ"ל NHS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת מגש זלוף (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A).
	<ol>
		<li>נקה את תא הזרימה וכסה בווילונות כירורגיים. מחממים אמבט מים לכ-40 - 45 מעלות צלזיוס כדי לחמם את מגש הזלוף ל-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>חבר מגש זלוף מעוקר לאמבט המים כדי לחמם מראש את מגש הזלוף במים חמים. ודא שאין אוויר במגש הזילוף על ידי התחלה עם מגש הזילוף במצב אנכי. במידת הצורך הוסף עוד מים לאמבט המים כדי למנוע עירוי אוויר למגש הזלוף.</li>
		<li>הנח את צינור LS25 במשאבה. השאר את שני הקצוות הסטריליים של הצינור בארון הזרימה. מניחים מלקחיים של קוצ'ר בקצה אחד של הצינור ומניחים לנוח על תחתית מגש הזילוף. הניחו גזה סטרילית על גבי הצינור כדי למנוע חסימה. חבר מחבר Luer בקצה הצינור השני.</li>
		<li>הוסף כ-100 מ"ל של מדיום רגיל לתוך מגש הזילוף והתחל לשטוף את הצינור במהירות משאבה של 100 מ"ל לדקה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. בידוד תאי כליה
<ol>
	<li>הכנת הכליה.
	<ol>
		<li>הוציאו את הכליה מהשקיות הסטריליות הכפולות והניחו על מגש הזלוף הסטרילי (איור 1B). הסר את רקמת השומן הפרי-כלייתית ואת קפסולת הכליה בעזרת מספריים וקריעה עדינה (איור 1C) וזהה את עורק הכליה על מדבקת אבי העורקים כפי שמוצג ב-איור 1D.</li>
		<li>קנול את עורק הכליה עם ספייק האביזר, תקן עם קרע קשירה מעוקר והצמד לקצה צינור המשאבה עם מחבר Luer בזמן שהמשאבה פועלת. אם הצינורות אינם מלאים לחלוטין, תחילה הוסף עוד מדיום למגש ושטוף את הצינורות על ידי הפעלת המשאבה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1E - F). שטפו את הכליה במדיום רגיל דרך המשאבה בזרימה של 100 מ"ל לדקה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>טיפול בקולגנאז ובידוד תאי כליה.
	<ol>
		<li>הוסף קולגנאז (20 מ"ל, >2,000 U) ו-DNase (2.5 מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל) למגש הזלוף (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1גרם). סובב את הכליה מדי פעם בעדינות ביד. המתן עד שהכליה תהיה רכה ונוזל הזלוף יהפוך פחות שקוף (כ- 30 - 40 דקות).</li>
		<li>עסו בעדינות את הכליה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1H) עד לקבלת תרחיף תאים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1I). הסר חומר שאינו מעוכל ואת הספייק בעורק הכליה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>שטיפה ואיסוף תאי כליה.
	<ol>
		<li>הוסף 50 מ"ל של ה-NHS לתרחיף התאים. רוקנו את תרחיף התאים ממגש הזלוף על ידי הנחת המשאבה בזרימה נמוכה והנחת הצינור המחובר תחילה לכליה מעל צינורות 50 מ"ל (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1J).</li>
		<li>צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 7 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט. שטפו את הכדורים עם מדיום כביסה המכיל 10% NHS ושוב צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 7 דקות. חזור על הכביסה פעם נוספת. מדוד את נפח כדורי התא והוסף נפח שווה של מדיום תרבית תאים.</li>
		<li>או לשמר את התאים בהקפאה מכאן על ידי הוספת מדיום הקפאה 1:1 לתרחיף התא ולאחסן בבקבוקונים קריוגניים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, או להמשיך בתרבית התאים (סעיף 4). 
		הערה: תרחיף התאים מכיל גושי תאים ודורש שלבים נוספים להשגת תאים בודדים, מה שמביא לעלייה במוות התאים. לכן, התאים נשמרים בתרחיף ואינם נספרים בשלב זה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. תרבית תאים של תאי כליה גולמיים
<ol>
	<li>הוסף כ-1 מ"ל של תרחיף התאים ל-24 מ"ל של אלפא MEM 5% טסיות דם (מדיום תרבית תאים) בבקבוק תרבית תאים T175 (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1K) ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הסר את המדיום ואת פסולת התאים לאחר 2 ימים מהתאים הדבקים ורענן את המדיום עם 25 מ"ל של מדיום תרבית תאים.</li>
	<li>רענן את מדיום התרבות פעמיים בשבוע על ידי הסרת מחצית מהמדיום (12.5 מ"ל) והוספת מדיום טרי (12.5 מ"ל) בטכניקות אספטיות.</li>
	<li>תרבית עד להתכנסות (בדרך כלל 5 - 7 ד') (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1L). הסר את המדיום, שטוף פעמיים עם PBS ונסה את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל טריפסין לכל בקבוק T175 למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו בתרבית בינונית וצנטריפוגה ב-490 x גרם למשך 5 דקות והוציאו את הסופרנטנט.</li>
</ol>
5. העשרת תאים עבור NG2 על ידי הפרדת תאים מגנטיים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1M)
<ol>
	<li>הכן את מאגר הפרדת התאים בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
	<li>השעו מחדש את ה-kPSCs הטריפסינים במאגר הפרדת תאים של 10 מ"ל. צנטריפוגה ב-490 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במאגר הפרדת תאים של 300 מיקרוליטר.</li>
	<li>הוסף 100 μL FcR חוסם ריגן/5 x 107 תאים, הוסף 100 μL חרוזי אנטי-מלנומה (NG2) לכל 5 x 107 תאים, ודגירה למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הפרד את השבר החיובי ל-NG2 בהתאם לפרוטוקול היצרן. הוסף 10 מ"ל של תאים בינוניים וצנטריפוגות למשך 5 דקות ב -490 x גרם.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות תא ספירה של Bürker לפי פרוטוקול היצרן. זרעו את התאים בבקבוק תרבית (כ-4 x 103 תאים/ס"מ2) ודגרו. 
	הערה: זרעו את התאים בריכוזים הבאים: <250,000 בבקבוק T25, 250,000 - 500,000 בבקבוק T75 ו- 700,000 - 800,000 בבקבוק T175. לאחר העשרת תאים מגנטיים, מבודד חלק חיובי של כ -1 - 2%. אולם מאחר ששלב זה הוא העשרת תאים ולא מיון תאים, סוגי תאים אחרים יהיו נוכחים בתרבית (איור1 N). אחרי כמה מעברים (בדרך כלל בסביבות 4-5), רק אוכלוסיית kPSC הומוגנית נוכחת (<מחלקה חזקה="xfig">איור 1P).</li>
</ol>
6. תרבית של kPSCs
<ol>
	<li>רענן את המדיום פעמיים בשבוע על ידי הסרת מחצית מהמדיום והחליפו אותו במדיום תרבית שזה עתה הופשר (איור 1N). 
	הערה: ה-kPSCs נוטים להיות ברי קיימא ומתרבים יותר כאשר רק מחצית מהמדיום עובר רענון.</li>
	<li>מעבר של kPSCs. 
	הערה: העבירו את ה-kPSCs במפגש של 90-100%, או כאשר מבנים תלת-ממדיים מופיעים (ראו איור 1O), או כאשר לא הייתה גדילת תאים במשך יותר משבוע. שני האחרונים עשויים להופיע במיוחד במעברים מוקדמים לאחר העשרת התאים. במקרה הזה, אחרי המעבר, התאים בדרך כלל יתחילו לגדול שוב בתרבית חד-שכבתית (איור 1P).
	<ol>
		<li>הסר את המדיום מהתאים המתכנסים 90 - 100% (שמור את המדיום לשימוש מאוחר יותר). שטפו את הבקבוק פעמיים עם PBS (1 מ"ל ב-T25, 5 מ"ל ב-T75, 10 מ"ל ב-T175). מוסיפים טריפסין (0.5 מ"ל ב- T25, 2 מ"ל ב- T75, 5 מ"ל ב- T175) ודוגרים למשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים את המדיום הישן לבקבוק ומשרים בעדינות.</li>
		<li>העבירו לצינור של 15 או 50 מ"ל (תלוי בנפח) וצנטריפוגה ב-490 x גרם למשך 5 דקות. ספרו את התאים והצלחת הקיימא <250,000 ב-T25, 250,000 - 500,000 ב-T75, או 700,000 - 800,000 ב-T175 (בערך 4 x 103 תאים/ס"מ2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>בדוק את ה-kPSCs במעבר 5 או 6 (למשל, בדיקת שריטות, סעיף 7). 
	הערה: אפיין את התאים המופצים על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. ביטוי סמן של NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC צריך להיות חיובי ו-CD31, CD34, CD45 ו-HLA-DR צריכים להיות שליליים. בדיקת מיקופלזמה, חיידקים ופטריות במדיום התרבית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים של המעבדה למיקרוביולוגיה קלינית. בדוק את ה-kPSCs מבחינה תפקודית בבדיקת שריטות פצע אפיתל בכליות. ניסויים מבוצעים בדרך כלל עם אוכלוסיות kPSC הומוגניות סטריליות שאושרו על ידי זרימה ציטומטרית עם יכולת ריפוי פצעים בין מעבר 6-8.</li>
	<li>שימור בהקפאה של ה-kPSCs על ידי הוספת מדיום שימור בהקפאה של 0.5 מ"ל לתרחיף תאים של 0.5 מ"ל (2 מיליון תאים למ"ל של מדיום תרבית) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. 
	הערה: לאחר ההפשרה, זרעו את ה-kPSCs בצפיפות גבוהה יותר (10-6 תאים ב-T175).</li>
</ol>
7. בדיקה פונקציונלית של kPSCs: בדיקת שריטות פצע אפיתל בכליות
<ol>
	<li>תרבית את ה-kPSCs בצלחת של 6 בארות בצפיפות של 200,000 תאים/באר במדיום תרבית של 2 מ"ל. לאחר 48 שעות של תרבית ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, אספו את הסופרנטנט. זהו המדיום המותנה.</li>
	<li>זרע את HK-2 (תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים)17 ב-2 מ"ל של מדיום תאי אפיתל צינורי פרוקסימלי (PTEC) המורכב מיחס של 1:1 של DMEM-F12 בתוספת אינסולין (5 מ"ג/מ"ל), טרנספרין (5 מ"ג/מ"ל), סלניום (5 ננוגרם/מ"ל), הידרוקורטיזון (36 ננוגרם/מ"ל), טריודוטירינין (40 פ"ג/מ"ל), גורם גדילה אפידרמיס (10 ננוגרם/מ"ל) ועט/סטרפטוקוקוק, בצפיפות של 500,000 תאים לבאר בצלחת תרבית תאים בת 6 בארות.</li>
	<li>תרבית במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. הסר את מדיום תרבית התאים של ה- HK-2s וצור פצע שריטות בשכבה החד-שכבתית של HK-2s על ידי ביצוע שריטה עם קצה נקודת פיפטה צהובה מלמעלה לתחתית הבאר. שטפו את ה-HK-2s עם PBS והוסיפו את המדיום המותנה של ה-kPSCs או מדיום הבקרה. סמן בתחתית הצלחת את האזור שיש לצלם. 
	הערה: מטוסי ה-HK-2 צריכים להיות מתלכדים. דמיין שני אזורים לבאר.</li>
	<li>דמיין את השריטה ב-4, 8, 12 ו-24 שעות באותו מיקום מסומן עם מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך.</li>
	<li>מדדו את אזור האחסון הזמני בתמונה J בעזרת הכלי בחירת מצולעים לקביעת אחוזי הסגירה.</li>
</ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation.</a> Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).</li>
<li>Reinders, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+allograft+rejection+after+renal+transplantation%3A+results+of+a+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+a+pilot+study+of+safety+and+clinical+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).</li>
<li>Perico, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+and+kidney+transplantation%3A+pretransplant+infusion+protects+from+graft+dysfunction+while+fostering+immunoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation.</a> Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Sacchetti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Identical+%22Mesenchymal+Stem+Cells%22+at+Different+Times+and+Sites%3A+Human+Committed+Progenitors+of+Distinct+Origin+and+Differentiation+Potential+Are+Incorporated+as+Adventitial+Cells+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myocardial+pericytes%3A+multipotent+mesodermal+precursors+exhibiting+cardiac+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity.</a> Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).</li>
<li>Dekel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+nontubular+sca-1%2Blin-+multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+from+adult+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+duct-derived+cells+display+mesenchymal+stem+cell+properties+and+retain+selective+in+vitro+and+in+vivo+epithelial+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity.</a> J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-Grade+Isolated+Human+Kidney+Perivascular+Stromal+Cells+as+an+Organotypic+Cell+Source+for+Kidney+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+mesenchymal+stem+cells+in+human+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli.</a> Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).</li>
<li>Ryan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HK-2%3A+an+immortalized+proximal+tubule+epithelial+cell+line+from+normal+adult+human+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney.</a> Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).</li>
<li>Nijhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycemic+Stability+Through+Islet-After-Kidney+Transplantation+Using+an+Alemtuzumab-Based+Induction+Regimen+and+Long-Term+Triple-Maintenance+Immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression.</a> Am J Transplant. , (2015).</li>
</ol>

D.G.L., M.A.E., ו T.J.R. המשויכים בקשה לרישום פטנט לגבי המחקר הזה. המחברים האחרים אין לחשוף.

תאים Perivascular היה מבודד רבים האנושי מוצק איברים שונים, לרבות הלבלב, שומן, סחוס, ה9,15,של הכליה16. עם זאת, רוב השיטות, מבוססים על דוגמאות קטנות של רקמות, אשר גזור ו שטופלו לאחר מכן אנזימי עיכול. יתר על כן, זה בדרך כלל לא מבוצע עם מוצרים קליניים בכיתה. זה הופך אסטרטגיות אלו פחות מתאים ישירה תרגום קליני שבו כמויות גדולות של תאים קליני-כיתה נחוצים.
הנה אנחנו מראים שיטת בידוד הרומן kPSCs אנושי עבור כל האיברים בהתבסס על זלוף עם אנזימים כיתה קליניים וחומרים. הפרוטוקול הוא ממאמרו של פרוטוקול בידוד לנגרהנס קליניים נמצא כעת בשימוש עבור היישום הקליני שלנו מרכז18.
זוהי שיטת כיתה הקליני הראשון היכן ניתן להשיג כמויות גדולות של kPSCs. ההשתנות תא כממוצע הוא במידה רבה התורם התלויים. עם זאת, כאשר התשואה תא שאנחנו כרגע להשיג של שבריר של התליה תא גולמי של שלושה תורמים שונים הוא אומדן, בתיאוריה, התשואה הממוצעת של 2.7 x 1012 kPSCs לכל תורם יכול להיות מושגת. כפי MSC טיפול מורכב בדרך כלל 2 חליטות תא עם 1-2 x 106 תאים/ק"ג משקל גוף4, המספרים תא מספיקים לטיפול allogenic של מספר חולים.
שלב קריטי אחד בהליך בידוד הוא משך העיכול collagenase. כאשר תקופת העיכול קצרה מדי, יישארו גושים גדולים של רקמות, אשר יהיה קשה יותר לתרבות. כאשר תקופת זלוף הוא ארוך מדי, עלולים להיות שנצפו מות תאים מוגברת. לכן, ברגע הכליה מתחילה להיות רכה ונוזלים פחות שקוף, הכליה מומלץ לעסות בעדינות, יש להפסיק את הטיפול collagenase.
עוד צעד קריטי הוא התרבות של התאים לאחר NG2 תא העשרה. לפעמים אחרי העשרת תא NG2, התאים perivascular אינן מתחילות להתרבות או להתחיל לגדול ב- 3D מבנים. במקרה זה, כאשר התאים הם trypsinized, reseeded, התאים בדרך כלל יתחיל לצמוח בתרבות חד שכבתי.
כמתחילה חומר, שימשו אנושי להשתלה כיתה הכליות שנמחקו בעיקר מסיבות כירורגי. אלה הם איברים פונקציונליים ללא פיברוזיס הגדולות. אנו להכיר שזו עלולה להיות מגבלה כמו זה יחסית נדיר וקשה להשיג מקור איברים. הכליות explanted יכול להיות מקור נוסף; עם זאת, בהתאם לסיבת explantation הכליה, הכליות אלה עשוי להכיל פיברוזיס יותר ובכך myofibroblasts, ולכן צריך לקחת כיוון myofibroblasts עלול להיות מבודדת ותרבותית במקום perivascular תאים.
KPSCs מבודדים עם הפרוטוקול הזה מאפיינים אורגניות-typic עם כליה אפיתל פצע ריפוי קיבולות15, טיפול בתאי עם kPSCs במחלות כליה, השתלת יהיה יישום מעניין בעתיד. למטרה זו, ישנן מספר אסטרטגיות של משלוח המוצר תא התא. האסטרטגיה הראשונה היא העירוי הרביעי של kPSCs, משמש כיום בכל המחקרים הקליניים bmMSC. יישום מעניין נוסף הוא שימוש kPSCs או גורמים מופרש kPSC מכונת זלוף לפני השתלת. בדרך זו, האיכות של הכליה explanted עשוי לשפר את אשר יכול להוביל בתפקוד הכליות משופר לאחר ההשתלה. עבור שתי אסטרטגיות, kPSCs הם מקור תא חדש מעניין לחקור לעומק למטרות קליניות.

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) הם תאים חיסוניים modulatory, שהיו במקור מבודד ממח העצם. הם מאופיינים שלהם פלך בצורת מורפולוגיה, היכולת להתמיין שומן, עצמות, סחוס הדבקות מפלסטיק. MSCs מבטאים את הסמנים סטרומה CD73, CD90, CD105 בעת היותו שלילי כדי להפוך את סמנים CD31 CD451,2,3. MSCs הם מועמד מבטיח טיפול בתאי בשל רקמת homeostatic ויכולות immunomodulatory שלהם. bmMSCs הם נחקר כעת בניסויים קליניים עבור מספר מחלות, כולל מחלות כליה השתלת כליה כפי שנבדקו במקום אחר4.
בעבר זה היה הראו כי perivascular תאים של מספר איברים מוצקים שונים, כולל רקמת שומן, השליה ואת שרירי השלד מאפיינים משותפים עם MSCs9. עם זאת, תאים אלה גם ייתקלו פונקציות רקמות ספציפיות אשר עלולה לגרום לתיקון organotypic10. התאים perivascular שריר הלב האנושי, לדוגמה, מגורה האנגיוגנזה תגובות לאחר היפוקסיה, הבדיל לתוך cardiomyocytes, בעוד perivascular תאים מבודד לרקמות אחרות לא הראה פוטנציאל אלה11.
תאי סטרומה Perivascular ניתן גם מבודד מן העכבר12,13,14 ו15,כליה אנושית16. אנו בהרחבה המאופיינת kPSCs, לעומת אלה bmMSCs. מצאנו כי kPSCs, הדומה bmMSCs, יש קיבולות לדיכוי המערכת החיסונית, יכול לתמוך היווצרות כלי דם פלקסוס. עם זאת, ישנם רקמות הבדלים מסוימים בין סוגי תאים, כמו kPSCs הראה חתימה ביטוי גנים ברמת השעתוק organotypic, לרבות גורמי שעתוק nephrogenic HoxD10 ו- HoxD11. kPSCs, בניגוד bmMSCs, לא עברה טרנספורמציה myofibroblast לאחר גירוי עם TGF-β, לא היו מסוגלים להתמיין adipocytes. יתר על כן, kPSCs מואצת יושרה האפיתל בכליה הפצע אפיתל צינורי assay מאפס, תופעה שבה לא נצפתה עם bmMSCs. את הפצע משופרת תיקון הייתה מתווכת באמצעות שחרור פקטורי גדילה hepatocyte. יתר על כן, kPSCs יושבחו אי-ספיקת כליות במודל של עכברים של כליות חריפה פגיעה15. לכן, kPSCs נראה שיש לך יכולות תיקון כליות מעולה, הם מקור חדש מעניין עבור תא טיפול במחלות כליה.
כדי להיות מסוגל להשתמש kPSCs למטרות טיפול תא, kPSCs צריך להיות מבודד בצורה קלינית כיתה עם אנזימים כיתה קליניים ופרוטוקולים. יתר על כן, כדי שתוכל לטפל כמה חולים עם kPSCs של התורם 1, מספרי הטלפון הנייד מספיקים צריכה להתקבל. הנה אנחנו מראים בפירוט, ההליך בידוד כיתה קליני של kPSCs מן הכליות להשתלה כל כיתה, מניב מספר מספיק של תאים כדי לשמש לטיפול קליני הסלולר.

<table><tbody><tr><td>שקיות בקסטר</td><td>Fenwal</td><td>R4R-7004</td><td></td></tr><tr><td>טסיות דם אנושיות</td><td>חומר עודף בית חולים Sanquin פג תוקף פחות מ -2 d משמש</td><td></td> טסיות דם ליזאט בהתאמה אישית בקבוקים סטריליים חד פעמיים קורנינג 09-761-11 500 מ"ל צינורות צנטריפוגה PP קורנינג 431123 a-MEM <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td>לונזה</td><td>בינונית BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמקס</td><td>תרמו פישר</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוק;</td>מערכת עירוי <td>15070063</td><td></td> <td>Invitrogen</td></tr><tr><td></td><td>Codan</td><td>455609</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>סרום אנושי רגיל (NHS)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Lonza</td><td>BE-17-737E</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 7.5%</td> <td>Lonza</td><td>BE17-613E</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>UW</td><td>Bridge to Life</td><td>32911</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז NB1 GMP דרגה</td><td>SERVA</td><td>17455.03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>וילונות כירורגיים</td><td>3M Nederland</td><td>DH999969404</td><td></td></tr><tr><td>משאבת זלוף</td><td>METROHM</td><td>X007528300</td><td></td></tr><tr><td>ראש משאבה</td><td>METROHM</td><td>X077202600</td><td></td></tr><tr><td>מגש</td><td></td><td></td> זלוף <td>בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>LS25 Masterflex צינורות Masterflex</td><td></td><td>HV-96410-25</td><td></td></tr><tr><td>אביזר ספייק</td><td>Gambro DASCO</td><td>6038020</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozyme</td><td></td> צלוחיות תרבות רוש <td></td><td></td></tr><tr><td>25 ס"מ2</td><td>greiner</td><td></td> בקבוק תרבית 690175 <td></td></tr><tr><td>75 ס"מ2</td><td>greiner</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית 175 ס"מ2</td><td>greiner</td><td>661160</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמה</td><td>t4174</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500g</td><td></td></tr><tr><td>FcR מגיב חוסם</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים נגד מלנומה (NG2)</td> <td>Miltenyi</td><td>130-090-452</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 70 ומיקרו; m</td><td>קורנינג</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מגנט MACS</td><td>miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555821</tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555485</tr><tr><td>CD146 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550315</tr><tr><td>NG2 APC</td><td>R& D</td><td>FAB2585A</td><td></td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555596</tr><tr><td>HLA ABC APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555555</tr><tr><td>CD105 FITC</td><td>Ancell</td><td>326-040</td><td></td></tr><tr><td>HLA DR APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>559866</tr><tr><td>CD56 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555516</tr><tr><td>CD73 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>550257</tr><tr><td>CD31 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555445</tr><tr><td>CD133 PE</td><td>miltenyi</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-r&nbsp;</td><td>מו"פ D</td><td>mab 1263</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG1 FITC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td>עכבר 345815</td></tr><tr><td>IgG1 PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר 345816 IgG1 APC</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>345818</tr><tr><td>IgG2b PE</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555743</tr><tr><td>עז אנטי עכבר PE</td><td>Dako</td><td>R0480</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Merck</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Ham' s F12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>ITS (אינסולין, טרנספרין, סלניום)</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>טריודותירינין</td><td>סיגמא</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס (EGF)</td><td>סיגמה</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>PTEC כליות אנושי מונצח (HK2)</td><td></td><td></td> <td>באדיבות מ. ראיין, יוניברסיטי קולג' דבלין</td></tr></tbody></table>

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה perivascular כליה אנושית

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) הם homeostatic ואת המערכת החיסונית modulatory בתאי רקמת הראו השפעות מועילות על מחלות כליה והשתלות. Perivascular תאי סטרומה (מגירסה) חולקות מאפיינים עם מח עצם MSCs (bmMSCs). עם זאת, גם ברשותם, קרוב לוודאי עקב החתמה מקומיים, רקמות ספציפיות מאפיינים ולשחק תפקיד רקמות מקומיות הומאוסטזיס. סגוליות רקמות זה עלול לגרום רקמות תיקון ספציפי, גם בתוך הכליה אנושי. בעבר הראינו כי כליה אנושית מגירסה (kPSCs) לשיפור משמעותי ריפוי ואילו bmMSCs לא היה פוטנציאל זה הפצע אפיתל של הכליה. יתר על כן, kPSCs ניתן להפחיתם פגיעה בכליות בתוך vivo. לכן, kPSCs מהוות מקור מעניין עבור טיפול בתאי, במיוחד עבור השתלת כליות ומחלות כליה. הנה אנחנו מראים שיטת בידוד ותרבות מפורט עבור kPSCs מכיתה-השתלת כליות אנושי המבוסס על איברים שלמים זלוף של אנזימי עיכול דרך עורק הכליות העשרה עבור דה מרקר perivascular NG2. בדרך זו, תאים גדולים כמויות ניתן להשיג המתאימים לטיפול הסלולר.

שיטת בידוד kPSCs כיתה קליניים מסוכם באיור1. תאי הכליה גולמי מבודדים מן הכליות להשתלה אנושי כיתה מאת collagenase זלוף. התליה תא וכתוצאה מכך הוא תרבותי עד confluent ב 5% טסיות lysates. אז השבר תאי סטרומה perivascular הוא מבודד המבוסס על הביטוי NG2.
kPSCs פלסטיק דמוי פלך תאים חסיד (איור 2א) והם חיובי עבור הסמנים סמני סטרומה CD73, CD90, CD105, perivascular NG2, PDGFR-B ו- CD146, בעוד שלילי CD31, CD34, CD45, ד ר הלע (איור 2B). בדרך כלל, ניתן להגיע אוכלוסיה הומוגנית של kPSCs-מעבר 4, kPSCs להגיע הזדקנות ביולוגית סביב המעבר 9-10 (איור 2C). אנו ממליצים לבצע ניסויים בין המעבר 5-8.
כדי להעריך את יכולת תפקודית של kPSCs מבודדים, אנחנו מבצע של במבחנה כליות אפיתל פצע שריטה assay אצוה החדש של kPSCs, כפי שהראנו בעבר המדיום ממוזגים של kPSCs יכולים להאיץ את ריפוי הפצע אפיתל זו שריטה assay15. המדיום ממוזגים kPSC נעשית על ידי culturing kPSCs במשך 48 שעות, alphaMEM 5% lysates טסיות דם ואיסוף את תגובת שיקוע. בשלב הבא, מונצחים כליה אנושית המקורבת בתאי אפיתל (HK-2)17 מתורבתים עד confluent, ואז נוצר פצע שריטה. לאחר מכן או המדיום ממוזגים של מדיום kPSCs או בקרה נוספת הבארות, למדוד את המהירות של ריפוי הפצע. כשנוספת המדיום ממוזגים של kPSCs, הפצע נסגר מהר יותר באופן משמעותי (איור 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig1.jpg"> 
איור 1 : קליני כיתה בידוד בשיטה של זכויות kPSCs. השתלת כליות כיתה לצינוריות, perfused עם collagenase דרך עורק הכליה (A - G), התליה תא וכתוצאה מכך נשטף, גם cryopreserved או להכניס תרבות (H - K). לאחר התאים להגיע confluency (L), NG2 תא העשרה הוא ביצע (M). התאים הם trypsinized כאשר גם הם confluent, פסקו מתרבים או כאשר מבנים תלת-ממד מופיעים (N - P). הקריטריונים לשחרור kPSCs הן עקרות, סמן ביטוי את היכולת לשפר ריפוי הפצע אפיתל צינורי (Q). חץ: עורק הכליה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55841/55841fig2.jpg"> 
איור 2: kPSCs אפיון של האדם. ) KPSCs הם תאים חסיד בצורת כישור, פלסטיק. KPSCs B) הן חיוביות לסמני mesenchymal CD73, CD90, CD105, סמנים perivascular NG2, PDGFR-β, CD146, בעוד שלילי עבור CD31, CD34 ו- CD45. kPSCs אקספרס מחלקה MHC אני (הלע-ABC) אבל לא class II (הלע ד ר). C) צמיחה מאפייני שלושה תורמים kPSC שונים של cytometry זרימה אישר הומוגנית NG2 אוכלוסיות חיובי (ב פסקה 4). kPSCs להגיע הזדקנות ביולוגית סביב המעבר 9-10. KPSCs D) מסוגלים לשפר תיקון האפיתל בכליה assay טיוטה הפצע. להחליפן בתמונות של שליטה בינוני, בינוני kPSC ממוזגים-t = 0, 4, 8 ו- 12 שעות מוצגים. בר בקנה מידה א') = מיקרומטר 200, ברה) = 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55841/55841fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן אנו מציגים כיתה קליניים הרומן בידוד ותרבות שיטה כליות Perivascular סטרומה תאים (kPSCs) המבוסס על כל האיבר זלוף עם אנזימי עיכול והעשרה תא NG2. בשיטה זו, אפשרי לרכוש מספרי הטלפון הנייד מספיק לתרפיה תאית.

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

המטרה הכוללת של שיטת בידוד זו בדרגה קלינית היא לבודד תאי סטרומה פרי-וסקולריים מהכליה האנושית, או kPSC, לצורך טיפול תאי במגוון מחלות כליה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון זיהוי תאי kPSCs אנושיים המתאימים לטיפול תאי במחלות כליה ולהשתלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם היותה קלינית, והיכולת להשתמש בה כדי להפיק מספר מספיק של תאי kPSCs למטרות טיפול תאי.אלן ליברס, טכנאית במעבדתנו, תדגים את הבדיקה התפקודית של kPSCs. לפני תחילת הליך בידוד תאי הכליה, חברו מגש פרפוזיה סטרילי למקלח מים במצב אנכי. כאשר מגש הפרפוזיה יחומם על ידי המים, העבירו את המגש למצב אופקי, תוך שהיא עדיין מחוברת למקלח המים, ולאחר מכן הכניסו צינור L/S 25 למשאבה.הנח את פינצטת התרביות בקצה אחד של הצינור ואפשר לצינור להישען על תחתית המגש. הנח גזה סטרילית על גבי הצינור כדי למנוע חסימה, וחבר מחבר luer לקצה השני של הצינור, לאחר מכן הוסף כ-100 milliliters של מצע למגש והתחל בשטיפת צינור L/S 25 במהירות משאבה של 100 milliliters לדקה. כדי לבודד את תאי הכליה, העבר את הכליה מהשקיות הסטריליות הכפולות אל מגש הפרפוזיה הסטרילי, והסר את רקמת השומן הפרי-רנלית ואת קפסולת הכליה באמצעות מספריים וקריעה עדינה.לאחר איתור העורק הכליתי בטלאי האורטי, השתמש במסמר העזר כדי לבצע קניולציה לעורק הכליתי, ואבטח את המסמר באמצעות אזיק sterilized tie wrap. כאשר המשאבה פועלת, חבר את קצה צינור המשאבה למחבר הלור (luer connector). שטוף את הכליה עם המצע הנמצא במגש בקצב זרימה של 100 milliliter per minute.בשלב הבא, הוסיפו 20 milliliters של collagenase ו-2.5 milliliters של DNAse למגש הפרפוזיה, ואפשרו לאנזימים לעיכל את הכליה, תוך סיבוב עדין של האיבר ביד מדי פעם עד שיהיה רך ונוזל הפרפוזיה יתחיל להפוך למעכיר. משך העיכול על ידי ה-collagenase הוא קריטי; זמן קצר מדי יוביל להיווצרות גושי תאים, בעוד שזמן ארוך מדי יוביל למות תאים. בסיום הפרפוזיה האנזימטית, עסו בעדינות את הכליה עד לקבלת תגסוס תאים, והסִירו את החומר שלא עובד עיכול ואת ה-spike.הוסיפו 50 milliliters של סרום אנושי נורמלי לתליה התאית, ולאחר מכן, כאשר המשאבה פועלת בקצב זרימה נמוך, מקמו את הפחית המחוברת לכליה מעל מספר פחיות איסוף של 50 milliliters כדי לאפשר לתליה התאית להתנקז מתוך מגש הפרפוזיה אל פחיות האיסוף. כאשר כל התאים נאספו, סובבו את התלייות התאיות בצנטריפוגה, ושטפו את המשקעים פעמיים עם תוכה לשטיפה, המועשר ב-10% סרום אנושי נורמלי. לאחר השטיפה השנייה, השביו את המשקעים בנפח של תוך גידול תאים השווה לנפח המשקעים התאיים.כדי לגדל את תאי הכליה הגולמיים, הוסיפו כ-1 milliliters של תרחיף תאים ל-24 milliliters של מצע גידול תאים alpha-MEM עם 5% platelet lysate לכל בקבוק תרבית T 175, והדגירו את הבקבוקים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר יומיים הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ואת שאריות התאים, והזינו את התאים ב-25 milliliters של מצע גידול תאים טרי. כאשר התאים מגיעים למצב של התמסגרות (confluence), בודדו את הפראקציה החיובית ל-NG2 באמצעות הפרדה מגנטית של תאים, בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים.לאחר מכן, זרע 4×10³ תאים חיוביים ל-NG2 לסמ"ר בבבקבוק תרבית תאים בגודל מתאים, והנח את הבבקבוק באינקובטור לתרבית תאים. כאשר התאים מגיעים ל-90% עד 100% התלכדות (confluency), אסוף את העליון (supernatant) ושטוף את התאים הדבקים פעמיים ב-PBS.נתק את התאים באמצעות נפח מתאים של trypsin בהתאם לגודל הבבקבוק, ועצור את התגובה באמצעות העליון ששומר בצד לאחר חמש דקות.שחזרו בעדינות את התאים, לאחר מכן העבירו את תגסוס התאים למבחנה קונית בגודל מתאים לצנטריפוגה, וזרעו את התאים מחדש בצפיפות של 4 × 10³ תאים לסמ"ר. לעיתים, לאחר העשרה של NG2, התאים מפסיקים להתרבות או מתחילים לגדול במבנים תלת-ממדיים. ניתן לפתור זאת על ידי ביצוע טריפסינציה לתאים וזריעתם מחדש.לאחר ארבעה עד חמישה מעברים, זרעו את ה-kPSCs בצלחת שש-בארות בריכוז של 2×10⁵ תאים ל-2 milliliters של מצע לכל בארה, וזרעו 5×10⁵ תאי אפיתל תעלתיים פרוקסימליים ב-2 milliliters של מצע תאי אפיתל תעלתיים פרוקסימליים לכל בארה בצלחת שש-בארות נפרדת. הניחו את שתי הצלחות באינקובטור לתרביות תאים למשך 48 שעות, וגבו את העליון (supernatant) של תאי ה-kPSC בסיום הדגירה; לאחר מכן, הסירו את העליון של תאי האפיתל התעלתיים הפרוקסימליים והשתמשו בקצה פיפטה צהוב כדי ליצור שריטה בשכבת התאים החד-שכבתיים בתחתית כל בארה. שטפו את התאים שנשרטו ב-PBS, והוסיפו את המצע המותנה (conditioned medium) מתרביות תאי הסטרומה הווסקולריים של הכליה.לאחר מכן, דמיינו את השריטה לאחר ארבע, שמונה, 12 ו-24 שעות באותה נקודה מסומנת באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) הפוך, כדי להעריך את אחוז הסגירה לאורך זמן. תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה הם תאים בעלי צורת כישור הנצמדים לפלסטיק, שהם חיוביים לסממנים של תאי סטרומה ותאים פרי-וסקולריים, ושליליים לסממנים CD31, CD34, CD45 ו-HLA-DR. בדרך כלל ניתן להגיע לאוכלוסייה הומוגנית של תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה במעבר (passage) רביעי, כאשר התאים מגיעים לשלב של סנסנציה (הזדקנות תאית) סביב מעבר 9 עד 10.בבדיקת שריטת פצע מייצגת זו, להערכת היכולת התפקודית של ה-kPSCs, כאשר הוסף מדיום מותנה מתרבית של תאי סטרומה פרי-וסקולריים של הכליה, הפצע נסגר באופן משמעותי מהר יותר מאשר בבארים שגודלו עם מדיום ביקורת. לאחר השליטה בטכניקת הבידוד הראשוני, שתארך כשעתיים, יידרשו חודש עד חודשיים כדי להפיק אוכלוסיית kPSC הומוגנית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להפסיק את הטיפול ב-collagenase ברגע שהכליה הופכת לרכה והנוזלים הופכים לפחות שקופים.בנוסף לנהלים המוצגים כאן, ניתן להשתמש בטכניקות אלו גם לבידוד תאי סטרומה פרי-וסקולריים מאיברים מוצקים אחרים. ניתן להשתמש ב-kPSCs שבודדו בטכניקה זו כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של תאים אלו במספר מודלים שונים של מחלות כליות והשתלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים לבודד ולתרבת kPSCs בסטנדרט קליני.אל תשכחו שעבודה עם חומרים אנושיים טומנת בחובה סיכון להעברת נגיפים; יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון בדיקה ל-HIV, הפטיטיס B והפטיטיס C, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

a-novel-clinical-grade-isolation-method-for-human-kidney-perivascular

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר את השיטה לבידוד גלומרולי שלם מכליות עכבר. הגלומרולי העטוף והמכוסה המתקבל כך יכול לשמש גם לטיפוח גידולי תאי אפיתל קודקודיים מהכליה המורין.

בידוד גלומרולי: טכניקה להשגת גלומרולי שלם מכליה מורין

בסרטון זה, אנו מדגימים את השלבים לבידוד וטיהור תאי אפיתל צינוריים של הכליה עבור מגוון רחב של מחקרים בביולוגיה מולקולרית ובתרביות תאים.

בידוד תאי כליות מורין: טכניקה לבודד וליצור תרבית ראשונית של תאי אפיתל צינורית הכליה

פרוטוקול זה מתאר דה-סלולריזציה של כליות חולדות Sprague Dawley על ידי זלוף קדמי של חומרי ניקוי דרך כלי הדם, ויוצר מטריצות חוץ-תאיות של כליות המשמשות כתבניות לאכלוס מחדש עם תאי אפיתל כליה אנושיים. רסלולריזציה ושימוש בבדיקת זלוף רזזורין לניטור הצמיחה מבוצעים בתוך ביו-ריאקטורים זלוף שתוכננו במיוחד.

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

טכניקות אמינות ויעילות לבידוד תאי חיסון כליות נחוצות ליישומים במורד הזרם. זה דורש תיוג נוגדנים על פני השטח של מספר קטן של תאי חיסון כליות. כאן אנו מתארים שיטה תמציתית לבידוד תאי חיסון בכליות שלכאורה משיגה מטרה זו.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

רקמות מהונדסים בונה כליות לספק פתרון מצוקת איברים, השפעות מזיקות של דיאליזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מיקרו לנתח הכליות מאתר עבור בידוד של מקטעי מדולרי-cortico. מקטעים אלה מושתלים לתוך המבנים לגרדום ללא הסלולר, ויוצרים organoids כליות.

Microdissection של מקטעי רקמת הכליה העיקרי, התאגדות עם טכנולוגיית הרומן לבנות בפיגומים-חופשית

המוקד העיקרי של פרוטוקול זה הוא לבודד ביעילות glomeruli העיקרי קיימא תרבויות עם מזהמים מינימלית לשימוש במגוון רחב של יישומים במורד הזרם. Glomeruli מבודד שומרים על קשרים מבניים בין סוגי תאים רכיב וניתן בתרבית שמחוץ לזמן קצר.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

מוצג כאן פרוטוקול מוגדר כימית להפקת פופוטים כליות אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים ביעילות גבוהה (&gt;90%) ותלויים במניפולציות גנטיות או בבחירת תת-אכלוס. פרוטוקול זה מייצר את סוג התא הרצוי בתוך 26 ימים והוא יכול להיות שימושי לבדיקות nephrotoxicity ומידול מחלות.

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

מוצג כאן פרוטוקול להנדס מערכת איבר-על-שבב מותאמת אישית המשחזרת את המבנה והתפקוד של מחסום הסינון הגלומרולרי בכליות על ידי שילוב תאי אפיתל וכלי דם מותאמים גנטית המובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. מערכת מהונדסת ביולוגית זו יכולה לקדם את רפואת דיוק הכליות ואת היישומים הקשורים אליה.

שבב גלומרולוס כליות איזוגני מהונדס מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.

בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים

אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי לעיבוד כליות אנושיות שלמות כדי לבודד ולתרבית תאי אפיתל של צינורית פרוקסימלית ראשונית של הכליה ויישום תאים אלה בפלטפורמה תלת מימדית, מיקרופלואידית, מיקרופיזיולוגית כדי לסכם את הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית.

בידוד תאי אפיתל פרוקסימליים ראשוניים אנושיים והשימוש בהם ביצירת מודל מיקרופיזיולוגי של הצינורית הפרוקסימלית הכלייתית

מחקר זה פיתח פרוטוקול אופטימלי לבידוד תאים מזנגיאלים של עכברים (MCs) ותרבית תאי ex vivo שלהם. ניתן להעביר תאים אלה מספר פעמים, להקפיא, להחיות ולתרבית מבלי לפגוע בצמיחת התאים או בביטוי החלבון.

אופטימיזציה של בידוד וטיהור של תאים מזנגיים גלומרולרים של עכברים

למד שיטת בידוד תאי סטרומה פריווסקולרית מכליה אנושית ברמת דרגה קלינית. השיטה כוללת הדממה של אנזימים ועשרור תאי NG2 לטיפולי תאים במחלות כליה ורפואה רגנרטיבית.

הרומן כיתה קלינית שיטת בידוד תאי סטרומה Perivascular כליה אנושית

גלה סרטונים נוספים