食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

食品媒介性病原体は、世界中の公衆衛生問題の大部分を占めており、人間の死亡率と罹患率に大きな影響を与えています。従来の食品媒介病原体検出法では、サンプルの取り扱いが複雑で、時間がかかります。最近、バイオセンサーは、迅速な検出と実用性の利点を備えた有望で包括的な検出方法であることが証明されています。

バイオセンサーの開発は、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子を用いた改質電極をベースとしています。スクリーン印刷されたカーボン電極は、作用電極の有効表面積を増加させるために変更されました。酸化還元錯体として使用されるメチレンブルーは、固定化プローブDNAの一本鎖DNAと強い結合を持っています。

この高い親和性の関係は、高いピーク電流で表されます。一本鎖DNAとその相補的な配列とのハイブリダイゼーションは、結合したメチレンブルー分子を置き換え、差動パルスボルタンメトリーの電流を減少させます。これは、相補的な二本鎖DNAを持つ改質電極の表面に集まったメチレンブルーの量が少なかったためであり、グアニン塩基間の到達不能な相互作用によって引き起こされた可能性があります。

調製した溶液の色は、黄色から黒っぽい色、最後に濃いルビー色に変わります。これは、金塩がクエン酸イオンによって還元されたことを示しています。溶解したポリ乳酸を予め調製した金ナノ粒子溶液と混合し、次いで室温で均一に攪拌し、これをポリ乳酸安定化金ナノ粒子と示した。

紫外可視分光法、X線回折法、透過型電子顕微鏡法、およびエネルギー分散型X線分光法を用いた電界放出走査電子顕微鏡法を用いて、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の特性評価を行った。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の均質溶液の約25マイクロリットルをスクリーン印刷されたカーボン電極上に迅速にピペットで移動し、使用前に24時間風乾した。次に、改変した電極をフェロシアン化カリウムで電気化学的に特性評価し、活性表面積、電気化学インピーダンス分光法、再現性、再現性、および安定性を測定しました。

固定化条件の最適化は、0.2〜1.4マイクロモルの範囲の一本鎖DNAの濃度、30〜220分の時間、および摂氏25〜75度の温度範囲の3つの要素を使用して決定しました。一方、ハイブリダイゼーション条件の最適化は、5分から35分の時間と25°Cから75°Cの2つの要素によって決定された。次いで、処理した改質電極を20マイクロモルのメチレンブルーに30分間浸漬した。

非特異的に吸収されたDNAと過剰なメチレンブルーは、生理食塩水アセテート緩衝液pH 4.5で洗浄することにより除去され、次いで脱イオン水ですすいだ。メチレンブルーリダクションのピーク電流は、差動パルスボルタンメトリー技術を使用して測定されました。差動パルスボルタンメトリー測定は、インジケーターを含まないリン酸緩衝生理食塩水pH7.0を使用して実行されました。

同様の手順がすべてのインタラクションに対して実施されました。参照株としての腸炎ビブリオと、他の8つの細菌株、すなわちカンピロバクタージェジュニ、リステリアモノサイトゲネス、ネチフス菌、サルモネラ腸炎、肺桿菌、大腸菌O157:H7、セレウス菌、および一般的な食品媒介病原体のアルギノリチクス菌が、この研究の電気化学的DNAバイオセンサーの検証に使用されました。それぞれの寒天上での細菌株の定期的な継代培養を、生存率を維持するために2週間ごとに実施しました。

パラヘモリチクスビブリオ細胞の量は、スプレッドプレート法を用いて決定した。1ミリメートルの細菌細胞培養物を、3%塩化ナトリウムを含有する9ミリメートルのトリプチカーゼ大豆ブロスに移し、希釈係数10を得た。次に、希釈係数10〜10倍から希釈係数10倍までの1回までの各希釈係数0.1ミリリットルを、コロニーカウント用のCHROMagar Vibrioのプレート上にそれぞれ広げた。

ザルガイは生鮮市場から入手し、分析のために氷冷器ボックスですぐに実験室に持ち込まれました。ザルガイは、収穫の開始から市場での冷蔵保管まで一様に収穫されたと仮定して、処理されたグループと未処理のグループの2つのグループに分けられました。処理群のザルガイは、マイナス20°Cで24時間保存し、続いてDNA抽出の4時間前に20°Cの紫外線に曝露することにより前処理しました。

対照群に使用された氷点下温度と紫外線曝露は、それを殺すか、少なくともザルガイに自然に蓄積する食品媒介病原体を制限すると予想されました。摂氏70度のより高い低温殺菌体制は適用されませんでした、なぜならこの研究の制御された条件の目的は新鮮なザルガイの実際の状況を模倣することだったからです。一方、未処理のグループからのサンプルは、実験室に到着するとすぐに、前処理なしで直接分析されました。

ザルガイを蒸留水で洗浄し、汚れをこすり落とした後、滅菌鉗子と層流キャビネットを使用して殻から組織を除去しました。約10グラムのザルガイ組織サンプルを、ホモジナイザーでホモジナイザーを使用して、3%塩化ナトリウムを含む19ミリリットルの滅菌トリプチカーゼ大豆ブロスで60秒間ホモジナイザーしました。次に、既知量の食品媒介病原体を、スパイクしたサンプルの均質化サンプルブロスの9ミリメートルに添加しました。

スパイクされていないサンプルをネガティブコントロールとして使用しました。約1ミリリットルのサンプルをエッペンドルフのチューブにピペットで入れ、DNAサンプルを抽出し、バイオセンサーとポリメラーゼ連鎖反応アッセイに使用しました。次いで、食品媒介性病原体のゲノムDNAを、スパイクしたサンプルとスパイクしていないサンプルから抽出した。

ゲノムDNAは、修正された煮沸溶解手順に従って抽出されました。ゲノムDNAを毎分12,000回転で4°Cで3分間遠心分離して透明な懸濁液を取得し、上清をさらなる使用のために摂氏マイナス20°Cに保った。バイオフォトメーターを使用して、抽出されたゲノムDNAの濃度と純度を決定しました。

次に、すべての株の同一性を標準的な生化学的アッセイを使用して決定し、16のSR RNA遺伝子シーケンシングによって検証しました。最後に、ゲノムDNAを摂氏92度で2分間変性させ、氷水で急速に冷却してからバイオセンサーを塗布しました。さらに、食品媒介性病原体の同定は、それぞれの遺伝子を標的としたポリメラーゼ連鎖反応を用いて行いました。

増幅された生成物とそのサイズは、1.5%アガロースゲル上で電気泳動することによって決定されました。ゲル画像は、ゲルドキュメンテーションシステムを使用して取得しました。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の生成は、表面プラズマの成長と共鳴ピークが約540ナノメートルに確立された紫外可視スペクトルから確認されました。

ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の形成および存在は、粒子サイズに応じて、500〜600ナノメートルの波長範囲で示された。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の全ての結晶子ピークが、31.7度、38.2度、44.4度、64.7度、77.7度の2つの劇場で観察された。また、31.7度でより広範な回折ピークが入るにつれて、結晶子のピーク強度も増加し、冷たいナノ粒子がポリ乳酸に埋め込まれていることを意味し、多相性の金ナノ構造の形成を示唆しています。

透過型電子顕微鏡の粒子分布曲線とポリ乳酸安定化金ナノ粒子の画像から、金ナノ粒子はほぼ球形をしていることが分かりました。ナノ粒子のサイズは約37ナノメートルの範囲にあり、これはシェラーの公式から得られるものよりもわずかに大きく、合成されたナノ粒子の多結晶性を示唆しています。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の主なサイズは、100ブラッグ反射の幅を決定することにより、シェラーの方程式を使用して計算されました。

この表から、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の結晶子サイズは27ナノメートルと計算されました。電界放出走査型電子顕微鏡画像とエネルギー分散型X線スペクトルから、改質スクリーン印刷された炭素電極は、金の重量比が最も高く、密度が最大で、ナノ粒子被覆の構造が最大でした。エネルギー分散型X線スペクトルにより、生成されたポリ乳酸安定化金ナノ粒子は金のみで構成され、炭素と酸素に対応するピーク以外の元素は示さなかったことが確認されました。

陽極と陰極のピーク電位は、異なるスキャン速度で一貫しており、電気化学反応がピーク分離に基づいて可逆的であったことが示唆されています。改質電極の有効表面積は、裸電極と改質電極でそれぞれ0.26cm二乗、改変電極で0.41cm二乗と算出した。この結果から、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子が活性表面積上で得られる改善は、裸電極と比較して相対的に高いことが確認されました。

裸電極の電荷移動抵抗の値は1, 932オームでしたが、変更された電極は1, 444オームに減少しました。改質電極における電荷移動抵抗値の減少は、局所的な誘電率の低下および/または電気二重層の厚さの増加に起因する可能性があり、フェロシアン化カリウムが金属または溶液界面での吸収によって機能したことを示唆しています。ピーク電流は、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子を用いた裸電極の改質に伴って徐々に増加し、より高い感度が低い電荷移動抵抗の逆であることを示した。

改変電極の相対標準偏差は4.26%と導出されましたポリ乳酸安定化金ナノ粒子修飾を有する電極は、いくつかの測定後により良い相対標準偏差を与えました。改質電極の相対標準偏差値は4.05%であり、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の電極製造の再現性が優れていることを示しています。DNAの最適な濃度は1.2マイクロモルの一本鎖DNAでした。

一本鎖DNAの最適な固定化時間は180分と選択した。一本鎖DNAの最適な固定化温度は、摂氏55度として選択されました。二本鎖DNAの最適なハイブリダイゼーション時間は10分と選択した。

二本鎖DNAの最適なハイブリダイゼーション温度は、摂氏35度として選択されました。相補的DNAは、プローブしたDNA、非相補的DNA、3塩基不一致DNA、および1塩基不一致DNAの中で0.73マイクロアンペアという最も低いピーク電流を示しました。標的とされたDNAからの高電流が、オリゴヌクレオチドの他の配列の電流よりも小さいことは明らかです。

この結果から、バイオセンサーを用いて高い感度と特異性で識別できることが示されました。構築したDNAバイオセンサーは、改変電極表面に固定化されたプローブDNAによるハイブリダイゼーション検出の選択性を有していた。修飾電極上のメチレンブルーの微分パルスボルタンメトリーピーク電流の連続的な減少は、相補的DNAの濃度の増加の結果として引き起こされました。

0.2ピコモルから0.02ミリモルまでのさまざまなターゲットDNA濃度の対数とメチレンブルー還元ピーク電流の対数との間の線形相関は、0.96の線形回帰係数で示されています。作製したDNAバイオセンサーの回収率は、6ヶ月間の保管後、初期信号の80%以上までゆっくりと減少し、改変電極表面の一本鎖DNAのプローブが非常に安定していることを示しています。摂氏45度未満の温度での良好な長期安定性が、ポリ乳酸安定化金ナノ粒子と一本鎖DNAとの間の強い反応の理由である可能性があります。

9種類の細菌(Bacillus cereus、Listeria monocytogenes、Campylobacter jejuni、Escherichia coli、Vibrio alginolyticus、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritis、Klebsiella pneumoniae、Vibrio parahaemolyticus)のポリメラーゼ連鎖反応増幅産物をスクリーニングしました。交差反応性評価後に得られた差動パルスボルタンメトリーピーク電流は、他の細菌種と比較して、腸炎ビブリオが非常に明確に検出されていることを示しています。塩基対の数を減らすと、観測される差動パルスボルタンメトリー信号が増加することがわかります。

これは、プローブまでのメチレンブルー分子の量が多いことに関係しています。ポリメラーゼ連鎖反応解析から、レーン 7、8、9、10、11、および 12 で示されているように、処理したスパイクサンプルと未処理のスパイクサンプルの両方で腸炎ビブリオが見つかりました。一方、レーン 1、2、3、4、5、および 6 で処理された未処理のスパイクされていないサンプルには、腸炎ビブリオは含まれていませんでした。

開発したDNAバイオセンサーを用いた検出結果により、スパイクサンプルと非スパイクサンプルからなる治療群における腸炎ビブリオの存在を成功裏に決定しました。これらの結果は、前述のポリメラーゼ連鎖反応の結果と正の相関があります。ポリ乳酸安定化金ナノ粒子の応用は、さらなる製造感覚のための修正剤としての応用に大きな可能性を秘めています。

酸化還元複合体が非ハイブリダイズ生体認識分子とより強く結合すると、高い選択性が達成される可能性があり、これはフォローアップする価値のあるイノベーションである可能性があります。