Name: בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו לבודד תאי אנדותל פרוגניטורים מדם טבורי אנושי ללא מיון תאים. שיטה זו מאפשרת הנדסת רקמות כלי דם ומחקר ביומרקרים לסיכון קרדיווסקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס CMMI-1452943 ועל ידי המכללה בהצטיינות אוניברסיטת ארקנסו. אנחנו גם רוצים להכיר את בנק דם טבורי ארקנסו סיפק לנו כבל יחידות דם.

מחקר זה בוצע באישור אוניברסיטת ארקנסו הועד המוסדי (אישור מספר 16-04-722). יחידות דם חבל הטבור היו שנאספו ציטראט פוספט תמיסת דקסטרוז (שיקגו) ב ארקנסו בנק דם טבורי, יחידות לא מימש את הדרישה עבור אחסון נתרמו למחקר. כבל יחידות דם היו couriered למעבדה תוך 24 שעות של אוסף בטמפרטורות סביבה.
 1. בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי <ol><li>הכנה של ריאגנטים.
	<ol><li>להכין EGM על-ידי הוספת אנדותל הבזליים בינוני (EBM) 10% סרום שור עוברית (FBS) בתוספת 20 ng/mL של פקטורי גדילה דמויי אינסולין (IGF), חומצה אסקורבית µg/mL 1, 5 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (rhEGF), µg 22.5/mL הפארין, 0.5 ng/mL כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), יחד עם 10 ng/mL של recombinant האנושי פיברובלסט גורם גידול B (rhFGF-B), 0.2 הידרוקורטיזון µg/mL, ו-2% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין. לעקר את המדיום תרבות באמצעות polyethersulfone (פסי) 0.2 µm ממברנה מסנן ואקום.</li>
		<li>הכן עכברוש הזנב אני קולגן פתרון-ריכוז של 50 µg/mL באמצעות חומצה אצטית N 0.02 נקודות. לעקר את הפתרון הזה באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm.</li>
		<li>מעיל מראש צלחות 6-ובכן עם 2 מ של החולדה מוכנה הזנב אני קולגן פתרון עבור כל טוב. למקם אותם בתוך אינקובטור ומתוחזק על 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני זריעה.</li>
		<li>לדלל כ 25 מ של דם טבורי עם הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS)-ריכוז 1:1.</li>
		<li>Assay הכן רדיו-חיסונית משקעים (ריפה) המאגר באמצעות 150 מ מ נתרן כלורי, 1% טריטון X-100, 0.5% נתרן deoxycholate, 1 מ מ β-glycerophosphate, מרחביות 0.1% ו- 50 מ מ טריס (pH 8.0).</li>
	</ol></li> <li>בידוד של אנדותל ובתאים.
	<ol><li>כל חמים שהוכנו ריאגנטים באמבט מים ומתוחזק על 37 ° C לפני בידוד.</li>
		<li>להוסיף 20 מ של צפיפות בינונית ריאגנט הדרגתי. שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל.</li>
		<li>בזהירות שכבה 20 מ של דם טבורי מדולל בצינור צנטריפוגה המכיל צפיפות בינונית מעבר צבע מבלי לשבור שכבה זו על-ידי כיוון על פיפטה לכיוון הקירות הצדדיים של הצינור.</li>
		<li>להפריד את מרכיבי הדם בהתבסס על צפיפות שלהם ( איור 1) על-ידי צריך שתוציאו ב g x 800 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם הבלמים של הרוטור צנטריפוגה חופש. נא לא להפריע הרבדים השונים.</li>
		<li>להסיר את השכבה פלזמה על ידי בקפידה pipetting זה יצא הצינור מבלי להפריע תא שני שכבות עד הקצה פיפטה הוא מסוגל להגיע את MNC שכבה (ראה איור 1). למחוק פלזמה שהוסר. 
		הערה: בעת שימוש פיפטה טיפים להסרת הפלזמה, להשאיר שכבה קטנה של פלזמה מעל לשכבה MNC ( איור 1) כדי להפחית הפרעות.</li>
		<li>לאסוף את המעיל באפי המכיל את MNCs באמצעות מזרק לגריל של מחט בקוטר 18. ולהעביר אותו ל שפופרת צנטרפוגה טריים.</li>
		<li>להוסיף אמצעי שווה של EBM לצנטריפוגה MNCs. שנאספו הצינורות האלה ב 500 x g 10 דקות ב-4 ° C. להשליך תגובת שיקוע. 
		הערה: בגדר תא יופיע אדום בגלל הנוכחות של תאי דם אדומים/אריתרוציטים.</li>
		<li>הוסף 5 מ של אמוניום כלוריד לפתרון lyse כדוריות דם אדומות. דגירה הצינורית הזאת על קרח למשך 5-10 דקות, ברעידות ומדי פעם. 
		הערה: זהירות יש לנקוט במהלך שלב זה לא תעלה על משך הזמן, כפי שהוא יכול להיות מזיק MNCs.</li>
		<li>Centrifuge הצינורות ב 500 g x 10 דקות ב 4 ° C ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נמשכות, חזור על שלבים 1.2.8 ו 1.2.9 עד אין צבע אדום הוא ציין בגדר.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב EGM מוכן ולהשתמש את hemocytometer כדי לספור את MNCs.</li>
		<li>וביופסיה העכברוש הזנב אני מצופים קולגן צלחת 6-טוב (מתוך שלב 1.1.3) ולשטוף הבארות שלוש פעמים עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
		<li>זרע בגדר MNC resuspended ב EGM לצלחת קולגן-ריכוז של עונה 1 פרק 10 7 MNCs כל היטב. מניחים אותה 37 ° C, 5% CO 2 מיכלים.</li>
		<li>לאחר 24 שעות, תשאף המדיום ולשטוף הבארות פעם אחת עם EGM. להוסיף 3 מ"ל של מדיום EGM מכל קידוח ולמקם אותו בחזרה 37 ° C, 5% CO 2 מיכלים.</li>
		<li>לחדש את צלחת בינונית EGM טריים כל יום במשך 7 ימים. לאחר 7 ימים, שינוי המדיום EGM בכל יום אחר.</li>
		<li>באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, לקחת תמונות של צלחת 6-ובכן כל יום כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תאי אנדותל מושבות. לסמן את הצלחת היכן המושבות עולות כדי לעקוב אחר הצמיחה שלהם. 
		הערה: בדרך כלל לוקח בין 5 ל 9 ימים על המושבות להופיע בתרבות.</li>
	</ol></li> <li>הרחבה של אנדותל ובתאים.
	<ol><li>את המעיל. הבקבוק התרבות T-25 עם עכברוש הזנב אני קולגן (50 µg/mL) למקם אותו ב- C ° 37, 5% CO 2 מגשים לפחות 60 דק. וביופסיה ואת לשטוף את הבקבוקון תרבות תא T-25 שלוש פעמים עם PBS 1 x לפני זריעה התאים.</li>
		<li>Trypsinize המושבות תא אנדותל כאשר הם מגיעים כ 3 מ מ גודל באמצעות µL 150 של 0.05% טריפסין-EDTA פתרון כל היטב. למקם את הצלחת 6-ובכן בחזרה 37 ° C, 5% CO 2 מגשים עבור מינימום 2-3</li>
		<li>טפח בעדינות את הצלחת 6-טוב מכך התאים המצורפת. מיד להוסיף 2 מ של EGM ולשחזר את התאים בתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולחשב את צפיפות זריעה הראשונית-</li>
		צינורות <li>ספין לצנטריפוגה 15 מ"ל ב 400 g x עבור 5 דק Resuspend בגדר תא ב EGM, את הבקבוק T-25 עם ~ 500,000 תאי זרע. לסמן את הבקבוק הזה. כמו מעבר 1 ולמקם את הבקבוק T-25 חזרה 37 ° C, 5% CO 2 מיכלים. 
		הערה: תאים יכול להיות מצופה EBM, DMEM כדי להשוות את הצמיחה עם EGM.</li>
		<li>עבור עוד קטעים, הבקבוק מגיעה למפגש 90%, בצע שלבים 1.3.1 - 1.3.5, reseed את התאים-10 תאים/ס מ 4 2 על המבחנות תרבות תא T-75 או T-175. המשך לאפיון של תאים מבודדים (שלבים 2 ו- 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. אפיון מבודד התאים באמצעות ווסטרן סופג <ol><li>µL 50-100 הוספה של פירוק מאגר על כל מעבר בעת ביצוע השלבים הרחבה כדי לאפיין את התאים מבודד. לאסוף את החלבונים כ 500,000 או יותר מתאי.</li>
	<li>פיפטה למעלה ולמטה נמרצות קרע את התאים ולשחרר את החלבונים. לאסוף ולהעביר את החומר הממתן ל צינור microcentrifuge.</li>
	<li>לסובב את הצינור microcentrifuge ב 500 x g ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע ל צינור microcentrifuge. תווית ולאחסן את הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך-</li>
	<li>לכמת את כמות החלבונים בצינור כל שימוש או ברדפורד &#39; assay s או BCA 27 , 28 , 29.</li>
	<li>לבצע את המערבי סופג באמצעות הליכים סטנדרטיים 27 , 28 , 29. ניתוח µg 5 של חלבון הכולל עבור הביטוי של CD31, CD34, VEGFR2 וα-SMA. השתמש α-טובולין על נירמול הנתונים.</li>
</ol> 3. עקיף Immunofluorescence <ol><li>Sonicate coverslips זכוכית מ מ 18 דקה 50% אתנול, לייבש אותם. להשאיר את coverslips נקי בצלחת 12-ובכן לילה ב למכסה אבטחה עם אולטרה אור על לחטא אותם.</li>
	<li>מעיל coverslips עם 50 & #181; g/mL של עכברוש הזנב אני קולגן ולהעביר לצלחת 37 ° C, 5% CO 2 מגשים לפחות 60 דקות</li>
	<li>תשאף הקולגן ולהוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x לצלחת 12-טוב לשטוף את coverslips. האחות של PBS 1 x וחזור פעמיים.</li>
	<li>זרע 250,000 תרבותי EPCs כל טוב ובמקום אותם חזרה 37 ° C, 5% CO 2 חממה לפחות 3 ימים לפני ביצוע immunostaining.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 1 x PBS. להוסיף 1 מ"ל של מתנול כקרח מכל קידוח, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לתקן את התאים.</li>
	<li>לבצע את immunostaining באמצעות 28 , 27 , 29 פרוטוקול סטנדרטי. להשתמש את הנוגדנים שלהם דילולים המתאים (למשל, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100), VEGFR2 (1:50)).</li>
	<li>תמונות של coverslips immunostained באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.</li>
</ol>

<ol><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275 (5302), 964-967 (1997).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).</li>
<li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92 (2), 362-367 (1998).</li>
<li>Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+identity%2C+phenotype%2C+and+fate+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta1+modulates+extracellular+matrix+production%2C+proliferation%2C+and+apoptosis+of+endothelial+progenitor+cells+in+tissue-engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds.</a> Circulation. 114, 1 Suppl 193-199 (2006).</li>
<li>Sales, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Progenitor+Cells+as+a+Sole+Source+for+Ex+Vivo+Seeding+of+Tissue-Engineered+Heart+Valves%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves.</a> Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).</li>
<li>Liew, A., Barry, F., O'Brien, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+diagnostic+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations.</a> Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).</li>
<li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).</li>
<li>Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unresolved+questions%2C+changing+definitions%2C+and+novel+paradigms+for+defining+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells.</a> Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial progenitor cells.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692(2012).</li>
<li>Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+what+use+for+the+cardiologist%5BTitle%5D)+AND+%22J+Angiogenes+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist.</a> J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).</li>
<li>Camci-Unal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-modified+hyaluronic+acid+hydrogels+to+capture+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells.</a> Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).</li>
<li>Hill, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+vascular+function%2C+and+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk.</a> N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).</li>
<li>Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+properties+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+potential+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Cardiovasc+Dis%22%5BJournal%5D)">Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy.</a> Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).</li>
<li>Mehta, J. L., Szwedo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+progenitor+cells%2C+microparticles+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease.</a> J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).</li>
<li>Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).</li>
<li>Cebotari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+tissue+engineered+human+heart+valves+using+autologous+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells.</a> Circulation. 114, 1 Suppl 132-137 (2006).</li>
<li>Ito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+as+putative+targets+for+angiostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin.</a> Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).</li>
<li>Vasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+circulating+endothelial+progenitor+cells+by+statin+therapy+in+patients+with+stable+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease.</a> Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+microvessels+on+three-dimensional+biodegradable+scaffolds+using+human+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).</li>
<li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+and+their+progenitor+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood.</a> J Vasc Surg. 31 (1), Pt 1 181-189 (2000).</li>
<li>Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+and+hydrocortisone+on+the+co-culture+of+mature+adipocytes+and+endothelial+cells+for+vascularized+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering.</a> Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).</li>
<li>Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetazolamide+Mitigates+Astrocyte+Cellular+Edema+Following+Mild+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury.</a> Sci Rep. 6, 33330(2016).</li>
<li>Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cell+contractile+strength+and+metabolic+state+are+dependent+on+its+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape.</a> Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).</li>
<li>Tandon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cell+shape+modulates+cell+contractility+independent+of+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype.</a> J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).</li>
<li>Cockshell, M. P., Bonder, C. S. <a target="_blank" href="http://www.bio-protocol.org/e1772">Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells.</a> Bio-Protocol. 6 (7), (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כפי שהוזכר קודם, מחסידי EPCs בעלי מורפולוגיה המרוצף. MNCs מבודד שלנו התקדם מ מושבה תא בצורת כישור (איור 2א-2D) בשלבים המוקדמים למושבת קאבלסטון (איור 2E-2F) על פני תקופה של 10 ימים בתרבות. EPCs סומנו כאנטי באופן שונה על ידי קבוצות מחקר שונות, כלומר כמו תאים מאוחר קדמון אנדותל10, המושבה אנדותל ויוצרים תאים5, או תאי אנדותל קדמון12. יצוין כי תאים אלה זהים מבחינה...

מספר חוקרים חקרו את המאפיינים ואת הפוטנציאל של האדם EPCs5,10,11,12,13. EPCs יכול להיות מתואר מחזורי תאים בעלי היכולת לדבוק רקמת אנדותל באתרים של היפוקסיה, איסכמיה, פציעה או היווצרות הגידול ולתרום היווצרות של כלי דם מבנים חדשים4,14. מעורבותם שנצפה כורוידאלית, בצורה של vasculogenesis כמחנכת, הובילה להבנה של הפתופיזיולוגיה של תאים אלה והשימוש שלהם יישומים טיפוליים4,15, 16. מספר EPCs של הפרט הוכח להיות בקורלציה עם מחלה קרדיו9,15,16,17,18,19 ,20. מחקרים אחרים יש גם הבדיל EPCs לתוך הפנוטיפ פיברובלסט כמו שסתום, הציע כי תאים אלה יכול לשמש עבור הנדסת רקמות הלב שסתומים7,21.
המסוים המולקולות על פני התא צריך לבודד EPCs לא זוהו בבירור עקב אי-התאמות בין חקירות4. הדבקה של MNCs על מטריצה מסוימים, עם חשיפה למגוון רחב של תנאים תרבות, בוצעה על ידי מספר קבוצות1,17,22,23, רומז כי ייתכן EPCs בשם הצגת מאפיינים פנוטיפי שונים. מאפיינים אלה כוללים חוסר יכולת phagocytotic, שפופרת-צורה Matrigel ואת ספיגת של ליפופרוטאין בצפיפות acetylated-דיל. Clonogenic גבוהה ופוטנציאל proliferative הם שני מאפיינים עם EPCs אשר ניתן hierarchized5. EPCs יכול גם טופס במבחנה בקוריאנית כאשר cocultured עם ריאות העובר האנושי fibroblasts4. תאים אלה ידועים לבטא סמני פני השטח של תאי אנדותל וכדי לחלוק חלק סמנים hematopoietic13,24,25. הסמנים ביטוי חיובי זה מקובל עבור phenotyping EPCs הם CD31, CD34, צמיחה אנדותל כלי הדם קולטן 2 (VEGFR2), Willebrand פון פקטור (vWF), CD133, c-Kit, ואת כלי הדם קדהרין אנדותל (VE-קדהרין)4 , 18. תאים המבטאים שיתוף CD90, CD45, CD14, CD115 או אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA) לא נחשבים EPCs בגלל מוגבל proliferative פוטנציאל, היכולת שלהם phagocytose חיידקים, וחוסר יכולת ליצור דה נובו אנושי כלי ויוו4,7. מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה עבור בידודו של אנדותל ובתאים של דם טבורי האנושית ללא צורך תא כלשהו מיון פרוטוקולים. במאמר זה, השתמשנו CD31, CD34 ו VEGFR2 כסמני חיובית, עם α-SMA כאינדיקטור שלילי.
במאמר זה, אנו מציעים שיטה של בידוד ושל culturing ובתאים אנדותל של דם טבורי ללא תא מיון באמצעות התמחה מדיום הגידול אנדותל עם גורמי גדילה (EGM). EGM זו מכילה כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) ואשר גורם הצמיחה פיברובלסט (FGF), לשפר את ההישרדות, התפשטות והעברה של תאי אנדותל26. זה כולל גם חומצה אסקורבית, האחראית על שמירה על המורפולוגיה המרוצף של תאים; דמויי אינסולין גורם גדילה-1 (IGF-1), אשר מספק האנגיוגנזה ותפקוד הנדידה; הפארין, אשר גורמת לשיפור יציבות לטווח ארוך של גורמי גדילה בינונית26. גורמי גדילה אחרים שיתווספו המדיום התרבות תאי אנדותל כולל תוספי עם גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר מסייע התפשטות תאים מגרה בידול, ואת הידרוקורטיזון, אשר sensitizes לתאים EGF26 . אנו מראים כי השימוש של מדיום הגידול הספציפי הזה מניב מספר גבוה יותר של EPCs לעומת אנדותל הבזליים בינוני (EBM) או של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM).

<table><tbody><tr><td><חזק>A) לבידוד ותרבות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>מוצר זה מגיע עם כל גורמי הגדילה הדרושים לייצור סרום בקר עוברי בינוני לגידול אנדותל</td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x מאגר פוספט מלוח</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>זנב עכברוש I קולגן</td><td>קורנינג</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>אמרסקו</td><td>0714-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td><חזק>B) נוגדנים וליזטים של תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1:250 דילול&nbsp; עבור Western blotting</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>1:100 דילול עבור Western blotting</td></tr><tr><td>&alpha;-SMA</td><td>abcam</td><td>ab5694</td><td>1:100 דילול עבור Western blotting</td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin</td><td>abcam</td><td>ab7291</td><td>1:2,500 דילול עבור Western blotting</td></tr><tr><td>VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>דילול 1:100 לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>ליזאט תאי אנדותל וריד טבורי אנושי</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc24709&nbsp;</td><td></td></tr><tr>ליזאט <td></td><td></td><td>תאים אינטרסטיציאליים של שסתום</td><td>קו תאים ראשוני שתורבת ממעבדה משלו ועובר ליזה עם מאגר RIPA</td></tr> <tr><td>C) כתמים מערביים וצביעה חיסונית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>משמש כמאגר רץ</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine buffer</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>משמש כמאגר העברה</td></tr><tr><td>קרום העברה Immobilon-FL</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>זהו קרום העברת PVDF בעל 45 ומיקרו; m גודל נקבוביות ומוזכר בפרוטוקול כממברנת כתם מערבית</td></tr><tr><td>4x Laemmli מאגר דגימה</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10% קריטריון TGX ג'ל טרומי</td><td>Biorad</td><td>5671033</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific P36930</td><td>משמש להרכבת כיסויים מוכתמים חיסונית לאחסון לטווח ארוך</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>VWR אנליטי</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

קיומו של אנדותל ובתאים (EPCs) בדם היקפי ומעורבותו vasculogenesis דווחה לראשונה על ידי Ashara ועמיתיו1. מאוחר יותר, אחרים תיעד את קיום סוגים דומים של EPCs שמקורם במח העצם2,3. לאחרונה, Yoder אינגרם הראה כי EPCs נגזר דם חבל הטבור היה גבוה יותר proliferative פוטנציאל לעומת אלה מבודד למבוגרים היקפיים דם4,5,6. מלבד היותו מעורב vasculogenesis כמחנכת, EPCs גם הראו הבטחה כמקור תא ליצירת רקמות מהונדסים כלי הדם והלב שסתום בונה7,8. קיימות תקנות בידוד שונות, חלקן כרוכות המיון התא של תאי תאים (MNCs) נגזר מן המקורות שהזכרנו קודם בעזרת סמנים אנדותל, hematopoietic, או culturing אלה MNCs עם צמיחה אנדותל מיוחדים בינוני, או שילוב של טכניקות אלה9. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד, תרבות של EPCs באמצעות והתמחה אנדותל בינוני עם גורמי גדילה, ללא שימוש immunosorting, ואחריו את האפיון של תאים מבודדים באמצעות סופג המערבי, immunostaining.

בידוד והרחבה של אנדותל ובתאים: שרטוט (איור 1) מסופק המתארים את פרוטוקול הכולל. הרבדים רכיב דם שונות נצפו בעקבות צפיפות צנטריפוגה מעבר צבע של דם טבורי האנושי צפיפות בינונית הדרגתיות. לאחר זריעה MNCs על גבי הלוחות שטופלו קולגן, המוצלח מושבות נצפתה לראשונה בין 5 ימים ו- 7 (איור 2א). מושבות אלה המשיכה לגדול והיה מורפולוגיה תאים בצורת כישור (איור 2א-2D...

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי מקור אנדותליים מדם חבל טרור אנושי. שיטה זו מתארת את בידודם של תאי מקור אנדותליים מדם חבל טרור לשימוש פוטנציאלי כתאים אוטולוגיים להנדסת רקמות של שתלים כלי דם. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הליך הבידוד במצעים ייעודיים ללא צורך במיון אימונולוגי.ניתן להשתמש בתאי פרוגניטור אנדותליאליים מבודדים כדי לחקור נאו-וסקולריזציה, ודיווחים הצביעו גם על כך שניתן להשתמש בתאים אלו כסמנים ביולוגיים לזיהוי מטופלים הנמצאים בסיכון למחלות קרדיווסקולריות. לפני תחילת הליך הבידוד, יש לצפות מראש פלטות של שש בארות בשני מיליליטר של תמיסת קולגן מסוג rat tail one שהוכנה טרייה לכל בארה. יש להמתין להשגת שיווי משקל של הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שעה אחת לפחות.לאחר מכן, דללו כ-25 milliliters של דם טבעה עם HBSS ביחס של one-to-one. לאחר מכן, הוסיפו 20 milliliters של ריאגנט מדיום למדרג צפיפות לשפופרת קונית של 50 milliliter, וצקו בזהירות 20 milliliters של דם טבעה מדולל לאורך דופן השפופרת כדי ליצור שכבת דם מעל המדיום. הפרדו את התאים באמצעות סנטריפוגציה, ולאחר מכן הסירו בזהירות את שכבת הפלזמה.באמצעות מזרק המצויד במחט בכיול 18-gauge, העבירו את שכבת ה-buffy coat המכילה תאים חד-גרעיניים למבחנה חדשה בנפח 50 milliliter. הוסיפו לתאים נפח שווה של endot

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-human-umbilical-cord

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) מסתובבים לתאי אנדותל עם פוטנציאל חזק שגשוג משובט המוצגים...

אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאים מושבה אנדותל יוצרי נגזר דם טבורי האדם קורד

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

פרוטוקול זה מאפשר יצירה ואפיון אמינים של תאי אנדותל צמיחת דם (BOECs) מנפח קטן של דם היקפי בוגר. BOECs יכולים לשמש כתחליף לתאי אנדותל מחולים עם הפרעות בכלי הדם וכמצע ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

גזע אבות היווצרות הדם תאים (HSPC) נובעים מתאי אנדותל מיוחדים (hemogenic) במהלך הפיתוח, עדיין מעט מאוד ידוע על התהליך שבו כמה תאי אנדותל לציין להפוך להרכיב דם. אנו מדגימים שיטה המבוססת זרימת cytometry המאפשרת בידוד סימולטני של תאי hemogenic האנדותל HSPC מרקמות עובריות בעכברים.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

ובתאי אנדותל (EPCs) מעורבים באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. שיטה זו מתארת ​​את הבידוד של EPCs אדם מדם היקפי, כמו גם זיהוי של פוטנציאל הנדידה שלהם נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב.

בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב

כאן, אנו מתארים את האקס vivo הרחבה של תאי גזע hematopoietic מ CD34+ תאים שמקורם דם טבורי מטופלים עם שילוב של ציטוקין קוקטיילים ו VPA. שיטה זו מובילה מידה רבה של ex-vivo הרחבת HSCs פרימיטיבית גם קליני או יישומים מעבדה.

Ex-Vivo הרחבה של תאי גזע Hematopoietic מן הטבור האדם הנגזרות דם CD34+ תאים באמצעות חומצה ולפרואית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

למדו לבודד תאי אנדותל פרוגניטורים מדם טבורי אנושי ללא מיון תאים. שיטה זו מאפשרת הנדסת רקמות כלי דם ומחקר ביומרקרים לסיכון קרדיווסקולרי.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

גלה סרטונים נוספים