Diálisis: separación basada en difusión
English
Diviser
Vue d'ensemble
Diálisis es una técnica común utilizada en bioquímica para separar moléculas basadas en difusión. En este procedimiento, una membrana semipermeable permite el movimiento de ciertas moléculas basado en el tamaño. Este método puede ser aplicado a la remoción de búfer, conocida como la desalación, o intercambiando buffer moléculas o iones de una solución proteica.
Este video cubre los principios de la diálisis junto con un procedimiento general. repasan varias aplicaciones de la diálisis, incluyendo la eliminación de reactivos degradados después de ultracentrifugación, quitando detergente después de una proteína de membrana extracción y la reconstitución de proteínas cambiando el ambiente de solución.
muestras bioquímicas suelen tienen concentraciones de tampón alta que pueden interrumpir el procesamiento descendente y análisis. La diálisis es una técnica común y económica utilizada para separar moléculas basadas en difusión. El método utiliza una membrana semipermeable que permite el movimiento de ciertos componentes, basado en el tamaño. Este video le mostrará los conceptos de diálisis, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones en bioquímica.
el aspecto más importante de la diálisis es una membrana semipermeable que tiene poros que imponen un peso molecular de corte, permitiendo que las moléculas por debajo de un cierto tamaño para pasar a través. Por ejemplo, una membrana k 10 generalmente conserva las moléculas más grandes que 10 kilodaltons. Sin embargo, el corte de peso molecular no es un límite discreto o precisa. La membrana contiene típicamente una amplia gama de tamaños de poro, por lo que una pequeña fracción de las moléculas cerca de la corte puede perderse.
Ya que el corte de peso molecular se define mediante proteínas globulares, moléculas lineales de masa similar, como el DNA o el RNA, puede deslizarse a través de. Membranas por lo general se eligen una mitad a un tercio del peso molecular de la molécula deseada.
Para realizar el procedimiento, una muestra se coloca en la membrana, que a su vez se agrega a un gran volumen de solución, llamado el dializado. Con el tiempo, moléculas más pequeñas se difundirán libremente a través de la membrana entre la muestra y el dializado, mientras que las biomoléculas más grandes se llevan a cabo dentro de. La diálisis es un proceso lento. Es común para permitir que se ejecute durante la noche, o incluso a través de varios días.
Si el dializado es agua pura, la concentración total del tampón disminuirá, un proceso conocido como la desalación. Si la solución contiene otras partículas pequeñas, algunas se moverán en la muestra, a cambio de buffer. Porque la diálisis es un proceso de equilibrio, el dializado puede actualizar varias veces para desplazar otras moléculas pequeñas. Una vez que el proceso de la muestra es nuevamente recogida para su posterior procesamiento.
Ahora que te ' he visto los fundamentos de la diálisis, dejó ' s echa un vistazo a un procedimiento general.
antes de comenzar el procedimiento, la membrana se presoaked en el dializado. Esto hace más fácil de usar y conservantes. Una vez listos, la muestra se recoge normalmente con una jeringa y luego se agrega al contenedor de diálisis. Esto puede ser tubería desnuda, o dentro de un cassette. Exceso de aire se quita de la instalación de diálisis para maximizar la muestra ' superficie s con la membrana. La configuración se coloca en el dializado con agitación para maximizar la difusión. Debe flotar para no inhibir agitación.
El dializado se cambia a intervalos pertinentes como se alcanza el equilibrio entre la muestra y del dializado. Después del último cambio, la reacción se deja típicamente para funcionar durante la noche. Después de un período de tiempo suficiente, el buffer libre – intercambiada muestra o se retira de la cassette. Una vez recogida, la muestra puede ser analizada o la tramitación, según la naturaleza del experimento.
ahora que ' ve vieron un procedimiento de diálisis general, que ' s ver algunas de las formas de esta técnica se utiliza en bioquímica.
Gradientes de densidad deson una forma común para separar muestras biológicas complejas. Este concepto basa en la distribución en pequeñas partículas, generalmente sacarosa o cesio los iones del cloruro. Una vez finalizada, estos reactivos normalmente es necesario retirar antes de que se puede procesar la muestra recogida. Diálisis, es posible utilizar la muestra purificada para futuros análisis.
Ciertas proteínas se encuentran dentro de una célula ' bicapa de lípido s y son generalmente estudiaron por entremezcla en vesículas lipídicas esféricas conocidas como liposomas. Las proteínas y los lípidos se extraen primero con un detergente. Diálisis se puede utilizar para quitar lentamente el detergente, formando proteoliposomes.
Después de la purificación, algunas proteínas son mal o desnaturalizadas, conduce a una pérdida en la funcionalidad. Los compuestos que causan estos cambios en la estructura pueden ser removidos con diálisis, llevando a la reforma del funcionamiento de los analitos.
te ' ve a Miró JoVE ' s video en diálisis. Ahora usted debe entender este método basado en la difusión, un procedimiento experimental simple y el uso de esta técnica.
Gracias por ver!
Procédure
Divulgations
Transcription
Biochemical samples typically have high buffer concentrations that can disrupt downstream processing and analysis. Dialysis is a common, inexpensive technique used to separate molecules based on diffusion. The method utilizes a semi-permeable membrane that allows the movement of certain components, based on size. This video will show the concepts of dialysis, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
The most important aspect of dialysis is a semi-permeable membrane, which has pores that impose a molecular weight cut-off, allowing molecules below a certain size to pass through. For example, a 10k membrane will generally retain molecules larger than 10 kilodaltons. However, the molecular weight cutoff is not a discrete or precise boundary. The membrane typically contains a broad range of pore sizes, so a small fraction of molecules near the cutoff may be lost.
Since the molecular weight cutoff is defined using globular proteins, linear molecules of similar mass, like DNA or RNA, may slip through. Membranes are typically chosen one half to one third the molecular weight of the desired molecule.
To perform the procedure, a sample is placed into the membrane, which is in turn added to a large volume of solution, called the dialysate. Over time, smaller molecules will diffuse freely across the membrane between the sample and the dialysate, while the larger biomolecules are held within. Dialysis is a slow process. It is common to allow it to run overnight, or even across multiple days.
If the dialysate is pure water, the overall buffer concentration will decrease, a process known as desalting. If the solution contains other small particles, some will move into the sample, leading to buffer exchange. Because dialysis is an equilibrium process, the dialysate can be refreshed multiple times to further displace small molecules. Once the process is complete the sample is re-collected for further processing.
Now that you’ve seen the basics of dialysis, let’s take a look at a general procedure.
Before beginning the procedure, the membrane is presoaked in dialysate. This makes it easier to use, and removes any preservatives. Once ready, the sample is collected, typically with a syringe and is then added to the dialysis container. This can be bare tubing, or contained within a cassette. Excess air is removed from the dialysis setup to maximize the sample’s surface area with the membrane. The setup is then placed into the dialysate with stirring to maximize the diffusion. It should float to not inhibit stirring.
The dialysate is changed at relevant intervals as equilibrium between sample and dialysate is reached. After the last change, the reaction is typically left to run overnight. After a sufficient time period, the buffer-free or -exchanged sample is removed from the cassette. Once collected, the sample can be analyzed or further processed, depending on the nature of the experiment.
Now that we’ve looked at a general dialysis procedure, let’s see some of the ways this technique is used in biochemistry.
Density gradients are a common way to separate complex biological samples. This concept relies on the distribution on small particles, typically sucrose or cesium chloride ions. Once complete, these reagents typically need to be removed before the collected sample can be processed. Dialysis makes it possible to utilize the purified sample for future analysis.
Certain proteins are found within a cell’s lipid bilayer, and are usually studied by interspersing them into spherical lipid vesicles known as liposomes. The proteins and lipids are first extracted with a detergent. Dialysis can be used to slowly remove the detergent, forming proteoliposomes.
After purification, some proteins are misfolded, or denatured, leading to a loss in functionality. The compounds that cause these changes in structure can be removed with dialysis, leading to the reformation of functioning analytes.
You’ve just watched JoVE’s video on dialysis. You should now understand this diffusion-based method, a simple experimental procedure, and the use of this technique.
Thanks for watching!
