化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

この一連の実験の全体的な目標は、CiDERと呼ばれる人工的なスプリットTET2酵素を哺乳動物細胞に導入し、ヒドロキシメチル化やエピジェネティックなリモデリングなどのDNA修飾を誘導することです。この手法の主な利点は、操作されたsplit-TET2酵素が5-メチルシトシン酸化の時間的制御と、その後の化学添加物による哺乳類細胞のエピジェネティックな状態のリモデリングを可能にすることです。この手順を開始するには、10%熱不活化FBSと100単位/ミリリットルのペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEMで接着細胞株を培養します。

細胞を摂氏37度で5%CO2とインキュベートし、テキストプロトコールに記載されているように、細胞にCiDERプラスミドをトランスフェクションします。次に、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、トランスフェクション試薬含有培地を新鮮で完全なDMEMと交換します。細胞を化学的に誘導するには、2ミリリットルの培地に維持されたトランスフェクション細胞に希釈したラパマイシン20マイクロリットルを加えて、最終濃度200ナノモルに到達します。フローサイトメトリーを行うには、トランスフェクションした細胞とラパマイシン誘導細胞をFACSバッファーに再懸濁します。

対照群には、ラパマイシン処理を行わずにCiDER発現細胞を使用します。テキストプロトコルに記載されているように細胞を固定し、透過処理します。次に、2つの正常塩酸を細胞に加えて、DNAを10分間変性させます。

テキストプロトコールに記載されているように細胞を中和およびブロックした後、希釈した抗5hmC抗体を細胞に加えます。細胞を室温で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、細胞をFACSバッファーで3回洗浄します。

FACSバッファを完全に取り外します。FACS解析用に希釈したフルオロフォア標識二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。その後、細胞をFACSバッファーで3回洗浄します。

洗浄後、サンプルはFACS分析の準備が整います。市販のDNA抽出キットを使用して、トランスフェクション細胞およびラパマイシン誘導細胞からゲノムDNAを単離します。対照群には、ラパマイシン処理を行わずにCiDERトランスフェクト細胞を使用してください。

真空オーブンを摂氏80度に加熱します。ニトロセルロースメンブレンを二重蒸留水に事前に浸し、次に6X SSCバッファーに10分間浸します。次に、60マイクロリットルの等量のDNAを96ウェルPCRプレートにロードします。

30 マイクロリットルの TE バッファーを残りのウェルに加えます。96ウェルプレート上で縦に2倍に段階希釈を行い、1行目の30マイクロリットルの溶液を2行目の同じ列位置に移します。再度混合し、境界に達するまで30マイクロリットルの溶液を次の列のウェルに移します。

次に、最後の30マイクロリットルをウェルから取り出します。次に、20マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムと10ミリモルのEDTAを各ウェルに加えます。プレートを密封し、混合物を摂氏95度で10分間加熱して、DNA二本鎖を完全に変性させます。

すぐにサンプルを氷の上で冷まします。50マイクロリットルの氷冷した2モル酢酸アンモニウムを各ウェルに加え、氷上で10分間インキュベートします。その間、ドットブロット装置をあらかじめ浸したメンブレンで組み立てます。

完全な真空を使用して残留バッファーを除去します。200 μリットルのTEバッファーをドットブロット装置の各ウェルに添加して、メンブレンを洗浄します。真空装置をオンにして、TEバッファを取り外します。

次に、変性したDNAをドットブロット装置の各ウェルにロードします。バキュームをオンにして溶液を取り除きます。200マイクロリットルの2X SSCを加えてメンブレンを洗浄し、真空を使用して残留溶液を完全に除去します。

ドットブロット装置を分解します。次に、メンブレンを取り出し、20ミリリットルの2X SSCでメンブレン全体をすすぎます。メンブレンを20分間風乾します。

膜をさらに乾燥させるには、真空下で80度で2時間焼きます。ブロッキング溶液をメンブレンに加え、室温で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液を廃棄した後、希釈した5-hmCまたは5-mC抗体をメンブレンに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。

メンブレンをTBSTで10分間3回洗浄し、残留抗体を除去します。TBSTを完全に除去した後、HRP標識二次抗体をメンブレンに添加します。メンブレンを室温で1時間インキュベートします。

メンブレンをTBSTで10分間3回洗浄します。最後に、ECLウェスタンブロッティング基質をメンブレンに添加し、化学発光検出器を使用して5-hmCシグナルを可視化します。ここでは、CiDER を介したフローサイトメトリーによる 5-hmC 産生の代表的な定量結果を示します。

ラパマイシン処理条件下でCiDERを発現する細胞のみが、5-hmCレベルの有意な増加を示します。ドットブロットアッセイによる全細胞集団における5-hmCレベルの全球的な変化の代表的な結果をここに示します。ローディング制御は、インプットDNAの総量のエチレンブルー染色によって視覚化されます。

この結果は、ラパマイシン処理がCiDER発現HEK293T細胞において5-hmCの強力な産生を誘導し、バックグラウンド活性が無視できることを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば1週間で行うことができます。その開発後、この技術は、エピジェネティクスの分野の研究者が遺伝暗号を変更することなく細胞機能を探索し、さまざまな生物学的システムにおけるエピジェネタイプと表現型の関係を調査するための道を開きました。