Ultracentrifugazione a gradiente di densità
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Vue d'ensemble
L’ultracentrifugazione a gradiente di densità è una tecnica comune utilizzata per isolare e purificare biomolecole e strutture cellulari. Questa tecnica sfrutta il fatto che, in sospensione, le particelle più dense del solvente si sedimenteranno, mentre quelle meno dense galleggieranno. Un ultracentrifuga ad alta velocità viene utilizzato per accelerare questo processo al fine di separare le biomolecole all’interno di un gradiente di densità, che può essere stabilito stratificando liquidi di densità decrescente in un tubo di centrifuga.
Il video coprirà i principi dell’ultracentrifugazione del gradiente di densità, inclusa una procedura che dimostra la preparazione del campione, la creazione di un gradiente di saccarosio, l’ultracentrifugazione e la raccolta di analeti frazionati. La sezione applicazioni discute l’isolamento di complessi multi-proteici, l’isolamento di complessi di acidi nucleici e la separazione utilizzando gradienti di densità del cloruro di cesio.
L’ultracentrifugazione del gradiente di densità è un approccio comune per isolare e purificare le strutture cellulari per esperimenti biochimici. La tecnica utilizza una centrifuga ad alta velocità, o ultra, per separare in modo non distruttivo i componenti cellulari in un gradiente di densità. Questo video descrive i principi dell’ultracentrifugazione del gradiente di densità, fornisce una procedura generale che utilizza un gradiente di saccarosio e discute alcune applicazioni.
Iniziamo esaminando i principi delle ultracentrifughe e dei gradienti di densità. Una sospensione contiene particelle in un solvente liquido. A causa della gravità, le particelle più dense del sedimento del solvente fuoriescono mentre quelle meno dense del solvente galleggiano. Maggiore è la differenza di densità tra la particella e il solvente, più veloce è la separazione.
Un’ultracentrifuga contiene un’unità chiamata rotore, che ruota a velocità altamente controllate, simulando un forte campo gravitazionale. All’interno di questo campo, le differenze di densità tra le particelle e il solvente sono ingigantite.
La forza del campo dipende dalla velocità di rotazione. Anche un piccolo rotore a una velocità di rotazione relativamente bassa può creare una forza migliaia di volte più forte del campo gravitazionale terrestre.
Se un tubo contiene più liquidi di densità diverse, la centrifugazione li manterrà in strati separati in ordine di densità, con il liquido più denso più vicino alla base. Tale stratificazione di più liquidi è chiamata “gradiente di densità”. Ci sono due tipi. Nei gradienti di passo, i liquidi di densità decrescente sono accuratamente stratificati l’uno sull’altro. In gradienti continui, i liquidi vengono miscelati in proporzioni variabili, quindi la densità diminuisce dolcemente dalla base verso l’alto.
Gli organelli cellulari possono essere separati usando un gradiente a gradini, attraverso la “centrifugazione isopycnic density-gradient”. Questa è la procedura di centrifugazione più semplice e più comune.
Questa procedura viene utilizzata per separare le strutture cellulari. Più denso è l’organello, più scende, con mitocondri in alto e acidi nucleici verso il basso.
Ora che conosci i principi alla base della tecnica, vediamolo in laboratorio.
Prima di iniziare la procedura, è necessario annotare le classificazioni di velocità e densità del produttore e controllare la corrosione dell’ultracentrifuga. Questa procedura utilizza un rotore a benna oscillante.
In primo luogo, il materiale cellulare viene preparato omogeneizzando le cellule, che rilasciano in modo non distruttivo i loro organelli. L’omogeneo può essere frazionato attraverso centrifugazione preliminare a bassa velocità, per rimuovere componenti a bassa densità. Successivamente, vengono preparate le soluzioni di saccarosio.
Il saccarosio viene aggiunto in quantità crescenti in modo che ogni soluzione sia più concentrata, e quindi più densa, rispetto alla precedente. Le densità esatte delle soluzioni dipenderanno dai componenti da separare, che variano tra gli organismi. Le soluzioni devono avere densità tra quelle dei componenti da separare, con l’ultima soluzione più densa della componente più densa dell’analita. Le tecniche per separare i componenti più densi del saccarosio, come gli acidi nucleici, sono descritte nelle applicazioni.
Il gradiente di saccarosio è ora creato in un tubo di centrifuga pulito. Una pipetta viene utilizzata per redigere la soluzione di saccarosio più concentrata. Con il tubo tenuto in posizione verticale, la punta della pipetta è posizionata in alto contro la parete e il liquido erogato costantemente verso il basso. È importante che l’area di lavoro sia mantenuta libera da vibrazioni e altri disturbi.
Dopo aver sostituito la punta, le soluzioni rimanenti vengono aggiunte in ordine di densità decrescente. Sono dispensati con cura per formare strati distinti ed evitare la miscelazione. Infine, circa mezzo millilitro del campione cellulare viene aggiunto in cima al gradiente e il tubo viene pesato. Questo viene utilizzato per bilanciare la distribuzione del peso, la fase successiva del processo.
La centrifugazione dovrebbe iniziare il prima possibile. Il tubo viene posizionato nel rotore, che viene quindi bilanciato posizionando soluzioni vuote di uguale peso in fessure opposte. Il rotore è posizionato nell’ultracentrifuga e il sistema sigillato. La temperatura, la velocità di rotazione e il tempo sono impostati. I valori tipici sono 4 °C con una forza di oltre 100.000 x g per 16 ore.
Dopo la centrifugazione, il tubo viene prelevato dal rotore, avendo cura di mantenerlo in posizione verticale e indisturbato. I diversi componenti cellulari si sono frazionati in bande discrete tra gli strati della soluzione. Le frazioni possono essere raccolte con una siringa. In alternativa, il fondo del tubo può essere perforato con un ago sottile sterilizzato e il deflusso raccolto in tubi sterili. I componenti cellulari sono stati ora isolati. Possono essere conservati a -80 °C.
Ora che abbiamo visto la procedura di base, diamo un’occhiata ad alcune applicazioni.
Un’applicazione tipica è l’isolamento di complessi multi-proteici nelle cellule vegetali. In questo esempio, i complessi responsabili del flusso ciclico di elettroni vengono isolati dal thylakoid, il sito della reazione luminosa nella fotosintesi. Questa procedura utilizza soluzioni discrete dal 14 al 45% di saccarosio. La centrifugazione avviene oltre 100.000 x g per 14 ore a 4 °C.
Poiché gli acidi nucleici sono più densi del saccarosio, la centrifugazione isopicnica non può separarli dagli organelli in modo non distruttivo.
Viene utilizzata una tecnica diversa, nota come “centrifugazione rate-zonale”. Separa gli organelli in base ai loro tassi di sedimentazione, che dipendono non solo dalle loro densità, ma anche dalle loro conformazioni. Una sfumatura continua viene utilizzata per separare i componenti in base a questa proprietà.
Le fasi procedurali sono simili a quelle per i casi isopici. In questo esempio, i complessi RNA-ribosomi sono isolati utilizzando un gradiente continuo dal 5% al 20%, centrifugato a 230.000 x g. La centrifugazione viene interrotta dopo poche ore per evitare la co-precipitazione.
I filamenti di acido nucleico possono essere separati l’uno dall’altro sulla base della densità.
Questo perché i fili ricchi di guanina e citosina sono più densi di quelli ricchi di adenina e tiamina. In questo caso, il gradiente non può essere fatto di saccarosio, perché il saccarosio è meno denso degli acidi nucleici. Invece, vengono utilizzati gradienti di cloruro di cesio, in genere da 1,65 a 1,75 g / mL, in quanto hanno una densità sufficiente e una bassa viscosità.
Qui vediamo il DNA del plancton purificato usando un gradiente continuo di cloruro di cesio. La centrifugazione avviene a oltre 1.000.000 x g per 18 ore sotto vuoto.
Hai appena visto il video di JoVE sull’ultracentrifugazione con un gradiente di densità di saccarosio. Ora dovresti capire come funziona un gradiente di densità, come costruire un gradiente di passo e come caricare e utilizzare un ultracentrifuga. Grazie per l’attenzione!
Procédure
Divulgations
Transcription
Density gradient ultracentrifugation is a common approach to isolate and purify cell structures for biochemical experiments. The technique uses a high-speed, or ultra, centrifuge to nondestructively separate cellular components in a density gradient. This video describes the principles of density gradient ultracentrifugation, provides a general procedure using a sucrose gradient, and discusses some applications.
Let’s start by examining the principles of ultracentrifuges and density gradients. A suspension contains particles in a liquid solvent. Because of gravity, particles denser than the solvent sediment out while those less dense than the solvent float. The greater the difference in density between the particle and the solvent, the faster the separation.
An ultracentrifuge contains a unit called a rotor, which rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Within this field, the differences in density between particles and the solvent are magnified.
The strength of the field depends on the speed of rotation. Even a small rotor at a relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than the earth’s gravitational field.
If a tube contains several liquids of different densities, centrifugation will keep them in separate layers in order of density, with the densest liquid closest to the base. Such a layering of multiple liquids is called a “density gradient.” There are two types. In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top one another. In continuous gradients, the liquids are mixed in varying proportions, so the density decreases smoothly from the base upwards.
Cellular organelles can be separated using a step gradient, through “isopycnic density-gradient centrifugation.” This is the simplest and most common centrifugation procedure.
This procedure is used to separate the cellular structures. The more dense the organelle, the further it descends-with mitochondria at the top and nucleic acids towards the bottom.
Now that you know the principles behind the technique, let’s see it in the lab.
Before the procedure is started, the manufacturer’s speed and density ratings should be noted, and the ultracentrifuge checked for corrosion. This procedure uses a swinging-bucket rotor.
First, the cellular material is prepared by homogenizing the cells, which nondestructively releases their organelles. The homogenate may be fractionated through preliminary low-speed centrifugation, to remove low-density components. Next, the sucrose solutions are prepared.
Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated, and therefore denser, than the preceding one. The exact densities of the solutions will depend on the components to be separated, which vary between organisms. The solutions should have densities between those of the components to be separated, with the last solution denser than the densest component of the analyte. Techniques for separating components denser than sucrose, like nucleic acids, are described in the applications.
The sucrose gradient is now created in a clean centrifuge tube. A pipette is used to draw up the most concentrated sucrose solution. With the tube held upright, the pipette tip is placed high against the wall, and the liquid dispensed steadily down. It’s important that the working area is kept free of vibrations and other disturbances.
After replacing the tip, the remaining solutions are added in order of decreasing density. They are dispensed carefully to form distinct layers and avoid mixing. Finally, about half a milliliter of the cellular sample is added atop the gradient, and the tube is weighed. This is used to balance the weight distribution, the next step of the process.
Centrifugation should begin as soon as possible. The tube is placed in the rotor, which is then balanced by placing blank solutions of equal weight in opposing slots. The rotor is placed in the ultracentrifuge and the system sealed. The temperature and rotation speed and time are set. Typical values are 4 °C with a force of over 100,000 x g for 16 h.
After centrifugation, the tube is withdrawn from the rotor, taking care to keep it upright and undisturbed. The different cellular components have fractionated into discrete bands between the solution layers. The fractions can be collected with a syringe. Alternately, the bottom of the tube can be punctured with a fine, sterilized needle and the outflow collected in sterile tubes. The cellular components have now been isolated. They can be stored at -80 °C.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
A typical application is the isolation of multi-protein complexes in plant cells. In this example, complexes responsible for cyclic electron flow are being isolated from the thylakoid, the site of the light reaction in photosynthesis. This procedure uses discrete solutions of 14 to 45% sucrose. Centrifugation occurs over 100,000 x g for 14 h at 4 °C.
Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively.
A different technique, known as “rate-zonal centrifugation” is used. It separates organelles based on their sedimentation rates, which depend not only on their densities, but also on their conformations. A continuous gradient is used to separate the components based on this property.
The procedural steps are similar to those for isopycnic cases. In this example, RNA-ribosome complexes are isolated using a continuous gradient of 5% to 20%, centrifuged at 230,000 x g. Centrifugation is interrupted after a few hours to prevent co-precipitation.
Nucleic acid strands can be separated from each other on the basis of density.
This is because strands rich in guanine and cytosine are denser than those rich in adenine and thiamine. In this case, the gradient cannot be made of sucrose, because sucrose is less dense than nucleic acids. Instead, cesium chloride gradients, typically from 1.65 to 1.75 g/mL are used, as they have sufficient density and a low viscosity.
Here we see plankton DNA being purified using a continuous cesium chloride gradient. Centrifugation occurs at over 1,000,000 x g for 18 h under vacuum.
You’ve just watched JoVE’s video on ultracentrifugation with a sucrose density gradient. You should now understand how a density gradient works, how to construct a step gradient, and how to load and operate an ultracentrifuge. Thanks for watching!
