Фундаментальные исследования в медицине плазмы - пропускная способность подход от жидкости для клеток

Общая цель этих многолуночных последовательных анализов состоит в том, чтобы лучше понять влияние холодной физической плазмы на окислители, на биологические реакции in vitro, используя оптическую эмиссионную спектроскопию, анализ жидкостей, а также клеточную активность, микроскопию и проточную цитометрию. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области плазменной медицины, особенно в отношении производных из плазмы директивных веществ, важных для индукции иммуногенной гибели раковых клеток. Основным преимуществом этой методики является ее полуавтоматизированный подход.

В нем используется 96 луночных планшетов, что позволяет увеличить скорость и производительность исследований. Применение этого метода распространяется и на будущие методы плазменной терапии, такие как дерматология или онкология. Кроме того, они предоставляют средства для идентификации директивных веществ, полученных из плазмы, которые имеют отношение к биологическим реакциям.

Демонстрировать процедуру будет Феликс Нисснер, техник из нашей лаборатории. Для мониторинга видов плазмы расположите атмосферную плазменную струю перед оптическим эмиссионным спектрофотометром, перпендикулярно оси шлейфа, и используйте специальное программное обеспечение для записи фотоизлучения и длины волны каждого состояния газа при двух стандартных литрах в минуту потока сырьевого газа. Для анализа супероксидов, обработанных плазмой, составьте окончательный протокол для таблицы XYZ с соответствующими временами обработки и расположением скважин.

Затем добавьте 100 микролитров свежеприготовленной мастер-смеси в лунки прозрачной 96-луночной пластины с плоским дном в трех экземплярах и используйте считыватель микропланшетов, чтобы измерить поглощение на 550 нанометрах. Чтобы проанализировать влияние плазменной обработки на метаболические реакции клеток, в ламинарном проточном колпаке засейте от одного до 10 до четырех представляющих интерес клеток в 100 микролитрах полностью дополненной среды для клеточных культур в лунке с плоским дном в 96-луночном планшете и инкубируйте в течение ночи. После ночного культивирования в инкубаторе для клеточных культур используйте стол XYZ для обработки лунок только плазмой или газом, согласно экспериментальному анализу, и верните клетки в инкубатор еще на 20 часов.

В конце второй инкубации добавьте 25 микролитров свежей питательной среды для клеточных культур, дополненную 500 микромолярным Резазурином, в клетки, а также в три фоновые контрольные лунки, содержащие только Резазурин. Верните клетки в инкубатор, для трехчасовой инкубации. Затем измерьте флуоресценцию в считывателе микропланшетов.

Для визуализации клеток, обработанных плазмой, после считывания флуоресценции замените надосадочную жидкость 100 микролитрами свежей среды для культивирования клеток с добавлением одного микрограмма на миллилитр йодида пропидия. Поместите пластину на моторизованный предметный столик для микроскопа и выберите объектив с 20-кратным увеличением для получения изображения клеток. Затем используйте соответствующее программное обеспечение для количественного анализа изображений, чтобы определить общую цитозольную площадь на цифровых фазово-контрастных изображениях всех полей зрения, визуализированных в каждой лунке.

Для проточного цитометрического анализа клеток, обработанных плазмой, после визуализации промывают клетки в каждой лунке два раза 200 микролитрами PBS, дополненными кальцием и магнием на промывку, с последующей маркировкой, 15 анаграммами на миллилитр моноклонального антитела против мышиного калретикулина, в 50 микролитрах PBS, плюс кальций и магний на лунку. Через 15 минут в инкубаторе для клеточных культур промойте клетки два раза 200 микролитрами полной среды для клеточных культур и добавьте по 100 микролитров раствора для отслоения клеток в каждую лунку на 20 минут, при температуре 37 градусов Цельсия. Когда клетки отделятся, загрузите планшет на проточный цитометр и получите минимум 1000 событий в популяции прямого и бокового рассеяния, обычно связанных с жизнеспособными клетками.

Затем используйте соответствующее программное обеспечение для анализа проточной цитометрии для определения интересующей популяции и определения средней интенсивности флуоресценции экспрессии кальретикулина. Оптическая эмиссионная спектроскопия может быть использована для отслеживания отчетливых пиков, связанных с реактивными компонентами плазмы в различных условиях поступающего газа. При плазменной обработке жидкостей сначала определяется испарение, вызванное газообразным аргоном и аргоновой плазмой, при этом условия дают различные результаты испарения, так как плазма также оказывает влияние на температуру.

Подобно результатам оптической эмиссионной спектроскопии для гидроксильных радикалов, осаждение перекиси водорода значительно уменьшается при примеси кислорода или азота, но увеличивается при увлажнении исходного газа. Кроме того, добавление азота в исходный газ приводит к значительно более высоким концентрациям нитратов по сравнению с жидкостями, обработанными аргоном. Большая часть супероксида образуется в условиях сухого газообразного аргона, при этом добавки кислорода и/или азота значительно подавляют образование супероксида, за исключением присутствия увлажненной аргонокислородной плазмы.

Интенсивность флуоресценции резазурина и клеток, обработанных плазмой, аналогична визуально наблюдаемым физическим изменениям надосадочной жидкости клеточных культур, что подтверждает цитотоксические эффекты длительного лечения плазмой. Уменьшение общей площади клеток также наблюдается в лунках для плазменной обработки, особенно в условиях увлажненного сырьевого газа, с общей регуляцией окрашивания кальретикулина на клетках меланомы мирены в ответ на более короткие экспозиции плазменной обработки. При правильном выполнении митоплексные клеточные анализы и считывание могут быть завершены всего за несколько часов.

После этой процедуры могут быть выполнены и другие методы, такие как совместное культивирование с иммунными клетками или анализ надосадочной жидкости клеточной культуры. Это помогает ответить на дополнительные вопросы о высвобождении дам, клиентов цито или белков редукса, а также об иммунном распознавании клеток меланомы, обработанных плазмой. После своего развития этот метод проложил путь к дальнейшим исследованиям циклов меланомы, например, с помощью 3D-сфероидов опухолей.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить фундаментальные исследования в области плазменной медицины, начиная с газовой фазы плазмы, реактивных молекул и жидкостей и заканчивая биологическими реакциями в клетках меланомы.