Dialisi: separazione basata sulla diffusione
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Vue d'ensemble
La dialisi è una tecnica comune utilizzata in biochimica per separare le molecole in base alla diffusione. In questa procedura, una membrana semipermeabile consente il movimento di determinate molecole in base alle dimensioni. Questo metodo può essere applicato alla rimozione del tampone, noto come desalazione, o allo scambio di molecole tampone o ioni da una soluzione proteica.
Questo video copre i principi della dialisi insieme a una procedura generale. Vengono esaminate diverse applicazioni della dialisi, tra cui la rimozione dei reagenti gradienti dopo ultracentrifugazione, la rimozione del detergente dopo un’estrazione di proteine di membrana e la ricostituzione delle proteine modificando l’ambiente della soluzione.
I campioni biochimici hanno in genere alte concentrazioni tampone che possono interrompere l’elaborazione e l’analisi a valle. La dialisi è una tecnica comune ed economica utilizzata per separare le molecole in base alla diffusione. Il metodo utilizza una membrana semipermeabile che consente il movimento di determinati componenti, in base alle dimensioni. Questo video mostrerà i concetti di dialisi, una procedura generale e alcuni dei suoi usi in biochimica.
L’aspetto più importante della dialisi è una membrana semipermeabile, che ha pori che impongono un taglio di peso molecolare, consentendo il passaggio di molecole al di sotto di una certa dimensione. Ad esempio, una membrana 10k generalmente trattiene molecole più grandi di 10 kilodalton. Tuttavia, il taglio del peso molecolare non è un confine discreto o preciso. La membrana contiene tipicamente una vasta gamma di dimensioni dei pori, quindi una piccola frazione di molecole vicino al cutoff può essere persa.
Poiché il taglio del peso molecolare è definito utilizzando proteine globulari, molecole lineari di massa simile, come DNA o RNA, possono scivolare attraverso. Le membrane sono tipicamente scelte da mezzo a un terzo del peso molecolare della molecola desiderata.
Per eseguire la procedura, un campione viene inserito nella membrana, che a sua volta viene aggiunto a un grande volume di soluzione, chiamato dialisi. Nel corso del tempo, le molecole più piccole si diffonderanno liberamente attraverso la membrana tra il campione e il dialisato, mentre le biomolecole più grandi sono tenute all’interno. La dialisi è un processo lento. È comune consentirne l’esecuzione durante la notte o anche per più giorni.
Se il dialisato è acqua pura, la concentrazione complessiva del tampone diminuirà, un processo noto come dissalato. Se la soluzione contiene altre piccole particelle, alcune si sposteranno nel campione, portando allo scambio di buffer. Poiché la dialisi è un processo di equilibrio, il dialisiato può essere aggiornato più volte per spostare ulteriormente piccole molecole. Una volta completato il processo, il campione viene nuovamente raccolto per un’ulteriore elaborazione.
Ora che hai visto le basi della dialisi, diamo un’occhiata a una procedura generale.
Prima di iniziare la procedura, la membrana viene presata in dialisi. Questo lo rende più facile da usare e rimuove eventuali conservanti. Una volta pronto, il campione viene raccolto, in genere con una siringa e quindi aggiunto al contenitore per dialisi. Questo può essere un tubo nudo o contenuto all’interno di una cassetta. L’aria in eccesso viene rimossa dalla configurazione di dialisi per massimizzare la superficie del campione con la membrana. L’impostazione viene quindi posizionata nel dialisi con agitazione per massimizzare la diffusione. Dovrebbe galleggiare per non inibire l’agitazione.
Il dialisi viene modificato a intervalli rilevanti al raggiungimento dell’equilibrio tra campione e dialisi. Dopo l’ultimo cambiamento, la reazione viene in genere lasciata correre durante la notte. Dopo un periodo di tempo sufficiente, il campione privo di buffer o scambiato viene rimosso dalla cassetta. Una volta raccolto, il campione può essere analizzato o ulteriormente elaborato, a seconda della natura dell’esperimento.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di dialisi generale, vediamo alcuni dei modi in cui questa tecnica viene utilizzata in biochimica.
I gradienti di densità sono un modo comune per separare campioni biologici complessi. Questo concetto si basa sulla distribuzione su piccole particelle, tipicamente ioni saccarosio o cloruro di cesio. Una volta completati, questi reagenti in genere devono essere rimossi prima che il campione raccolto possa essere elaborato. La dialisi consente di utilizzare il campione purificato per analisi future.
Alcune proteine si trovano all’interno del doppio strato lipidico di una cellula e di solito sono studiate intervallandole in vescicole lipidiche sferiche note come liposomi. Le proteine e i lipidi vengono prima estratti con un detergente. La dialisi può essere utilizzata per rimuovere lentamente il detergente, formando proteolipolismi.
Dopo la purificazione, alcune proteine vengono mal ripiegate o denaturate, portando a una perdita di funzionalità. I composti che causano questi cambiamenti nella struttura possono essere rimossi con la dialisi, portando alla riforma degli analiti funzionanti.
Hai appena visto il video di JoVE sulla dialisi. Ora dovresti capire questo metodo basato sulla diffusione, una semplice procedura sperimentale e l’uso di questa tecnica.
Grazie per l’attenzione!
Procédure
Divulgations
Transcription
Biochemical samples typically have high buffer concentrations that can disrupt downstream processing and analysis. Dialysis is a common, inexpensive technique used to separate molecules based on diffusion. The method utilizes a semi-permeable membrane that allows the movement of certain components, based on size. This video will show the concepts of dialysis, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
The most important aspect of dialysis is a semi-permeable membrane, which has pores that impose a molecular weight cut-off, allowing molecules below a certain size to pass through. For example, a 10k membrane will generally retain molecules larger than 10 kilodaltons. However, the molecular weight cutoff is not a discrete or precise boundary. The membrane typically contains a broad range of pore sizes, so a small fraction of molecules near the cutoff may be lost.
Since the molecular weight cutoff is defined using globular proteins, linear molecules of similar mass, like DNA or RNA, may slip through. Membranes are typically chosen one half to one third the molecular weight of the desired molecule.
To perform the procedure, a sample is placed into the membrane, which is in turn added to a large volume of solution, called the dialysate. Over time, smaller molecules will diffuse freely across the membrane between the sample and the dialysate, while the larger biomolecules are held within. Dialysis is a slow process. It is common to allow it to run overnight, or even across multiple days.
If the dialysate is pure water, the overall buffer concentration will decrease, a process known as desalting. If the solution contains other small particles, some will move into the sample, leading to buffer exchange. Because dialysis is an equilibrium process, the dialysate can be refreshed multiple times to further displace small molecules. Once the process is complete the sample is re-collected for further processing.
Now that you’ve seen the basics of dialysis, let’s take a look at a general procedure.
Before beginning the procedure, the membrane is presoaked in dialysate. This makes it easier to use, and removes any preservatives. Once ready, the sample is collected, typically with a syringe and is then added to the dialysis container. This can be bare tubing, or contained within a cassette. Excess air is removed from the dialysis setup to maximize the sample’s surface area with the membrane. The setup is then placed into the dialysate with stirring to maximize the diffusion. It should float to not inhibit stirring.
The dialysate is changed at relevant intervals as equilibrium between sample and dialysate is reached. After the last change, the reaction is typically left to run overnight. After a sufficient time period, the buffer-free or -exchanged sample is removed from the cassette. Once collected, the sample can be analyzed or further processed, depending on the nature of the experiment.
Now that we’ve looked at a general dialysis procedure, let’s see some of the ways this technique is used in biochemistry.
Density gradients are a common way to separate complex biological samples. This concept relies on the distribution on small particles, typically sucrose or cesium chloride ions. Once complete, these reagents typically need to be removed before the collected sample can be processed. Dialysis makes it possible to utilize the purified sample for future analysis.
Certain proteins are found within a cell’s lipid bilayer, and are usually studied by interspersing them into spherical lipid vesicles known as liposomes. The proteins and lipids are first extracted with a detergent. Dialysis can be used to slowly remove the detergent, forming proteoliposomes.
After purification, some proteins are misfolded, or denatured, leading to a loss in functionality. The compounds that cause these changes in structure can be removed with dialysis, leading to the reformation of functioning analytes.
You’ve just watched JoVE’s video on dialysis. You should now understand this diffusion-based method, a simple experimental procedure, and the use of this technique.
Thanks for watching!
