הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

שלום, שמי הילגנברג. אני עובדת כאן באוניברסיטה בקליפורניה באירווין, במחלקה לאנטומיה, נוירוביולוגיה. היום אני הולך לדבר איתכם על האופן שבו אנו מכינים תרביות קליפת המוח מעכברים.

אלה הם עכברי יום לאחר הלידה שמהם אנו מכינים את הנוירונים האלה. ואנחנו בדרך כלל משתמשים בתרביות האלה לאלקטרופיזיולוגיה, לתכשירי חלבון או RNA. אנו משתמשים באותה תכשיר תרבית להדמיית סידן או הדמיית נתרן.

הדבר הנחמד בתרביות האלה הוא שזו התאמה של פרוטוקול הבנקאי, אבל אנחנו מגדלים את התרביות האלה בהיעדר תאי הזנה גליאליים, מה שהופך את זה להרבה יותר נוח והתרביות בדרך כלל עשירות יותר בתאי עצב מאשר בתאי גליה. אז בואו נתחיל ואני אראה לכם איך אנחנו מכינים את הנוירונים האלה. בסדר, עכשיו אנחנו בנקודה שבה אנחנו יכולים להסיר את המוח ולהתחיל לבצע את הדיסקציה בפועל.

אבל לפני שחשוב להזכיר שהכיסוי מחליק שאתה רוצה לצלחת את התאים הללו צריך להיות מצופה. ואנחנו נהגנו לעשות את זה, בדרך כלל עושים את זה לילה בטמפרטורת החדר בריכוז פוליליזין של 0.1 מיליגרם למיל. ולמחרת אנו באים ומסירים את הפוליליזין ושוטפים את החלקות הכיסוי שלוש פעמים ברציפות.

בהתאם ליישום, אתה משתמש בכלים גדולים או בכלים קטנים, או שאתה יכול להשתמש בהחלקות כיסוי זכוכית. בסדר, אז זה ההגדרה האופיינית למכסה המנוע והסברתי לך בקצרה אילו פתרונות אתה צריך להכין וגם אילו מכשירים שימושיים לבידוד של המוח, או לדיסקציה של המוח ואז לחתך בפועל של המוח. מה שיש לנו כאן הוא פתרון הדיסקציה הקר.

אז בדרך כלל זה, זה על קרח. יש לנו פורס Viber שאנחנו צריכים לחתוך את המוח. יש לי סירה שמכילה תמיסת ניתוח שהמוח מורכב עליה ואז פורס.

ויש לי כלים שונים שאני צריך כדי להסיר את המוח. יש לי צלחת מקדחה. זה 4% מקדחה שאני משתמש בה כדי להחזיק את המוח במקומו.

אנו זקוקים למזרק, כמה פילטרים סטריליים, צלחות נייר רוטמן, צלחות פטרי בגדלים שונים. וזה כלי הפגיעה בצינור העכבר שלי. משכתי כאן גם פיפטות זכוכית.

אלה נימי זכוכית שאני משתמש בהם ככלי ניתוח כמו גם כדי לאסוף את חלקי המוח ובעצם לחזור עליהם. אז תמיסת האנזים שלנו מכילה תמיסת דיסקציה. יש שם L ציסטאין כדי להפעיל את הפפאן, כמו גם 0.1 נתרן הידרוקסיד רגיל כדי לאזן את ה-pH.

ברגע שאתה מוסיף את הפפאן, התמיסה מעט אטומה והיא צריכה להתנקות לפני שנוכל להשתמש בה לעיכול אנזימטי של הרקמה. ועכשיו אנחנו בעצם מוכנים להתחיל את ההליך. הפיברו סלייסר הוכן מראש.

הכנסתי להב שחותך את המוח שלי וגם תקעתי את הכלי שמתחתיו שמכיל את המאגר ותומך במוח. ואני מוכן להתקין את בלוק ה-AGA על לוחית התמיכה שלי שיתמוך גם במוח. אז האגה הזו נרפאה, זה 4% אגה ואני פשוט אלך לחתוך ישר דרך אזור כזה.

ובצדדים פשוט לחתוך מקדחה מלבנית. ואז אני משתמש במרית ואני פשוט מוציא את החתיכה הזו מגוש המקדחה. ועכשיו אני הולך להדביק את המקדחה הזו על לוחית התמיכה שלי כשהצד השטוח של המקדחה פונה קדימה.

אז זו התמיכה שהמוח מודבק אליה ואז מוחזק במקומו על ידי המקדחה הזו. אז כשאנחנו עושים את החתך בצורה כזו, המוח לא זז אחורה. עכשיו אנחנו מוכנים להסיר את המוח.

בדרך כלל אנו משתמשים בעכבר P אפס או P אחד. בסדר, אז זה ראש העכבר ערוף הראש ואני פשוט הולך להסיר במהירות את הפסל. אני קודם כל הולך לחתוך את רצועת השרירים שנמצאת ממש כאן ובצד השני.

ואז אני נכנס עם המספריים שלי. ואני נזהר מאוד שהצד הפנימי של המספריים לא יפגע במוח. ואני חותך סביב הגולגולת משני הצדדים.

ועכשיו אנחנו יכולים פשוט להרים את הסחוס ואני הולך להשתמש ב-ULA הקטן שלי ואני מסיר את המוח ככה. אז המוח הזה נכנס לצלחת הפטרי שלי שמילאתי בתמיסת החתך ויש לו נייר פילטר ווטמן בתחתית. ומה שאני רוצה לעשות עכשיו זה לחתוך את בסיס המוח כך שיהיה לי אזור שטוח ומוצק להרכיב את המוח על הכתף שלי.

אז אני הולך לשים טיפה קטנה מאוד של משוגע על צלחת התמיכה שלי. אני הולך להרים את המוח שלי עכשיו עם המרית ואני משתמש במלקחיים הקימורים שלי כדי לעזור לי עם זה. ומה שאני רוצה לעשות זה בעצם לזרוק דם מהנוזל העודף שיש לי מתמיסת הדיסקציה ואני הולך להרכיב את המוח כנגד תמיכת המקדחה שלי.

עכשיו אנחנו מוכנים להעביר את המוח לאמבט החיץ. אז אני מוסיף תמיסת דיסקציה לכלי הקטן הזה ואני הולך להוסיף את התמיכה שמחזיקה את המוח. הוא מותקן כשהמוח פונה ללהב.

בסדר, אז המוח מותקן עכשיו ואני הולך להשתמש בפורס הפיברו ואני מנסה למצוא את ההתחלה של המוח, להזיז את המוח לכיוון הלהב. ופשוט חתכתי קצת מהריח. עכשיו אני מזיז את הלהב שלי כ-600 מיקרומטר למטה ואני עושה חתך נוסף, שאמור לעבור ישר דרך קליפת המוח.

הנה קליפת המוח עוברת והיא רוכבת על הלהב. ואני מזיז את הלהב שלי עוד 600 מיקרומטר למטה ואני חותך את החלק השני. חשוב שזה ייעשה באופן רציף ללא הפרעה ויפה וחלק.

וכאשר אתה מושך את הלהב, אתה עוצר את פורס הסיבים. עכשיו הולך להשתמש בצינור זכוכית שהשתמשתי בו בצורה הלא נכונה. אני למעשה משתמש בקצה האחורי ואני הולך להזיז את החלק הזה בקליפת המוח לכאן ולהעביר אותו לצלחת פטרי נקייה.

אני ממשיך דרך המוח, תמיד 600 מיקרומטר עד שאני אוסף בערך חמש עד שש פרוסות לעכבר P אפס או P אחד. ועד שאני מגיע לקצה קליפת המוח. ואנחנו מוכנים עכשיו לבודד את קליפת המוח משאר המוח.

בסדר, אז אני משתמש בפיפטות הזכוכית האלה שהן פיפטות זכוכית משוכות חדות כמו כלי ניתוח. ואני בדרך כלל מתחיל עם החלק הראשון שקיבלתי, שהוא הקטן ביותר והריח שאנחנו צריכים להסיר. ואני גם מנסה להסיר את קרומי המוח מההכנה הזו.

שוב, מסירים את חוש הריח של חתיכה זו, מקלפים, מקלפים אותה מקרומי המוח. לפעמים יש לך כלים שאתה לא יכול להפריד באותה קלות, אז פשוט תמשיך הלאה ותשאיר אותם מאחור את הכלים הטובים. אני תמיד מתקדם לכיוון קצה אחד ואני הולך לפלס את דרכי דרך קטע אחר חלק.

חשוב שתיפטרו מקרומי המוח וגם כשאתם מסתכלים על החלקים האלה, לפעמים אתם רוצים ללכת ולהפוך אותם כדי שתוכלו לראות טוב יותר היכן נמצאת מערכת הסיבים שמכילה את רוב התאים הלא עצביים שאתם לא באמת רוצים בתכשיר הזה. אוקיי, בחלק הזה אתה יכול לראות בבירור את מערכת הסיבים הזו מתחת לשכבה הקורטיקלית. אז אני דוקר בדיוק בין המקום שבו מסתיימת השכבה בקליפת המוח ואני מצביע על מערכת הסיבים שיש בה את רוב התאים העצביים הלא-עצביים שאנו מנסים להימנע מהם בתכשיר זה.

אז אני חותך לאורך הקו הזה, מנסה להשאיר את דרכי הסיבים מאחור. זה השלב שבו טוחנים את הרקמה לקוביות קטנות. בסדר, אני, אני מעקר את תמיסת האנזים שלי עכשיו דרך מסנן 0.2 מיקרון המחובר למזרק.

ואני מוסיף את זה ישר לחתיכות קליפת המוח שלי בדיוק ככה. וודאו שיש מספיק נוזלים שמקיפים את כל החלקים בקליפת המוח ואת החלקים הללו בקליפת המוח ואז היכנסו לאינקובטור של 37 מעלות למשך 30 דקות, מה שאמור לשחרר את הרקמה במידה ניכרת. אז עברו 30 דקות שהחתיכות האלה בקליפת המוח דגרו באינקובטור.

בינתיים, חיממתי קצת מדיה נוירו-בסיסית עם תוסף B 27 שהתאים האלה בסופו של דבר מגיעים אליו. הכנתי כאן גם כמה פתרונות. הראשון הוא פתרון הנתיחה.

אז זה פתרון פשוט לנתיחה לאחר מכן הם מועברים לתמיסה של מעכב טריפסין גבוה המכילה BSA כנבלות ו-PV כדי לחסום את רכיב הקולטן NMDA. ואז הם עוברים שלוש שטיפות של מעכב טריפסין נמוך BSA ו-A PV. אני הולך להסיר את החלקים האלה עכשיו מתמיסת הפרופאן ואני מעביר אותם לצינור חרוטי המכיל תמיסת דיסקציה DS.

גושים אלה פשוט ינועו כלפי מטה על ידי כוח הכבידה וייתכן שיחלפו דקה או שתיים עד שכולם יתייצבו בחלק החרוטי של הצינור. ואז אני פשוט אאסוף אותם שוב ואעביר אותם לתמיסה שמכילה את מעכב הטריפסין הגבוה. ושוב, אנו רוצים לחכות עד שהגושים הללו יתייצבו לתחתית הצינור.

יש עוד שטיפה אחת דרך תמיסה של מעכב טריפסין גבוה ואז הגושים האלה נשטפים במעכב טריפסין נמוך. לאחר השטיפה האחרונה שלי ומעכב האנזים הנמוך, אני הולך להעביר את התאים במדיה הנוירו-בזאלית הקדם-חמה שלי ואני מתחיל לפרק את התאים באופן מכני על ידי טרילוש שלהם למעלה ולמטה בנימי זכוכית עם גודל קדח יורד. אני הולך לטפל בתאים עכשיו והרקמה מתגבשת.

אבל לפני שאעשה זאת, אסיר את כל הפסולת שנראית כאן. יש למשל חלבון ודנ"א שדולפים החוצה מהתאים שיוצרים את כדור הצמר גפן הזה, כמו דברים שתלויים על גושי הרקמה. אתה רוצה להסיר את זה קודם כי זה סותם את קצה הפיפט שלך ואתה מכריח את הרקמה לעבור דרך שני קוטר קטנים יותר.

ואז אני הולך לשבור כמה מנימי הזכוכית האלה כדי לקבל את הפתח בגודל הנכון כדי להזיז את התאים שלי פנימה והחוצה מהפתח. זהו פיפט טוב. זה אתה יכול לראות שהוא נחמד ועגול ואין לו קצוות חדים.

אני הולך לתקוע את זה בחובט צינור העכבר שלי. יש מסנן של 0.2 מיקרון בין לבין ואני הולך עכשיו להעביר את הרקמות פנימה והחוצה מנימי הזכוכית שלי. אז התהליך הראשון אמור לעבור בצורה חלקה למדי מכיוון שגושי הרקמה אינם גדולים בהרבה מפתח הפיפט.

כל מה שאתה רוצה לעשות זה לשחרר את הרקמה. ואז אני נכנס עם קצה פיפטה קצת יותר קטן. הייתי רוצה שיהיה לי קצה פיפטה עגול ונקי.

זה נראה טוב. ושוב, כל הגושים נכנסים ויוצאים מהצינור בבת אחת. אז הרקמה עכשיו מאוד רכה ומשוחררת שאם אתה משהה את הגושים האלה במדיה, התאים בעצם ייפלו.

עכשיו אני הולך להעביר את כל התאים המנותקים שלי לתוך צינור חרוטי טרי של 15 מיל מיליליטר, ואני מקרר אותם אולי עוד פעמיים או שלוש, בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק תאים שעדיין נמצאים בגושים הגדולים האלה. ואז אנחנו רוצים לחכות דקה או שתיים עד שהחתיכות הגדולות שעדיין נמצאות שם יתייצבו. כמו כן, ייתכן שיש לך חתיכות זכוכית מנימי הזכוכית שלך ששברת שאמורות להתיישב על התחתית.

ואז אנחנו יכולים להשתמש בכמויות של זה כדי לצלחת על פתקי כיסוי או כלים מצופים במלואם. ואני מצפה 80 מיקרוליטר על תלוש כיסוי הזכוכית הזה שצופה בעבר בפוליליזין וזה יוצר בועה נחמדה. התאים בסופו של דבר ישקעו וייצמדו להחלקת כיסוי הזכוכית.

אז אחרי כשעה, התאים התייצבו ואני הולך להוסיף בעדינות רבה הולך להוסיף עוד קצת מדיה לכל המנה. יכול לתת לזה מערבולת עדינה ככה. ואז התאים האלה נכנסים לאינקובטור ב-37 מעלות ומחר אני מאכיל אותם במדיה מותנית.

אבל בסדר, אלה הם התאים בקליפת המוח. הם רק בני קצת פחות מיום אחד. הם הוצגו אתמול ואתם יכולים לראות שיש הרבה נוירונים, לכולם יש הרבה נוירונים בריאות, ויש שם גם כמה פסולת תאים.

אלה התאים שלא הצליחו. ואלה יישטפו בשתי ההאכלות הבאות. התאים המתים הם התאים העגולים הקטנים מאוד עם הממברנות הפרועות.

זה עתה הראיתי לכם כיצד להכין את תרבויות קליפת המוח המנותקות הללו. חשוב לזכור שכאשר אתה מסיר את הקליפה הקורטיקלית מפרוסות המוח, אתה מפריד אותן ממעבר הסיבים בקליפת המוח של האגודל מכיוון שהוא מכיל הרבה תאים שאינם עצביים. כמו כן, כשאתה אוצר התאים לא נגמרים מכיוון שזה בעצם הורג את רוב התאים המבודדים שיצרת עד עכשיו.

אז לכו בקלות על פרוסות הטישו ותהיה לכם תרבית יפה. בהצלחה בניסויים שלך.