כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

המטרה הכוללת של הליך קטיעה זה היא להסיר באופן סלקטיבי ומלא את הלוע מהפלנרים מבלי לפגוע באיברים אחרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתחדשות. כמו למשל כיצד תאי גזע מזהים איברים חסרים ומתחילים את התחדשותם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מדויקת מאוד וכי איברים אחרים אינם נפגעים במהלך התהליך. הרעיון לשיטה הזו עלה לי לראשונה כשהרדמתי פלנרים עם סודיום אזיד. שמתי לב שחשיפה לנתרן אזיד גרמה ללוע לצוץ החוצה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהקטיעה דורשת בחירה נכונה של בעלי חיים כמו גם התבוננות מדוקדקת בתנועה ובמורפולוגיה של בעלי החיים. תדגים את ההליך דיוויה שירור, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. לפני תחילת ההליך, השתמש בפיפטה להעברה מפלסטיק כדי לבחור תולעים שהוזנו חמישה עד שבעה ימים קודם לכן לצלחת פטרי נקייה.

הניחו סרגל שטוח מתחת לצלחת הפטרי כדי לאשר שכל פלנר הוא באורך של לפחות 6 מילימטרים כשהם זוחלים על פני הצלחת. לאחר מכן העבירו עד 20 תולעים נבחרות לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר והשתמשו בפיפטה להעברה כדי להסיר את כל המים המישוריים מהצלחת. הניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ סטריאו והתאימו את ההגדלה כך שניתן יהיה לצפות במספר בעלי חיים.

הוסף למנה חמישה מיליליטר של תמיסת נתרן אזיד טרייה של 100 מילי-מולאר. עקוב אחר בעלי החיים מבלי להזיז את הצלחת במשך שלוש עד ארבע דקות כדי לצפות בשחול הלוע. כאשר לפחות מחצית מבעלי החיים בצלחת התארכו לחלוטין את הלוע, השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי לשאוב ולהוציא בכוח את התולעים סביב הצלחת כמה פעמים.

אם לוע כלשהו היה מורחב במלואו, פיפטינג נמרץ זה יגרום להם להתנתק. לחלופין, השתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי לתפוס את הלוע תוך הרמת המישור כלפי מעלה לכיוון המניסקוס. כאשר החיה מורמת, מתח הפנים יגרום לניתוק הלוע.

בזמן שאתה מזיז את הלוע היזהר לא לגרום לפציעה מקרית לבעלי החיים. פלנרים הם בעלי גוף רך מאוד ונפגעים בקלות, במיוחד כאשר הם נמצאים בסודיום אזיד. השתמשו בפיפטה כדי להעביר כ-15 בעלי חיים קטועים לכלי חדש המכיל מים פלנריים טריים ושטפו את התולעים במים פלנריים טריים שלוש פעמים.

הקפד לשטוף לחלוטין את אזיד הנתרן. אפילו עקבות של הכימיקל עלולים לגרום לבעלי חיים ליז. לאחר מכן דגרו על התולעים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים.

יום לאחר הקטיעה, הנח את התולעים בחזרה מתחת למיקרוסקופ כדי לקבוע אם נראה כתם כהה בצד הגבי של התולעת. כדי להאכיל את התולעים, העבירו נפח מתאים של משחת כבד לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה קצרה כדי להסיר בועות אוויר. לאחר הערכת נפח כדור הדבק, הוסיפו מים מישוריים לחמישית מנפחו.

בהתבסס על הנפח הכולל בצינור, הוסף שני אחוז צבע מאכל אדום. מערבבים היטב את דגימת המזון עד שהצבע מתפזר באופן שווה בכל העיסה וצנטריפוגה קצרה שוב את הצינור. מעבירים את החיות הקטועות לצלחת פטרי חדשה ומניחים בחושך למשך כשעה.

בתום הדגירה, חתוך כחצי סנטימטר מקצה קצה פיפטה P200 והשתמש בקצה השונה כדי להעביר 25 מיקרוליטר של רסק כבד אדום לתבשיל. אפשר לבעלי החיים להאכיל במשך 30 דקות. לאחר מכן הניחו את התולעים על רקע לבן כדי לציין את מספר החיות שנראות אדומות.

לאחר כ -6 דקות בתמיסת נתרן אזיד, ניתן לראות את הקצה הלבן של הלוע. כמה דקות לאחר מכן החיות מתכווצות באופן פעיל ופולטות בכוח את הלוע מגופן. לאחר כ-11 דקות של חשיפה לאזיד, בעלי החיים נרגעים ובשלב זה צורת הפעמון האופיינית של הלוע נראית בבירור.

כעת הוא מוכן לקטיעה. הסרת המסה הגדולה והלא פיגמנטית הזו של רקמה גורמת להופעת כתם כהה בצד הגבי של בעלי החיים הקטועים. כדי לנטר את התחדשות הלוע בצורה מדויקת יותר, ניתן לצבוע את בעלי החיים בסטרפטווידין מצומד פלואורסצנטי בן לילה.

על ידי שילוב צבעי מאכל עם משחת הכבד, ניתן להבחין בין בעלי החיים שאוכלים לבין בעלי החיים שאינם אוכלים. לאחר מכן ניתן לכמת את מספר החיות האדומות כדי להעריך את אחוז החיות עם לוע מתפקד. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 20 או 30 דקות.

כשאתה מנסה הליך זה, זכור להתבונן היטב בתנועה המישורית כדי לאתר מתי יש להתחיל את הקטיעה. קטיעות סלקטיביות יכולות לעזור לענות על שאלות כמו כיצד תאי גזע יוזמים את החלטות השושלת המתאימות כדי להשיג התחדשות. סרטון זה אמור לספק הבנה טובה כיצד לבצע הסרה סלקטיבית של הלוע באמצעות נתרן אזיד.

עבודה עם נתרן אזיד עלולה להיות מסוכנת ביותר. זכור תמיד לטפל בזה עם כפפות, להשליך פסולת כראוי ולנקות את סביבת העבודה שלך לאחר הניסוי.