הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

המטרה הכוללת של מערכת ביטוי חלבון זו הנגרמת על ידי הלם חום היא להעריך פעילות אנטי-אפופטוטית של חלבון בשני חלבונים בעלי פוטנציאל אנטגוניסטי מבחינה תפקודית בתאי חרקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התפקודים והפעילויות של חלבונים מועמדים בביוטכנולוגיה ובפרוטאומיקה, כגון הפעילויות האנטי-אפופטוטיות שלהם ואינטראקציות חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתזמון ביטוי הגנים נשלט על ידי אינדוקציה של הלם חום.

כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי המצב התפקודי של החלבון. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות, כגון ביטוי חלבון יונקים. תאי החרקים Spodoptera frugiperda, או Sf9, המשמשים בפרוטוקול זה גדלים במדיום תרבית תאים בצלוחיות תרבית תאים של 25 סנטימטר רבוע בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.

לנער את בקבוק תרבית התאים כדי לנתק את התאים מהבקבוק. לאחר מכן בדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שכ-80% מהתאים מנותקים. העבירו 50% מתרחיף התא לבקבוק תרבית תאים חדש בגודל 25 סנטימטר רבוע, ואפשרו לתאים להיצמד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר 15 דקות, החליפו את המדיום בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי, וגדילו בחממה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. בהתאם לצמיחת התאים, יש לעבור את התאים כל יומיים-שלושה. לפני קצירת תאי Sf9, חשוב לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ האור כדי לוודא שאין זיהום על ידי חיידקים או מיקרואורגניזמים אחרים.

כדי לקצור את תאי Sf9, יש לנער את בקבוק התרבית כדי לנתק את התאים, ולאחר מכן להעביר את תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר. בעזרת פיפטה P10, העבירו 10 מיקרוליטר של תרחיף התא להמציטומטר, וספרו את מספר התא תחת מיקרוסקופ האור. צלחת שלוש פעמים 10 עד חמישית תאים לכל באר של צלחת 24 בארות, והשאירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר 15 דקות, החלף את המדיום ב 0.5 מיליליטר מדיום ציפוי. הכן את עוצר העברת התאים. עבור כל טרנספקציה, יש לדלל שמונה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה של תאים עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים נטול סרום, ומערבולת למשך שנייה אחת לערבוב.

במחקר זה, שלושה קטעים שונים של הגן הבקולו-ויראלי, מעכב אפופטוזיס 3, או IAP3, יבואו לידי ביטוי תחת בקרה של מקדם הלם חום דרוזופילה 70, IAP3 באורך מלא, חיתוך חסר תחום RING וקטיעה חסר תחום BIR. הוסף שני מיקרוגרם מכל DNA פלסמיד ל-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים נטול סרום, וערבב על ידי מערבולת למשך שנייה אחת. הכן גם בקרה חיובית.

שלב את ה-DNA של הפלסמיד המדולל ואת מגיב העברת התאים המדולל, וערבב על ידי מערבולת. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בעזרת פיפטה P1000, הוסף 210 מיקרוליטר מכל תערובת ריאגנט טרנספקציה של DNA טיפה על התאים.

דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות, החלף את מדיום הציפוי ב -0.5 מיליליטר של מדיום תרבית תאים, ואז אטום את צלחת 24 הבארות בסרט. דגירה ב-28 מעלות.

למחרת, הלם חום כדי לגרום לביטוי חלבון על ידי הצפת הצלחת באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, החזירו את צלחת 24 הבארות לחממה של 28 מעלות צלזיוס. ביטוי החלבון מאושר לאחר מכן על ידי כתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדי לבחון אפופטוזיס של תאים המושרה על ידי גנים, הכינו תחילה תאי Sf9 כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, העבירו את התאים באותו אופן כמו קודם, אך כללו מיקרוגרם אחד של פלסמיד המכיל גן משרה אפופטוזיס בכל תגובת טרנספקציה. דוגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות, מחליפים את המדיום ודוגרים למשך 16 שעות.

הלם חום את התאים המועברים ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות לפני ביצוע בדיקת כדאיות התא. עבור אפופטוזיס תאים המושרה על ידי כימיקלים, צלחת אחת כפול 10 עד ששת תאי Sf9 לכל באר של צלחת של שש בארות.

השאירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ואז החליפו את המדיום במיליליטר אחד של מדיום ציפוי. העבירו את התאים עם ארבעה מיקרוגרם מכל DNA פלסמיד. לאחר חמש שעות, החלף את מדיום הציפוי במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים, ודגר את התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

ואז הלם חום ב-42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות לאחר הלם חום. לאחר מכן טפל בתאים שעברו טרנספטציה עם אקטינומיצין D כדי לגרום לאפופטוזיס.

דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפני ביצוע בדיקת כדאיות התא. התחל הליך זה על ידי שטיפת התאים המטופלים. מוציאים את המדיום מכל באר, מוסיפים מיליליטר PBS ומשאירים למשך דקה.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS בצורה זו. השעו מחדש את התאים בכל באר עם מיליליטר אחד של PBS המכיל 04% טריפן כחול, והכתים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. העבירו את מתלה התא לצינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר.

העבירו 10 מיקרוליטר מתרחיף התאים המוכתמים בכחול טריפן להמציטומטר, וספרו את התאים השלמים הקיימים תחת מיקרוסקופ אור. לבסוף, בצע ניתוח סטטיסטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. האורך המלא ושני הקטעים של IAP3 מ-Lymantria xylina MNPV התבטאו יתר על המידה בתאי Sf9, וכתם מערבי בוצע על ליזטים של תאים כדי לאשר את ביטוי החלבון.

החלבון האנטי-אפופטוטי Ac-P35 נכלל כביקורת חיובית. ניתן היה לזהות את כל החלבונים בתאים שעברו טרנספטציה שעה או חמש שעות לאחר הלם חום, עם ביטוי גבוה יותר לאחר חמש שעות. ניתן להתאים מערכת זו להערכת פעילות אנטי-אפופטוטית.

עבור אפופטוזיס תאים המושרה על ידי גנים, משרה האפופטוזיס Drosophila Reaper הועבר במשותף עם מבני פלסמיד של גן המטרה לתאי Sf9, אשר לאחר מכן עברו הלם חום כדי להפעיל ביטוי גנים. בהשוואה לווקטור Drosophila Reaper, הבקרה החיובית הראתה פעילות אנטי-אפופטוטית גבוהה, שהגיעה עד 80% משיעור הכדאיות. המבנים האחרים הראו השפעות שונות על פעילות אנטי-אפופטוטית.

עבור אפופטוזיס תאים המושרה על ידי כימיקלים, רק מבנה אחד הועבר לתאי Sf9, ואקטינומיצין D נוסף חמש שעות לאחר הלם חום. בהשוואה לבקרה החיובית או לביקורת השלילית, המבנים האחרים הראו השפעות שונות על פעילות אנטי-אפופטוטית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים-שלושה אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לציית לכללי הפעולה של תרבית תאים בזרימה למינרית ולבדוק את מצב התאים בשקדנות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קו-אימונו-משקעים, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו האם יש אינטראקציה כלשהי בין שני החלבונים המתבטאים יחד בתאי החרקים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביוטכנולוגיה לחקור תפקודי חלבונים בבעלי חיים או במיקרואורגניזמים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכת זו כדי לבטא חלבון זר או להעריך חלבונים שעלולים להיות אנטגוניסטיים מבחינה תפקודית בתאי חרקים. אל תשכח שעבודה עם כימיקלים מסוימים, כמו אקטינומיצין D, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.