Name: 经典短时滞上只是一眨眼在一岁儿童中的调节作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 了解如何使用经典短时滞眨眼条件反射范式评估一岁婴儿的联想学习能力。该方法通过听觉和触觉刺激检测神经发育缺陷，为早期干预提供依据。

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本研究由新西兰视光学视觉研究基金会、健康促进署、奥克兰大学科研发展基金以及奥克兰大学医学院PBRF基金资助。
我们感谢来自奥克兰大学的两名验光学生（Shannon Boy 和 Harpreet Singh）完成了手动视频分析，以检验眨眼反应测量结果的一致性。

本研究中所述所有方法均经北区B健康与残疾伦理委员会批准，参考编号：13/NTB/181。
1. 技术要求
<ol>
	<li>使用能够向角膜直接输送气流的气流装置。可通过连接至气罐的柔性管实现该操作 通过 空气压缩机。为确保婴儿安全，需配备可调节压力调节器，以限制气压并控制气流喷射持续时间。 
	注意：市售系统将压缩机集成于系统内部，无需空气储罐。</li>
	<li>使用可调节的头带或帽子，让婴儿佩戴，并能将气流管适当地置于眼睛旁边。</li>
	<li>设置两个带有可调节音量控制的便携式音频扬声器。</li>
	<li>设计并建立设备的计算机控制，以实现自动、精确时序且可变间隔地给予声音刺激和气流刺激。</li>
	<li>设置一台便携式摄像机，帧率至少为60 Hz，用于手动记录眼睑眨眼反应。为测量反应时间，应使用能够捕捉试验起始时刻的摄像机，可通过录制可听音调或拍摄软件程序中预设的试验起始指示器来实现。</li>
	<li>安装并运行任何支持逐帧播放音频和视频内容的视频编辑软件（例如，Adobe Premiere Pro）以便研究人员测量刺激与眨眼反应之间的时间间隔。</li>
</ol>
2. 实验范式
<ol>
	<li>以每组10次试验的方式进行试验。每组应包含以下类型的试验。
	<ol>
		<li>包含八次配对试验，其中每次学习试验由一个持续750毫秒的音调（80 dB，1 kHz）组成，该音调与一个持续100毫秒的气流刺激（约1/20 psi）重叠，并在气流刺激开始时终止9,10,11。</li>
		<li>包含一次非配对试验，仅呈现一次单独的750毫秒音调，不伴随气流刺激，用于检测是否存在条件性眨眼反应，以评估是否发生了联想学习。</li>
		<li>包含一次躯体感觉试验，仅呈现一次单独的100毫秒气流刺激，不伴随音调，用于检测角膜对气流刺激的敏感性以及头带位置是否正确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将连续试验之间的间隔随机化（例如，8 - 16 秒，平均试验间隔时间约为12秒）9,10,11。</li>
	<li>在单次实验中测量五个连续组（即，总共50次试验），总实验时间约为12分钟。</li>
	<li>为测试条件反射是否持续存在，至少间隔1小时进行两次各包含50次试验的经典眨眼条件反射（EBC）实验。</li>
</ol>
3. 测试步骤
<ol>
	<li>在光线适中（约300勒克斯）且实验间光照水平一致的房间内进行眼睑条件反射实验（EBC）。</li>
	<li>将两个便携式扬声器放置在婴儿头部两侧，距离头部两侧各约40厘米。</li>
	<li>将定制的头带戴在婴儿头上，并根据头围大小进行调整。</li>
	<li>调整固定气流喷嘴及相邻红外传感器的柔性管位置，使其距离儿童右眼约1–3厘米，并与头部轴平面呈约45°角（图1）。</li>
	<li>实验开始前，检查实验装置是否已优化，以确保能够准确输送角膜气流刺激。向婴儿眼睛输送一次测试气流，观察是否引发眨眼反应，并在视频摄像机上可见。若未观察到眨眼反应，应调整头带位置，使气流装置更靠近眼睛。</li>
	<li>在整个实验过程中记录婴儿的眼睑眨眼反应。调整视频摄像机位置，使其视野对准婴儿的眼睛。摄像机应足够接近以分辨微小的眼动，但又不能过近，以防婴儿躁动时移出画面。</li>
	<li>确保实验操作人员对刺激呈现的时间点保持盲态。若EBC用户界面提示下一次试验的时间，请要求研究人员背对计算机界面，以避免其知晓下一次刺激的发送时机。此举可防止研究人员自身对刺激产生反应，进而可能影响婴儿的学习反应。</li>
</ol>
4. 优化一岁婴儿实验设置
<ol>
	<li>确保有两名研究人员参与实验。</li>
	<li>为婴儿佩戴头带时，请照护者将婴儿侧向抱坐在其腿上，以便一名研究人员从婴儿头部侧面及后方接近，同时另一名研究人员与婴儿互动以保持其注意力。</li>
	<li>佩戴头带和调整喷嘴位置应尽可能迅速且轻柔地进行，以确保婴儿配合。在调整位置时，用手轻轻遮住喷嘴尖端，可防止婴儿将头转向喷嘴。</li>
	<li>整个实验过程中，保持婴儿坐在照护者的腿上。 
	注意：虽然使用高脚椅可能在不同实验间提供更一致的环境，但这可能增加许多婴儿的焦虑感并降低配合度。</li>
	<li>对于实验过程中倾向于触碰或干扰头带的婴儿，可采用温和的分散注意力方法进行引导。</li>
	<li>实验过程中头带常会发生移位。若婴儿对气流刺激不再产生反应，或头带明显偏离眼部位置，应暂停实验，重新调整头带位置后再继续。</li>
	<li>鼓励儿童在实验过程中向上注视，以增强眼睑闭合动作的幅度，从而提高眼睑闭合反应的检测效果。 
	注意：可通过在婴儿视线略上方放置一台显示器播放适合婴儿观看的视频（例如，关闭音频的适龄卡通片）来实现此目的。</li>
</ol>
5. 使用摄像机录像进行眨眼检测
<ol>
	<li>由两名研究人员独立为每次实验定义眼睑眨眼反应。</li>
	<li>使用视频编辑软件分析每个试验在试验开始后2,000毫秒时间窗内的反应。</li>
	<li>利用音频波形确定试验开始的第一帧。
	<ol>
		<li>对于配对（CS + US）和非配对（仅CS）试验，从可听音调的起始点定义试验开始。</li>
		<li>对于仅呈现US（气流刺激）的躯体感觉试验，需预先测试，以确保摄像机麦克风能够检测到气流刺激产生的约100毫秒的微弱声音。若无法检测，则可通过软件程序中预设的试验起始指示器的视频记录来辅助确定气流刺激的起始时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用视频轨道检测眨眼反应。将眨眼潜伏期记录为以下两个时间点：眨眼起始——眼睑开始闭合的第一帧；眨眼峰值——眼睑闭合程度最大的第一帧。</li>
	<li>根据需要，制定处理模糊反应的策略。参见以下示例：
	<ol>
		<li>合理排除部分性眨眼，即眼睑闭合程度未超过约50%的情况。</li>
		<li>排除因背景噪声遮蔽了音调/气流刺激起始时间，或因眨眼反应被遮挡而无法观察的试验，不纳入后续分析。</li>
		<li>在出现多次眨眼的试验中，仅分析试验起始后出现的第一个眨眼反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录刺激起始至眨眼峰值之间的视频帧数，并根据摄像机的采样率将帧数转换为实际时间。</li>
</ol>
6. 呼出气冷凝液反应分类
<ol>
	<li>在检测到出现眨眼反应的试验后，根据眨眼反应相对于刺激 onset 的潜伏期来确定眨眼的类型图2).
	<ol>
		<li>将眨眼定义为一个 惊跳反应 如果它发生在提示音后的前200毫秒时间窗内；这些代表&#160;对听觉音调的反射性反应，或与音调起始时间恰好重合但独立于气流刺激而发生的眨眼。 
		注意：在给予配对（CS + US）或非配对（CS 单独）刺激的试验中，均可观察到惊吓反应，其中声音刺激会被呈现。</li>
		<li>将眨眼定义为一个 躯体感觉反应 如果在气流刺激后出现，则表明角膜对当前头戴装置配置下的气流刺激具有敏感性。这是一种非条件反应（见下文）。</li>
		<li>定义 非条件反应 作为在配对（CS + US）试验中，气流刺激引发的躯体感觉反应，该反应发生在声音起始后超过650 ms的时间点。</li>
		<li>定义 条件反应 眨眼反应的最佳时机与气流刺激相吻合。在配对或非配对试验中，该反应始于声音刺激开始后350至650毫秒之间，表明条件刺激（CS）与非条件刺激（US）之间可能已发生关联学习。</li>
		<li>将一次试验定义为 失败的反应 如果在气流刺激下未检测到眨眼反应，则可在配对（CS+US）试验或躯体感觉试验中观察到此类情况。这些反应表明气流未到达眼睛。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 联合学习的分析
注意：已有多种方法被用于评估联想学习9,10,11（此处简要描述）。研究人员应根据自身的实验设计，对这些方法进行修改或开发新的方法，以确定是否发生了联想学习。
<ol>
	<li>首先，排除未收集到可用数据的试验，例如存在技术错误的试验。</li>
	<li>通过计算所有可能的躯体感觉试验中眼睑眨眼反应所占的百分比，来评估对气流刺激的敏感性。</li>
	<li>通过比较每连续10次试验为一组的条件化反应百分比，评估实验过程中是否发生了联想学习。若在整个实验过程中条件化反应的百分比逐渐升高，则可能表明已发生条件化学习。 
	注意：也可通过建模分析眼睑反应潜伏期随时间的变化，来评估婴儿在实验过程中是否调整了其反应时间。</li>
	<li>评估联想学习是否在不同实验阶段之间或两个实验组之间发生。可采用任意标准来定义是否发生了条件化（例如，在一次实验阶段内条件化反应&#62; 40%）6,9。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

修改与故障排除： 
商用或定制的眼睑条件反射系统应以实验可控的方式向受试者呈现刺激，并能够检测行为反应。尽管这是一种非侵入性操作，但在依从性较差的人群（例如，婴儿）中开展此类实验的技术要求具有挑战性。在动物实验中（如绵羊的条件反射实验），可将头部固定装置物理连接至眼部12,13。年龄较大的儿童可能耐受佩戴带有附加气流输送单元的头带6,7,8，并可通过电视作为分散注意力的手段，鼓励其保持稳定的眼位。虽然可通过在睡眠期间进行条件反射训练以实现对极小婴儿的实验配合14，但接近一岁的较大婴儿通常极易分心，使其成为特别具有挑战性的研究群体。尽管存在困难，部分清醒的一岁婴儿仍可完成眼睑条件反射实验。我们的成功率与文献中先前报道的结果相似（约40%–50%的依从率）9，实验成功可能性可能反映了婴儿在实验当天的情绪和行为特征。
实验方案中的关键步骤： 
我们建议为年龄较小的婴儿采用市售的EBC装置，或如先前所述使用自行组装的气压发生器9,10,11。最初面临的挑战是在整个实验过程中保持气流喷射装置处于正确位置，这需要使用更小且经过改良的头戴部件。对于不配合的婴儿，尤其是试图自行取下头戴部件者，眼部安全尤为值得关注。因此，必须始终密切监控婴儿的状态。部分儿童无法耐受佩戴头带或接受眼部气流刺激（本研究中约占35%），但如果实验方案允许且不会明显干扰婴儿行为，可通过轻柔分散其注意力的方式提高耐受性。对于顺利完成实验的儿童，必须设置仅含气流刺激的试验环节，以确认头戴部件位置正确，因为条件反射缺失或逆转可能源于整个实验过程中气流刺激传递不良所致。
尽管手动视频分析耗时较长，但目前实现对婴儿眨眼反应的自动化测量仍较为困难。商用眨眼条件反射（EBC）设备配备的红外传感器（安装在头带上的气流刺激装置旁边）以每秒1000次的采样率记录角膜的实时反射光强度，通过测量刺激开始后反射光强度的变化即可检测眨眼。反射光强度相对于基线出现显著变化，表明发生了眨眼，可利用自动化分析方法检测并分类眨眼反应。然而，我们及其他研究者9,10,11建议，研究者不应依赖商用EBC设备提供的红外角膜反射测量数据来检测一岁儿童的眨眼反应。尽管该方法可能适用于成年参与者或年龄较大的儿童6,7，但我们无法使用该方法可靠地检测一岁婴儿的眨眼。在此类情况下，整个试验时段内基线反射光强度几乎无变化，表明红外传感器未能检测到眨眼。此外，常可观察到假阳性峰值，这通常由婴儿头部运动导致传感器位置改变所引起。在成人中的初步测试表明，只有当受试者注视水平视线位置或略高处，且气流刺激装置距离角膜1–2 cm时，才能成功检测眨眼反应——而这些条件在婴儿身上难以持续维持。此外，婴儿睑裂较小，可能导致角膜反射光强度降低，使得眨眼检测比在成人或年长儿童中更为困难。
相对于现有方法的意义： 
尽管该方法需要手动进行视频摄像分析，且60 Hz视频的时间分辨率低于1 kHz的反射率测量，但由于视频记录的成功率更高，因此该方法优于红外传感器。虽然角膜气流刺激也通过与商用红外传感器相同的头戴式附件传递，但与红外传感器相比，该刺激传递对位置的依赖性更低，因为气流强度可根据需要进行调整。这避免了频繁调整头带，而频繁调整往往会降低婴儿的依从性。即使能够使用红外传感器获得较高成功率的研究人员，仍可能需要借助视频摄像分析作为支持。对于红外传感器未记录到可检测眼睑闭合反应的试验，视频记录可区分真实反应与无效试验（即，儿童是否正确佩戴气流装置、是否未发生眨眼，或红外传感器是否未能检测到眨眼）。同样，视频记录对于确认假阳性结果也是必要的，因为在试验过程中发生的其他动作也可能产生类似眨眼的伪迹。眼动追踪设备15,16以及眼轮匝肌的肌电图9,10,14是其他可用于眨眼检测的自动化方法，但这些方法超出了本文范围；尽管如此，若缺乏对每次试验中气流装置位置的视觉确认，这些方法很可能也会面临与本文所述红外眼睑闭合检测软件相同的缺陷。
以往关于眨眼条件反射的研究主要集中在较年幼的婴儿，通常为4至5月龄；本研究通过描述适用于较大婴儿（12±1月龄）的技术及其在此年龄段所面临的独特挑战，进一步丰富了该领域的文献。其他研究者也曾对婴儿使用过视频分析技术（单独使用或与肌电图结合）9,10,11,14。本文呈现的结果与既往研究一致，表明逐帧视频分析是检测婴儿眨眼反应的最佳方法，因为肌电图和红外监测在年幼儿童中可能因面部和头部运动而产生干扰。本研究还支持这样一个发现：即使在非常年幼的阶段，婴儿也能够形成条件反射，至少在650毫秒的延迟间隔条件下如此9。
未来应用： 
由于目前仅有少数研究尝试在人类婴儿中进行眨眼条件反射实验，因此在未来实验中应仔细考虑刺激参数。已有研究表明，早在出生后10天即可观察到条件反射17，并在出生后第一个月内至少可检测到该现象14，但在婴儿发育的这一早期阶段，较长的刺激间间隔（例如，1,500 ms）似乎更为有效18。相比之下，接近六个月大的婴儿使用较短的间隔可更可靠地建立条件反射10，尽管其成功率仍低于成人19。本方案中为一岁儿童建议的650 ms音调与气流刺激间隔，同样可成功诱导4至5月龄婴儿的条件反射9,10,11，以及较大年龄儿童的条件反射6,7。这表明眨眼条件反射具有发育阶段依赖性，音调与气流刺激之间的最佳延迟时间随婴儿年龄增长而缩短10，但仍需通过进一步调整本实验方案的额外实验来深入探究这些参数。
该技术的局限性： 
呼出气冷凝液（EBC）的采集在设置上可能具有挑战性，且在每种具体情况下均可能需要进行故障排查。确定条件反射是否发生往往难以界定，最好通过多次试验或多个实验阶段进行观察。例如，其他研究曾采用每10次试验为一个区组内任意设定的40%条件反射率来定义条件反射，并比较连续实验阶段之间的任何变化6,9,10,11。因此，在幼儿中成功完成足够数量的试验以观察到条件反射可能较为困难。
在数据分析方面，一个特殊挑战是将刺激诱发的眼睑闭合与自发性（内源性）眼睑闭合区分开来9。个体之间的自发眨眼频率存在差异，但可能受到环境因素（如室内湿度）以及行为状态的影响。双次眨眼是指在极短时间内（例如，400 ms内）出现两次完整的眼睑闭合20，这可能反映了自发眨眼与反射性（条件性或非条件性）眨眼同时发生。在本研究的数据集中，我们偶尔观察到双次眨眼现象；根据本实验方案，仅记录第一次眨眼的潜伏期。然而，剔除这些试验数据可提高分析结果仅反映刺激诱发眨眼的可信度。
研究人员还需要确定定义条件反应或非条件反应的潜伏期时间窗，以及是将反应潜伏期定义为眨眼起始还是眨眼峰值（眼睑闭合程度最大）的时间点。本文中，我们采取较为保守的标准，将条件反应定义为在配对或非配对试验中，于650毫秒之前达到峰值的眨眼反应，以确保该眨眼是在气流刺激出现之前启动，而非对气流刺激的反应。然而，对于未呈现气流刺激的非配对试验，尤其是当采用眨眼峰值来定义反应潜伏期时，该潜伏期时间窗可适当延长。此处的关键原则是，所有观察实例均须由所有检测人员以相同方式处理，并且该判定标准必须在开始任何数据分析之前预先确定。
综上所述，逐帧视频分析可为评估婴幼儿经典的眨眼条件反射（EBC）反应提供一种可靠且可重复的方法。这些指标为学习行为提供了一种衡量方式，但要全面描述婴儿期的神经发育情况，还需进行综合性的发育评估。

眨眼条件反射（EBC）是一种经典条件反射形式，常用于评估人类和其他动物的学习与记忆能力。传统的EBC范式指的是在无害的“条件刺激”（如听觉音调）与“非条件刺激”（如角膜气流刺激，可引发反射性眨眼，即非条件反应）之间建立习得性关联。通过单独呈现条件刺激并区分眨眼反应为条件反应或非条件反应来评估联想学习；随着时间推移或经过多个实验阶段，条件反应数量的增加可能表明联想学习正在发生。
眨眼条件反射范式可用于识别存在联想学习障碍的个体。延迟性条件反射——即条件刺激（CS）在非条件刺激（US）出现之前开始且与其重叠——由小脑神经回路控制1,2，在患有神经系统疾病（包括精神分裂症3、自闭症4,5和胎儿酒精谱系障碍6,7）的成人和儿童中该功能会受到破坏。从临床角度来看，在婴儿期检测眨眼条件反射可能有助于这些神经系统疾病的早期发现和干预。然而，尽管年龄较大的儿童能够耐受角膜气流刺激6,7,8，并在实验过程中保持稳定的头部/眼部位置，婴儿则依从性较差，而传统的眨眼检测设备和软件尚不足以满足需求。
本文介绍了一种用于检测一岁儿童短延迟瞬目条件反射的简易实验方案，该方案改编自先前文献中描述的方法9,10,11该方案可使用任何能够向角膜输送可控气流脉冲的商用或自制系统来实施。然而，可不使用商用眼睑眨眼检测软件（例如，San Diego Instrument公司的EyeBlink检测系统（用于处理来自红外相机的信号），我们以及其他研究者9,10,11建议采用摄像机录像的逐帧分析方法，以检测和分类一岁婴儿的眼睑眨眼反应。

<table><tbody><tr><td>眨眼条件反射系统</td><td>San Diego Instruments</td><td>型号 #2325-0145-W</td><td>包含便携式气流刺激装置和安装在可调节头带上的红外发射器/接收器；眨眼刺激与反应检测软件；PC 接口</td></tr><tr><td>4K 超高清运动相机</td><td>RV77</td><td>型号 SJ9000</td><td>支持 micro SD/TF 卡，720p 分辨率下以 90fps 录制视频</td></tr></tbody></table>

一岁儿童的经典短延迟瞬目条件反射实验

Classical Short-Delay Eyeblink Conditioning in One-Year-Old Children

经典眨眼条件反射（EBC）是指条件刺激（一种听觉音调）与非条件刺激（对角膜施加气流）之间形成的习得性关联。眨眼条件反射常被用于实验中检测依赖小脑的学习与记忆功能异常，这类功能正是此类联想学习的基础。尽管在成人和较大儿童中使用商用设备进行实验相对简单，但在婴儿中实施眨眼条件反射则更具挑战性，因为婴儿依从性较差，导致设备准确定位困难。为了在一岁婴儿中实现条件反射，可采用定制或改装的商用系统向婴儿角膜输送气流。主要挑战在于如何成功检测并分类行为反应。我们发现，在该人群中，自动眨眼检测方法并不可靠，条件反射实验应通过对辅助摄像机录制的视频进行逐帧分析来完成。该方法可用于研究眨眼条件反射的发育变化，并检验此范式是否能够识别出患有神经系统疾病的儿童。

一岁婴儿眨眼条件反射的可测试性：
用于检测眼睑条件反射的实验装置对一岁婴儿而言具有挑战性。在我们开展的实验中，35%（11名婴儿）未能参与实验，因为他们无法耐受佩戴头带或接受角膜气流刺激n = 31 名婴儿尝试）。约一半（52%） n 16名婴儿完成了或部分完成了第一组50次试验（中位数[IQR] = 22.5 [0 - 50]次试验）。其余婴儿参与了两次实验会话。
获得可靠的实验结果需要在整个实验过程中正确放置头带和气流装置。对于参与实验的婴儿，大多数试验中均可成功向角膜输送气流（77 ± 6% 的气流刺激引发了眨眼反应；n = 13 名婴儿/共尝试 557 次气流试验）。其余试验属于“失败试验”，即婴儿对气流刺激无反应。
图3展示了在两次各包含50次试验的条件反射实验中，气流刺激成功递送的情况。观察到的眼睑眨动次数以气流刺激试验的百分比表示（即，无论是躯体感觉刺激或配对刺激试验）。第一位婴儿在每连续10次试验组成的区组中，眨眼反应逐区组减少，表明头带可能在实验后期位置欠佳。相比之下，第二位婴儿对气流刺激表现出相对良好的敏感性，在后续每个包含10次试验的区组中，至少有90%的气流刺激试验成功诱发了眨眼反应。
使用摄像机分析检测眼睑闭合的成功率： 
手持摄像机通过允许研究人员手动追踪婴儿的眼睛，提供了一种可靠的眼睑闭合反应记录方法。通过逐帧手动分析，可在90 ± 3%的试验中识别出反应（n = 13名婴儿/共608次试验）。其余试验中，婴儿的眼睛在拍摄过程中被遮挡，无法识别。
尽管视频分析需要主观判断，但该方法可可靠地测量从刺激开始到眼睑眨动的潜伏期。我们对两位独立观察者所测得的眨眼反应时间进行分析，结果显示具有良好的评分者间信度，测量值之间的平均差异为28.4 ms，95%一致性界限为±263.9 ms图4: n 由两名观察者分析的4次实验（共94次眨眼反应）。考虑到条件性眨眼反应被定义为发生在300毫秒时间窗内的反应，该方法具有足够的精确度以区分条件性与非条件性反应。需要注意的是，对于存在显著分歧的试验，观察者之间可通过协商后重新评估。
一岁婴儿的眨眼条件反射： 
图5A 和 5B 所示的两个条件反射实验展示了在实验过程中，配对试验和非配对试验中婴儿眨眼反应的潜伏期。第一位婴儿在首次眨眼条件反射（EBC）会话中的眨眼反应在气流刺激开始后达到峰值，且位于定义条件反应的潜伏期时间窗之外。此外，该婴儿对所有非配对（仅声音）试验均未产生反应。这些结果表明，该婴儿在初次接触EBC范式时，尚未学会将声音与气流刺激关联起来。相比之下，参与第二次EBC会话的第二位婴儿通常在气流刺激出现之前就已出现眨眼反应，并对所有非配对试验均有反应，表明该婴儿在经历首次50次试验的会话后已成功建立眨眼条件反射。图5C 展示了一种典型的评估多轮次会话中联想学习的方法6,9,10,11。两位婴儿的条件反应次数以每10次试验为一组进行统计，并表示为每组中所有配对和非配对试验的百分比。在此例中，两位婴儿在实验过程中均表现出联想学习能力几乎没有变化，说明其尚未形成条件反射（婴儿1，会话1），或条件反射已经建立（婴儿2，会话2）。
<img alt="儿童佩戴脑电图帽以在神经科学实验中测量脑部活动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58037/58037fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：一名一岁婴儿参与的眼睑条件反射实验装置。 图中显示了用于支撑气流装置的定制头带。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58037/58037fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="成对/不成对试验示意图；显示试验中的惊跳反应、条件反应和非条件反应；体感性皮肤电反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58037/58037fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：适用于一岁儿童眨眼条件反射实验的刺激与反应定义。（A）在成对试验中，一个持续750毫秒的可听音调（条件刺激 [CS]）与一个持续100毫秒的气流刺激（非条件刺激 [US]）重叠，并在气流刺激结束时终止。眨眼反应根据其相对于刺激开始的时间进行分类（惊跳反应：0–200毫秒；条件反应 [CR]：350–650毫秒；非条件反应 [UR]：650–2,000毫秒）。对于不成对（仅CS）试验，反应定义相同。（B）体感性试验仅给予一次100毫秒的气流刺激（US），在300毫秒时间窗内发生的眨眼被归类为体感性皮肤电反应（SSR）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58037/58037fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="婴儿气流刺激反应图表；50次试验中反应百分比的试验数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58037/58037fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：一岁婴儿眨眼条件反射实验示例，展示对气流刺激敏感性的个体差异。 对气流刺激的敏感性定义为：在每组连续的10次试验中，对气流刺激（无论是作为体感刺激试验还是配对试验给予）产生可观察反应的次数占所有气流刺激试验次数的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58037/58037fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Bland-Altman 图解；反应时间偏差；评估观察者一致性；均值与差值关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58037/58037fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：Bland-Altman 图显示了两位独立观察者通过摄像记录测量的眨眼反应时间的一致性。 灰色线条表示测量值之间的偏差（定义为测量值间差值的均值）以及一致性上下限（LOA，定义为均值差±1.96倍标准差）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58037/58037fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="婴儿反应时间与条件化反应图；试验表现的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58037/58037fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：一岁婴儿眨眼条件化实验示例，展示条件化反应的变异性。 配对（CS + US）试验的眨眼反应时间以黑色圆圈表示，非配对（仅 CS）试验以灰色方块表示。灰色条表示气流刺激的时间，黑色线条表示用于定义条件化反应的 350 - 650 毫秒潜伏期区间。未能引发反应的试验显示在x轴上。（A） 眨眼反应通常落在条件化时间窗之外，且非配对试验未能引发眨眼反应。（B） 反应时间与气流刺激的发生时间基本吻合，非配对和配对试验均引发条件化反应。（C） 实验过程中条件化的发展情况以每连续 10 次试验为一个区组，显示各组中条件化反应的数量（表示为所有配对与非配对试验的百分比）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58037/58037fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种适用于一岁婴儿实验的眨眼条件反射范式。可使用商用或定制设备传递刺激，数据采集与分析应基于视频记录进行。

经典眨眼条件反射（EBC）是指条件刺激（一种听觉音调）与非条件刺激（一种……）之间形成的习得性关联。

本实验的总体目标是通过眼睑条件反射来评估一岁儿童的联想学习能力。眼睑条件反射范式有助于检测某些类型的学习与记忆缺陷。例如，患有胎儿酒精谱系障碍的成人和儿童在眼睑条件反射方面存在缺陷。这是由于小脑神经回路受到破坏所致。眨眼条件反射是指声音刺激与作用于角膜以引发眨眼的气流刺激之间形成的习得性关联。通过两种刺激的反复配对，儿童可能会学会在听到声音时预判气流刺激的到来而提前眨眼。该方法可用于研究神经发育缺陷。尽管在幼儿中实施具有挑战性，但越早发现并治疗这些儿童，他们获得最佳预后的可能性就越大。眼睑条件反射装置可从商业途径获得，也可定制。实验装置需要以下设备：一个能够通过带有压力调节器的空气压缩机向角膜直接输送气流的喷气装置。该装置应连接到一个可调节的头带或帽子上，以便婴儿佩戴。两个带有可调节音量设置的便携式音频扬声器。使用帧率至少为60赫兹的摄像机来记录眨眼反应。通过计算机控制设备，以实现声音和气流刺激的自动施加，并精确控制时序和不同间隔。此处描述的眼睑条件刺激由一个持续750毫秒的声音组成，该声音与一个持续100毫秒的气流刺激重叠，并与其同时结束。为观察随时间变化的联想学习情况，将试验分为5个区组，每组10次，共50次试验。在每个区组中，包含一次仅呈现声音而不给予气流刺激的试验，以便直接评估联想学习效果。在每个区块中，还需包含一次不播放提示音的气流刺激试验。这将有助于确认气流刺激装置的位置是否正确，并验证婴儿是否对气流刺激有反应。在婴儿两侧各放置一个便携式扬声器。将婴儿置于看护人的膝上。一名研究人员吸引婴儿注意力的同时，另一名研究人员可将头带戴在婴儿头上，并调整至合适大小。调整固定气流喷嘴和红外传感器的软管位置，使二者距离儿童眼睛约一至三厘米。开始实验前，需检查气流刺激装置是否处于正确位置。可通过向婴儿眼睛给予一次测试性气流刺激，并观察是否出现眨眼反应来确认。必要时可对头带进行适当调整。商业设备中附带的自动眨眼检测方法在检测婴幼儿眨眼时通常不可靠，因为很难将传感器保持在足够靠近眼睛的位置以检测到眨眼。相反，应采用逐帧视频摄像分析来检测婴幼儿的眨眼反应。为此，在实验过程中应使用手持式摄像机手动追踪婴儿的视线。使用简单的视频编辑软件即可轻松实现对视频录像的逐帧分析。通过音频波形来检测声音或气流刺激的起始时间。为记录眨眼起始时间，需查找眼睛开始闭合的第一个视频帧。研究人员还应注意眨眼的峰值，即眼睛完全闭合的时刻。根据相机的帧率，计算中间帧的数量，并将此反应时间转换为毫秒。条件化反应是指在气流刺激呈现之前即已开始的眨眼。非条件反应是指在声音开始后超过650毫秒出现的、由气流刺激引发的反射性眨眼。此外还会观察到其他类型的反应。例如，惊吓反应是指在声音开始后的前200毫秒内发生的眨眼，代表对听觉声音的反射性反应，或与刺激同时发生的偶然性眨眼。最后，无反应是指在气流刺激后未检测到眨眼的情况。这可能表明气流未能到达眼睛。尽管逐帧视频分析需要一定的主观判断，但该方法可用于可靠地测量从刺激开始到眼睑闭合的潜伏期。我们对94次眨眼反应的比较显示，两名观察者之间具有非常高的吻合度，其差异在250毫秒的同意限范围内。这种变异程度足够低，能够区分条件反应与非条件反应。对于差异显著的反应，应由两名观察者重新评估。不同婴儿之间的反应可能存在显著差异。已建立条件反射的儿童会在气流刺激呈现之前就产生反应。他们也可能在仅呈现声音刺激而未给予气流刺激时眨眼，如红方块所示。然而，部分婴儿在实验过程中未表现出任何条件反射形成的迹象。此处的眼睑闭合反应发生在气流刺激开始之后，表明这些反应属于反射性眨眼。此外，当单独呈现声音刺激时，婴儿并不会预判气流刺激的到来。条件反射最好被描述为在多次试验或多个实验过程中，条件反应次数的变化。获得可靠结果的最重要步骤是在整个实验过程中保持气流装置的正确位置。婴儿应对大多数气流刺激试验产生眨眼反应。在此示例中，随着实验的进行，婴儿对气流刺激的眼睑闭合反应逐渐减弱，表明气流刺激装置未保持在正确位置。如果婴儿无法感知角膜上的气流刺激，则无法实现眼睑条件反射。眼睑条件反射是评估儿童神经发育的一种有效范式。我们发现，在对幼儿使用该技术时，录像并进行后续离线分析是一种更为可靠的方法。

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