Name: Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a purificar e imaginar centríolos de Chlamydomonas em múltiplas orientações para microscopia de super-resolução. Este método permite localizar proteínas em regiões específicas dos centríolos.

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Agradecemos a Pierre Gönczy e o BioImaging & plataforma óptica (BIOP) na École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Suíça, onde as imagens SIM dos centríolos foram adquiridas. Nikolai Klena e Davide Gambarotto são suportados pelo Conselho Europeu de investigação (CEI) Starting Grant (StG) 715289 (sotaque) e Maeva Le Guennec, Paul Guichard e Virginie Hamel por PP00P3_157517 o Swiss National Science Foundation (SNSF). Susanne Borgers é apoiada pela Universidade de Genebra.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Um dos desafios em biologia é para decifrar a localização exacta das proteínas no contexto arquitectónico. O centríolo é uma estrutura ideal para aplicar estes métodos, como a sua arquitectura tem sido estudada utilizando tomografia computadorizada do cryo-elétron, revelando características ultra-estruturais interessantes ao longo de seu comprimento. No entanto, devido às suas dimensões próximo do limite de resolução em microscopia óptica, é difícil localizar precisamente uma proteína por imunofluorescência para uma sub-região estrutural do centríolo usando microscópios convencionais30.
A resolução em microscopia óptica é limitada pela difração de luz que dá, aproximadamente, uma lateral resolução máxima de 200 nm em microscopia óptica24. No entanto, esse limite foi contornado por um dos principais avanços dos últimos 20 anos em microscopia óptica: a invenção dos métodos de resolução super. Essas abordagens podem imagem além dos limites de difração em diferentes resoluções: 120 nm para o SIM, cerca de 50 nm para esgotamento de emissão estimulada (STED) e 20-40 nm para localização de único-molécula microscopia (SMLM)24. Com estes novos desenvolvimentos da microscopia de super-resolução, as sub-regiões estruturais do centríolo são atingíveis. No entanto, na prática, é difícil determinar com precisão a localização de uma proteína de um elemento estrutural para a principal razão que os centríolos maduros existem em apenas 2 cópias por célula e tem orientações aleatórias, o que torna a interpretação de localização difícil. Por esta razão, um protocolo foi criado que permite aos investigadores de super-resolução imagem de um grande número de centríolos, aumentando a chance de observar orientações não ambígua. Importante, como esse método se baseia na utilização de centríolos isolados, estamos fornecendo um método para purificar intacto c. reinhardtii centríolos que contêm centríolos maduros e procentrioles.
Finalmente, devido a gama de orientações de centríolo que pode ser fotografada com este protocolo, análise da único-partícula pode ser aplicada usando software de microscopia eletrônica. Isso resulta na geração de classes médias dos centríolos em uma determinada orientação. Importante, essas imagens 2-D resultantes então podem ser usadas para avaliar a localização de uma proteína específica ao longo o centríolo. Na verdade, esse método pode ser aplicado a imagens de super-resolução duplo-cor, e uma cor que pode ser usada para revelar o esqueleto centríolo (por exemplo, tubulina), enquanto a outra cor pode ser atribuído a uma proteína específica centriolar. Subtraindo-se as médias obtidas com uma cor ou duas cores, torna-se mais fácil registrar uma proteína ao longo do centríolo (proximal, central ou distal). Observe que os dois canais devem ser alinhados com precisão para evitar quaisquer interpretações enganosas. Além disso, as médias de pontos de vista superior vão ajudar a decifrar se uma proteína localiza-se no interior do lúmen centriolar, ao longo da parede do microtubule ou fora o centríolo.
Este método tem a vantagem de determinar a localização de proteínas específicas que pode ser difícil de localizar, caso contrário, devido à rotulagem heterogêneos. Observe que outros métodos para mapear as proteínas dentro os centríolos têm sido descritos em correlativo SIM/SMLM 3D com, por exemplo, avaliar as orientações específicas dos centríolos, determinando o perfil elíptico de um marcador, formando um toro em torno da centríolo por imagem SIM. Usando esse parâmetro, é possível localizar a proteína com uma precisão de 4 – 5 nm30. Note também que o método descrito aqui usa centríolos isolados com procentrioles intacta, um sinal de que a arquitetura de centríolo é mais provável em grande parte conservada. No entanto, não podemos excluir que algumas características arquitectónicas são perturbadas durante a purificação, tais como o diâmetro de centríolo variando com a concentração de cátions divalentes como amplificado com o isolamento do centrossoma humano5.
Uma das etapas críticas do protocolo aqui apresentado é a obtenção de centríolos isolados suficientemente concentrados em diferentes orientações passíveis de Fluo-SPA. Para fazer isso, primeiro assegure a pureza e a eficiência do processo de isolamento centríolo. Uma baixa concentração de centríolos isolados impedirá adequada de imagem e processamento de imagem adicional. Para este fim, nós estamos fornecendo um método para enriquecer o número de centríolos por campo de visão. Dependendo do número de centríolos na fração usada, deve ser ajustado o volume carregado no concentrador, com um volume máximo de 250 µ l.
Importante, este método foi desenvolvido por uma parede celular menos células cw15-C. reinhardtii . Este esforço, a fragilidade da parede celular permite uma adequada da lise das células e, assim, a liberação de seu conteúdo. Este protocolo não é eficiente para o selvagem-tipo c. reinhardtii células, como a parede celular impede a Lise adequada. Estratégias alternativas como sonication ou uma pré-incubação das células com autolysin, uma enzima que pode degradar a parede celular31, teria de ser postas em prática para alterar a parede celular antes da aplicação do protocolo de isolamento aqui apresentado.
Esta configuração pode ser usada com diferentes tipos de microscópios, variando de microscópios confocal convencionais para microscópios de super-resolução alto throughput dedicado. Observe que ao fazer SMLM, uma reserva especial é necessária para a imagem latente adequada e, assim, uma câmara adaptada para uma lamela de 12 mm com a reserva em cima da lamela deve ser usada. Imagem latente subsequente será executada com microscópios invertidos. Se a afinação de microscópio não permite uma lamela de 12 mm, o protocolo aqui apresentado pode ser aplicado a lamelas de 18 mm, usando um tubo de fundo redondo de 30 mL e um adaptador modificado e concentrador. Também é importante a nota que a qualidade da reconstrução final em SMLM dependerá da qualidade da coloração e do anticorpo primário usado, bem como o método de fixação.
Em resumo, estamos fornecendo um método que pode ser aplicado a imagem numerosos centríolos seguidos por Fluo-SPA, que irá gerar médias dos centríolos em diferentes orientações, contribuindo assim para localizar a proteína centriolar com precisão. Importante, esse método pode ser aplicado mais geralmente centríolos isolados de outras espécies, para outras organelas ou grandes conjuntos macromoleculares. Finalmente, a abordagem de preparação de amostra aqui apresentada, combinado com o recente desenvolvimento de algoritmo para análise da único-partícula de fluorescente SMLM dados32, poderia abrir mais melhoria na cartografia molecular de grande macromolecular módulos (assemblies).

O centríolo é uma organela evolutivamente conservada que reside no núcleo do centrossoma em células animais e pode atuar como um corpo basal (referido como centríolos daqui por diante) para cílios modelo ou flagelos em muitos eucariotos1,2. Como tal, centríolos são críticos para processos biológicos fundamentais da célula, que vão desde a montagem do eixo para sinalização de células. Portanto, defeitos na Assembleia centriole ou função têm sido associados com várias patologias humanas, incluindo câncer e ciliopathies3.
Centríolos são nine-fold, simétrico, microtubule triplet-com base em estruturas cilíndricas que são, normalmente, ~ 450 nm de comprimento e ~ 250 nm de largura4,5,6,7. Microscopia convencional e tomografia computadorizada do cryo-elétron de centríolos de diferentes espécies têm revelado que os centríolos são polarizados ao longo do seu eixo longo com três regiões distintas: uma região proximal, um núcleo central e uma região distal5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. importante, cada uma dessas regiões apresenta características estruturais específicas. Primeiro, o lúmen da região proximal 100 nm de comprimento contém a estrutura de estrelinha ligada ao tripleto microtubule através da cabeça de alfinete elemento12. Em segundo lugar, a região central de 300 – 400 nm de comprimento contém fibrosas densidades nas lúmen e características estruturais ao longo da face interna dos microtúbulos: o vinculador em forma de Y, a cauda do túbulo-C e o túbulo-A9de stub. Finalmente, a região distal 50 – 100 nm exibe sub distais e distais apêndices que circundam a parte distal do centríolo5,13.
Nas últimas duas décadas foram marcadas pela descoberta de um número crescente de proteínas centriolar, levando a uma estimativa atual de cerca de 100 proteínas distintas, sendo parte do centríolo14,15,16, 17. apesar destes avanços, a localização exacta destas proteínas dentro o centríolo continua elusiva, particularmente dentro estruturais sub-regiões. Importante, atribuindo uma localização exacta para regiões estruturais do centríolo é crucial para um melhor entendimento da sua função. A este respeito, c. reinhardtii centríolos têm sido fundamentais para ambos os aspectos pelo primeiro delimitando as características estruturais diferentes ao longo do cilindro9,18,19, que então permitiu pesquisadores de correlacionar a localização de um subconjunto de proteínas usando microscopia fluorescente para uma região sub estrutural. Isso inclui, por exemplo, as proteínas Bld12p e Bld10p, que localizar na região proximal e na estrutura do carrinho em particular20,21,22,23. A lista das proteínas subestrutura localizada também inclui POB15 e POC16, duas novas proteínas identificadas por espectrometria de massa que decoram a região do núcleo central de c. reinhardtii centríolos17.
Este documento fornece uma descrição completa do método desenvolvido para isolar e c. reinhardtii centríolos para microscopia de super-resolução subsequentes e único-partícula média da imagem. Para atingir este objetivo, é importante delinear as limitações técnicas que precisam ser superados. Primeiro, a purificação centríolo pode afetar a arquitetura geral, com a estrutura de estrelinha, muitas vezes sendo perdida durante as várias etapas de isolamento9. Em segundo lugar, as dimensões do centríolo estão muito próximos do limite de difração em microscopia óptica. Com efeito, a resolução lateral que pode ser obtida em microscopia confocal é cerca de 200 nm24, semelhante ao diâmetro do centríolo e a resolução no z-axis é sobre 2 – 3 x menor, levando a um volume Anisotrópico. Em terceiro lugar, a heterogeneidade da orientação de rotulagem e centríolo anticorpo poderia limitar a interpretação necessária para localizar uma proteína em uma determinada região sub centriolar. Finalmente, centríolos existem em apenas duas cópias por célula, dificultando a adquirir um grande número de imagens e encontrar uma orientação inequívoca centríolo. Para contornar esses problemas técnicos, desenvolvemos um método que se baseia na aplicação de microscopia de super-resolução em um grande número de centríolos isolados que adotam diversas orientações. Primeiro, nós descreveremos um protocolo para purificar c. reinhardtii centríolos que permite a purificação de centríolos estruturalmente intactos e procentrioles contendo a roda. Em seguida, descreveremos um protocolo passo a passo para concentrar os centríolos lamelas para geração de imagens por convencional ou microscopia fluorescente Super-resolução. Essa etapa importante permite aumentar o número de centríolos fotografada em várias orientações. Finalmente, descreveremos um procedimento para executar uma média de único-partícula em dados adquiridos em microscópios fluorescentes que facilita a detecção de centríolos em diferentes orientações. No total, esse método pode ser aplicado para centríolos de imagem de várias espécies ou outros grandes conjuntos macromoleculares.

<table><tbody><tr><td>Tubulina monoclonal anti-apha de camundongo (clone DM1A)</td><td>Abcam</td><td>ab7291&nbsp;</td><td>diluição 1:300</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>10104159001</td> lamínulas de <td></td></tr><tr><td>12 mm</td><td>Roth</td><td>YX03.1</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de 18 mm</td><td>Roth</td><td>LH23.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fluka</td><td>60355</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fluka</td><td>60230</td><td></td></tr><tr><td>Base</td> <td>TrisBiosolve Chimie SARL</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Carlo Erba Reagentes</td><td>524520</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A-4514</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>63140-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>filtro steritop</td><td>Millipore</td><td></td><td></td>SCGPT05RE</tr><tr><td>sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>TUBOS</td><td>Sigma</td><td>P6757-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>197530010</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A1694,0250</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo (Kimble) 15 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-34</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo (Kimble) 30 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-37</td><td></td></tr><tr><td>suporte para coloração de vidro de cobertura</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>caixa de laboratório de transmissão de poliestireno cristal</td><td>FISHERS</td><td>11712944</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10735086001</tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse de cabra acoplado ao Alexa 488&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>A11029</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>cabra anti-coelho acoplado a Alexa 568</td><td>invitrogen</td><td>A11036</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>meio de montagem</td><td>abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>Tubo, polipropileno de parede fina</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina 1 mg/mL</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti-poliglutamilação modificação mAb (GT335)</td><td>Adipogênio</td><td>AG-20B-0020</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>glicerol meio de montagem com DAPI e DABCO</td><td>Abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubos cônicos</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5811000622</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JS-13.1 rotor de caçamba oscilante</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW 32Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>parafilme</td><td>Bemis&nbsp;</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 com modo Hyvolution</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSRAM L18W/954 LUMILUX&nbsp;</td><td>Papel de filtro Luxe Daylight/ OSRAM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1001325</tr><tr><td>Diluição do anticorpo</td><td></td><td></td> CrSAS-6 / Bld12 <td>1: 300 (Hamel el al., 2014)</td></tr> Câmera CCD <tr><td>Scipion</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>EM (Andor iXON DU897)</td> <td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de chlamydomonas centríolos e isolamento

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centríolos são grandes conjuntos macromoleculares importantes para a boa execução dos processos biológicos fundamentais da célula, como divisão celular, motilidade celular ou sinalização celular. A alga verde Chlamydomonas reinhardtii provou para ser um modelo perspicaz no estudo da arquitetura do centríolo, função e composição de proteína. Apesar de grandes avanços em direção centriolar arquitetura de compreensão, um dos desafios atuais é para determinar a localização exacta do centriolar componentes dentro de regiões estruturais do centríolo a fim de melhor compreender o seu papel na biogênese centríolo. Uma grande limitação encontra-se na resolução da microscopia de fluorescência, o que dificulta a interpretação da localização da proteína nesta organela com dimensões próximo do limite de difração. Para abordar esta questão, estamos fornecendo um método para purificar e um grande número de c. reinhardtii centríolos de imagem com diferentes orientações usando microscopia de super-resolução. Esta técnica permite a transformação de dados por meio de fluorescente single-partícula média (Fluo-SPA) devido ao grande número de centríolos adquirida. Fluo-SPA gera médias de manchado c. reinhardtii centríolos em diferentes orientações, facilitando assim a localização de proteínas distintas em centriolar sub-regiões. Importante, esse método pode ser aplicado para centríolos imagem de outras espécies ou outros grandes conjuntos macromoleculares.

C. reinhardtii Centriole isolamento: Para isolar os centríolos, cw15- c. reinhardtii células foram cultivadas em cultura líquida por vários dias sob a luz e posteriormente peletizadas por centrifugação a 600 x g por 10 min. Pelleted células foram lavadas 1x com PBS e ressuspensão em um deflagellation antes da reserva deflagellation, realizando um choque de pH usando 0,5 M de ácido acético a um pH final de 4,5-4,7 por 2 min(Figura 1). Adição de 1 N KOH foi usada para restaurar o pH a 7,0. Para separar flagelos desanexados de corpos celulares, células deflagellated primeiro foram centrifugadas para remover a maior parte os flagelos. O pellet foi então lavei 2x com PBS e resuspended em 30 mL de PBS antes de carregá-lo lentamente sobre uma almofada de 25%-sacarose (Figura 1B). O tubo foi girado a 600 x g durante 15 min a 4 ° C para remover a maior parte os flagelos de moradia. Após a centrifugação, os corpos celulares foram espalhados na almofada da sacarose (Figura 1C) e recuperados, removendo a cerca de 30 mL do sobrenadante (até a seta vermelha na Figura 1C). A resultante de 20 mL de lavado células foram então resuspended em 20 mL de PBS frio e centrifugadas a 600 x g durante 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e as células foram completamente resuspended em 10 mL de PBS. As células foram transferidas para um frasco de 250 mL e o tampão de Lise foi adicionado às células ressuspensa de uma vez. DNase foi adicionado para a Lise e incubado durante 1 h a 4 ° C. Após uma etapa de centrifugação para remover os resíduos de célula (ver a pelota branca em Figura 1D), o sobrenadante foi coletado e cuidadosamente carregado em uma almofada de 60%-sacarose 2ml antes da centrifugação a 10.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Note que para 100 mL de Lise, 8 tubos de 15 mL foram usados para executar essa etapa, correspondente a 12,5 mL de tampão de Lise carregado em 2 mL de sacarose por tubo. Após a centrifugação, a maior parte do sobrenadante foi removido até 1 mL acima da almofada. A 1 mL de sobrenadante restante foi então coletado com a almofada de 2ml misturado e agrupado para obter um volume final de 24 mL. A piscina foi então carregada em um 40%, 50%, 70%-sacarose gradiente e fiado a 68.320 x g por 1 h e 15 min a 4 ° C. Finalmente, os centríolos isolados foram coletados, fazendo um furo na parte inferior do tubo de centrifugação utilizando uma agulha e as gotas foram coletadas em fracções de 12 x 500 µ l. Devido à alta densidade de sacarose a diferentes, a gota formada muito lentamente no início (70% de sacarose) e, em seguida, mais rapidamente (40% de sacarose).
Imunofluorescência de centríolos isolados Para avaliar a qualidade do processo de isolamento, 10 µ l de cada fração gradiente coletada foi então centrifugado em uma lamela usando um adaptador de suporte lamela (Fig. 2A-2D). Importante, para remover com segurança a lamela, foi projetado um dispositivo ligado personalizado (Figura 2B). Em seguida, as lamínulas foram analisadas por imunofluorescência. Anticorpos contra CrSAS-6(Bld12p) foram utilizados neste estudo para indicar a presença da estrutura do carrinho e α-tubulina (DMA1) para destacar a parede centriolar. Pela contagem do número de centríolos que foram positivos para CrSAS-6 e α-tubulina por campo de visão e então calcular o número total de centríolos por fracções, foi possível determinar quais frações foram enriquecidas por centríolos isolados ( Figura 2F-2 H). Curiosamente, 6 fracções foram enriquecidas por centríolos (Figura 2F e 2G, fracções #1 – 6), com um pico de fração #3, enquanto as últimas fracções não foram, indicando que a purificação trabalhou. Observe que, neste experimento particular, 95% dos centríolos totais foram positivas para CrSAS-6 e α-tubulina na fração #3. Isto indica que mais isolados centríolos mantiveram suas piruetas. Se não há enriquecimento de centríolos é observado nas primeiras fracções, o procedimento de isolamento não funcionou e deve ser repetido. Note que algumas peças flagelar podem ser observadas principalmente nas fracções desprovido de centríolos.
Em seguida, para calcular o número total de centríolos por µ l, o número de centríolo por campo de visão deve ser multiplicado pela relação tal como apresentado na Figura 2H. Então, o número resultante deve ser dividido pelo volume da fração usado para a imunofluorescência para obter o número de centríolos por µ l. Neste procedimento de isolamento específico, a fração mais enriquecida continha cerca de 37 centríolos para uma área de 0,00846 mm2 (com um campo de visão de 92 x 92 µm2). A superfície da seção de tubo era 7,5 mm de raio, com uma superfície total de 176 mm2. A relação correspondente foi, então, 176/0.00846 = 20,803.8, então um total de 769.740 centríolos (37 x 20, 803.8) em 10 µ l. Portanto, o número de centríolos em 1 µ l foi 76.974.
Concentração de centríolos isolados em lamelas: Aumento do número de centríolos por campo aumenta a chance de detecção de orientação centriole inequívoca, bem como aumentando a chance de detectar orientações semelhantes que podem ser usadas para mais procedimentos de cálculo da média das partículas. Como centríolos de frações concentradas são ainda esparsos na lamela, desenvolvemos um acessório de centrifugação para concentrar centríolos no meio a lamela(Figura 3)chamado um concentrador. Observe que um arquivo. STL com as medidas precisas para impressão 3D é fornecido com este manuscrito.
Primeiro, uma lamela de 12mm foi montada sobre o concentrador (Figura 3B). O adaptador foi colocado no topo da lamela e o fundo redondo tubo foi invertido e colocado sobre o adaptador montado e concentrador. O fundo redondo tubo foi então suavemente invertido, permitindo assim que o carregamento da amostra (protocolo passo 4.2). Os centríolos então foram centrifugados a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Depois disso, os centríolos foram submetidos a imunofluorescência e manchados por CrSAS-6/Bld12p e α-tubulina (Figura 3-3E). Importante, sem o concentrador, cerca de 30 centríolos foram vistos por campo de visão (Figura 3C), Considerando que 183 centríolos foram vistos por campo de visão quando o concentrador foi utilizado (Figura 3D-3F). Observe que os centríolos coberto apenas com um disco de 4 mm de diâmetro no meio da lamela. Este resultado demonstra que a etapa de concentração funciona e permite um 6-fold enriquecimento dos centríolos em uma região definida de lamelas, assim facilitando a sua detecção e de imagem.
Único-partícula fluorescente com média de isolados C. reinhardtii centríolos: Aqui, usando microscopia SIM que pode chegar a uma resolução de cerca de 120 nm, centríolos manchados para monoglutamylated tubulina (GT335, Figura 4), uma modificação de tubulina presente em microtúbulos centriolar, foram imagem24. C. reinhardtii centríolos são cerca de 500 nm longa, sempre em pares e muitas vezes encontrado com associados, recentemente duplicada corpos probasal (referidos como procentrioles, daqui em diante) e estriada microtubule-associadas fibras19. Portanto, esta montagem final foi grande cerca de 1 µm. Por esta razão, a fim de imagem os centríolos em sua totalidade, recomendamos adquirir uma Z-pilha sobre os centríolos isolados.
Aqui, após a aquisição, a imagem final foi gerada através da realização de uma projeção de intensidade máxima usando o ImageJ28 (projeção de imagem/pilhas/Z projeto/máxima intensidade, Figura 4B). De tais imagens, realizou-se uma análise da único-partícula usando software de microscopia cryo-elétron para fazer aulas de centríolos com orientações semelhantes, e em seguida uma média foi realizada. Para isso, a cor da imagem foi primeiro invertida a fim de Visualizar melhor os objetos (Figura 4C). Centríolos foram escolhidos manualmente em uma caixa centralizada sobre cada partícula usando o livremente disponível primeira software29 que integra vários programas de software de microscopia eletrônica, tais como Xmipp3 (Figura 4-D). Observe que o tamanho da caixa deve ser definido pelo usuário. Aqui, caixas de 50 x 50 pixels para um tamanho de pixel de 31.84 nm foram usados. Em seguida, todas as partículas foram extraídos (Figura 4E) e alinhadas usando Xmipp3 (Figura 4-F). Em seguida, foi aplicada uma máscara circular de 12 pixels de raio para isolar cada centríolo do centriolar-par (Figura 4G). As partículas foram classificadas em seguida, usando o Xmipp3, para gerar várias médias. Só classe homogênea médias foram mantidas, significando que as partículas que divergem da classe médias foram excluídas manualmente. Essa etapa foi repetida a fim de gerar uma média de quase perfeita para cada orientação escolhida. Depois de cinco iterações, duas classes de médias foram geradas: uma vista superior de 63 objetos (Figura 4H) e um lado vista de 98 partículas (Figura 4eu) de centríolos monoglutamylated. As dimensões do objeto foram determinadas medindo a distância entre picos do perfil do enredo de intensidade ao longo do sinal de monoglutamylation.
Importante, o comprimento da média da classe de visão lateral é 260 nm, com um diâmetro de 250 nm, comparável ao sinal medido monoglutamylated tubulina que foi mostrado para localizar a uma região de 286 ± 33 nm de comprimento dentro do núcleo do centríolo17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figura 1 : Purificação de C. reinhardtii centríolos. (A) é uma representação esquemática de cada etapa, levando ao isolamento de c. reinhardtii centríolos. Ele inclui etapas representativas de protocolo (B) antes e (C) após a centrifugação em gradiente de sacarose-25%. A seta vermelha no painel C indica o volume mínimo para manter após a centrifugação. (D), este painel mostra o sedimento branco de lisados células após a centrifugação. A seta preta indica a pelota. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figura 2 : Configuração de centrifugação para realizar imunofluorescência em isolado centríolos. (A), 10 µ l de cada fração coletada é diluído primeiro em 100 µ l de 10mm K-PIPES (pH 7,2). (B) esta é uma representação esquemática dos dispositivos centrifugação, englobando um tubo de fundo redondo de 15 mL, uma lamela de 12 mm, um adaptador para a lamela e um dispositivo feito por medida enganchado para recuperar a lamela após a centrifugação. Painéis C e D mostram desenhos explicando como recuperar a lamela após a centrifugação. (C) Coloque a ferramenta de gancho no furo presente na extremidade ranhurada do adaptador e (D) Puxe delicadamente. (E) Estas são fotos da câmara úmida, necessárias para realizar a imagem latente de imunofluorescência. A seta indica o sentido do lamela de 12 mm. (F) Estas são imagens confocal representante em 63 X (zoom 2) de fracções gradientes #1-8, coletados durante o processo de purificação e manchado por CrSAS-6 (vermelho) e α-tubulina (verde). As inserções correspondem à região indicado por uma caixa branca nas exibições de baixa ampliação. Barra de escala = 10 µm. (G) este é um gráfico que representa o número de centríolos positivos para CrSAS-6 e α-tubulina por campo de visão em cada fração. Observe o enriquecimento em fracções #1-6. O número médio de centríolos por campo em cada fração: #1 = 16,3 ± 4,7, #2 = 24,0 ± 4,6, #3 = 37,0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11,4, #5 = 14,3 ± 2,1, #6 = 13,7 ± 9,3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = ± 0.0 0.0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = ± 0.0 0.0. Para cada fração, 3 campos aleatórios foram fotografados. Observe que, quando contar a fração mais enriquecida #3, encontramos que 95% dos centríolos são positivas para CrSAS-6 e α-tubulina (n = 205 centríolos). (H), A relação entre o número de centríolos presentes na área de medição das micrografias é usada para calcular o número total de centríolos presentes na área do tubo. O número de centríolo por µ l pode ser calculado a partir 10 frações µ l originalmente centrifugado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figura 3 : Centríolos isolados são centrifugados usando concentradores. (A), este painel mostra os dispositivos de centrifugação necessários para concentrar os centríolos em lamelas antes da imunofluorescência, incluindo um tubo de fundo redondo de 15 mL, um concentrador, uma lamela de 12mm e um aparelho de adaptador de suporte. (B), este painel mostra as etapas para montar o dispositivo de centrifugação. Painéis C-E mostram imagens confocal de centríolos manchados por CrSAS-6 (vermelho) e α-tubulina sem (verde) (C) ou (D-E) com o concentrador. As inserções correspondem à região indicado por uma caixa branca nas exibições de baixa ampliação. Barra de escala é de 10 µm. Note que os centríolos estão enriquecidos no meio a lamela (linha pontilhada representa a borda da área concentrada). (F) este gráfico representa o número de centríolos por campo de visão sem e com o concentrador. Foram analisados cinco aleatórios campos de visão. É o número médio de centríolos, sem concentrador, 29,8 ± 2,9 e com o concentrador, 182.6 ± 11,5, P &lt; 0,0001. A significância estatística foi avaliada por um unpaired t-teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figura 4 : Único-partícula em média na isolada C. reinhardtii centríolos. (A), este painel mostra Z imagens de pilha de centríolos manchado com GT335 e adquiridos usando um microscópio SIM. (B) estes painéis mostram uma projeção de Z de intensidade máxima das imagens empilhadas. Barra de escala = 1 µm. (C), estes painéis mostram uma imagem representativa com um contraste invertido. O baixo-relevo representa um zoom-in para visualizar melhor os centríolos. (D), partícula de mostrar estes painéis colheita. O baixo-relevo indica como as partículas foram escolhidas. (E) são exemplos de 5 extraído partículas. (F), este painel mostra as partículas após o alinhamento. (G), este painel mostra as partículas depois de aplicar uma máscara. Painéis de H e eu mostram dois classe médias: (H), um top view (63 partículas) e (eu) uma vista lateral (98 partículas). As setas duplas indicam as dimensões do sinal GT335. Barra de escala = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 
Arquivo suplementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo complementar 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Nós desenvolvemos uma estratégia para purificar e um grande número de centríolos em diferentes orientações favoráveis para microscopia de super-resolução e único-partícula média da imagem.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo centrílo, como a localização de proteínas para uma região específica do centriole. A principal vantagem dessas técnicas que fornecemos os meios para concentrar centriole para obtê-los em múltiplas orientações. Embora este método possa fornecer insights sobre a biologia centriole das Clamídias, ele também pode ser aplicado a outro sistema, como centrítrios humanos isolados e paramecium.Demonstrando o procedimento estarão o doutorando Nikolai Klena, outro doutorando Maeva Le Guennec e o pós-doutor no laboratório Davide Gambarotto. Para iniciar este procedimento, primeiro preparem todos os meios de comunicação e cultura das células C.Reinhardtii, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira as células preparadas para tubos cônicos de 50 mililitros e centrifuá-las a 600 vezes g por 10 minutos.Lave a pelota uma vez com 50 mililitros de 1x PBS e gire as células novamente a 600 vezes g por 10 minutos. Use uma pipeta para resuspensar a pelota em 100 mililitros de tampão de deflagellação de temperatura ambiente. Coloque o béquer em um agitador magnético, e adicione lentamente 0,5 ácido acético molar a um pH final de 4,5 a 4,7.Deixe essa mistura incubar em temperatura ambiente por dois minutos. Depois disso adicione lentamente gotas de um hidróxido de potássio normal para restaurar o pH para 7.0, transfira as células para tubos de 50 mililitros e centrifuá-las a 600 vezes g por 10 minutos, para remover qualquer flagela separada. Descarte o supernatante e guarde a pelota no gelo até estar pronto para lavar.Quando estiver pronto, lave a pelota duas vezes usando 50 mililitros de 1x PBS a quatro graus Celsius por lavagem. Gire a pelota lavada a 600 vezes g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Resuspend a pelota em 30 mililitros de 1x PBS.Em seguida, carregue lentamente a suspensão em uma almofada de 20 mililitros de 25% de sacarose, sem misturar. Gire a 600 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos para remover qualquer flagela restante e espalhar as células na sacarose. Usando um aspirador, aspire cuidadosamente o supernascida mantendo apenas o fundo mais de 20 mililitros.Lave a sacarose restante adicionando 20 mililitros de 1x pbs frio. Centrifugar a 600 vezes g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Resuspenja a pelota em 10 mililitros de 1x PBS a quatro graus Celsius, certificando-se de que não há aglomerados na solução.Transfira a pelota resuspended para uma nova garrafa de 250 mililitros, adicione o tampão de lise, complementado com 5.000 unidades de DNase, para a garrafa contendo as células. Incubar a quatro graus Celsius por uma hora, enquanto mistura a cada 15 minutos invertendo cuidadosamente a garrafa. Transfira as células líricas para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífuga a 600 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.Usando uma pipeta, colete o supernasal e carregue-o em um tubo de fundo redondo de 30 mililitros no gelo contendo dois mililitros de 60% de almofada de sacarose. Centrifugar isso a 10.000 vezes g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, aspire o supernatante até um mililitro acima da almofada de sacarose.Observe a interface amarela entre o mililitro de supernanato restante, e os dois mililitros de almofada de sacarose. Com uma ponta P1000 cortada, misture delicadamente o restante do supernatante com a sacarose. Acumule todas as almofadas de sacarose e guarde-as no gelo.Em seguida, prepare um gradiente de 40% a 70% de sacarose em um tubo de polipropileno de paredes finas de 38,5 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto. Carregue lentamente as interfaces agrupadas no gradiente. Equilibre os tubos com o tampão K-PIPES de 10 milômlares e a centrífuga a 68,320 vezes g e quatro graus Celsius por 75 minutos.Depois disso, use uma agulha de 0,8 milímetros para fazer um furo na parte inferior do tubo, certificando-se de não perturbar as diferentes camadas de sacarose. Use este orifício para coletar 12 frações de microliter a quatro graus Celsius. Usando uma ponta P200 cortada, prepare uma alíquota adicional de 10 microliter de cada fração a ser usada durante a imunofluorescência.Em seguida, congele as frações em nitrogênio líquido. Para começar, coloque uma tampa estéril de 12 milímetros na extremidade inferior rebaixada do concentrador, certificando-se de manter o lado revestido de PDL para baixo. Coloque o adaptador diretamente em cima, para tampar o deslizamento de tampa.Em seguida, inverta o tubo de fundo redondo e coloque-o sobre o concentrador, o deslizamento e o adaptador. Usando pinças, empurre suavemente o conjunto até chegar ao fundo do tubo e, em seguida, inverta o tubo. Adicione 10 milimilitos de tampão K-PIPES até atingir a parte superior do concentrador.Certifique-se de que não há bolhas no cilindro central do concentrador. Adicione suavemente 100 microliters de 10 mililitros de tampão K-PIPES a uma das alíquotas da fração centrilar enriquecida e misture completamente usando uma pipeta P200. Em seguida, remova 100 microliters de tampão K-PIPES do centro oco do concentrador e adicione 100 microliters da mistura de fração tampão, certificando-se de que o conteúdo permaneça no centro oco do concentrador.Gire a 10.000 vezes g por 10 minutos em uma centrífuga que é pré-resfriada a quatro graus Celsius. Depois disso, use pinças para remover o concentrador. Insira um dispositivo fisgado à mão no orifício presente na borda ranhulada do adaptador e levante suavemente para recuperar a mancha de cobertura.Uma vez que ele atinge a parte superior do tubo, use um dedo enluvado para prender a borda do adaptador e use pinças para remover o deslizamento de tampa, tendo em mente qual lado do deslizamento contém centríclicos. Em seguida, realize a fixação e a coloração da imunofluorescência dos centríse concentrados. Para começar, incubar as tampas com os centrículos na caixa de laboratório de transmissão de poliestireno de cristal preparado preenchida com 100% de metanol a menos 20 graus Celsius por 5 minutos.Usando pinças, transfira as tampas para uma caixa de laboratório transparente cheia de 50 mililitros de 1x PBS. Deixe os slides lavarem no PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, pipeta 60 microliters de anticorpos primários se misturam em um pedaço de envoltório de selagem de laboratório em uma câmara umidificada.Coloque cuidadosamente as tampas em cima da mistura de anticorpos com os centrículos voltados diretamente para a queda. Deixe as tampas incubarem por 45 minutos. Depois disso, remova as tampas e lave-as em uma caixa contendo PBS por cinco minutos.Incubar as tampas lavadas por 45 minutos, com anticorpos secundários em PBS 1%BSA e 0,05% Tween-20. Remova as tampas e lave-as por cinco minutos em uma caixa contendo PBS. Usando um meio de montagem anti-desbotamento regular, monte a mancha de cobertura em um slide.Em seguida, imagem os centrículos isolados em um microscópio confocal em um objetivo de óleo 63X com um N.A.de 1.4, enquanto aplica a desconvolução. Configure a posição superior e inferior da pilha Z acima e abaixo do sinal centriole, respectivamente, e adquira uma grande pilha de imagens que compõem o sinal centriole total. Projete a pilha e execute a média de partículas únicas conforme descrito no protocolo de texto.A imunofluorescência representativa revela que seis frações são enriquecidas para centrículos isolados, com pico para a fração número três, enquanto as duas últimas frações não são, indicando que a purificação é bem sucedida. Apenas cerca de 30 centrículos são vistos por campo de visão sem o concentrador, enquanto 183 são vistos com o concentrador. Isso demonstra que o passo do concentrador é bem sucedido, e permite um enriquecimento de centrículos seis vezes em uma região definida, facilitando a detecção e imagem deles.A microscopia de super resolução é então usada para imagem centríles manchadas de tubulina monoglutamata, e o software é usado para gerar uma média quase perfeita para cada orientação escolhida. Após cinco iterações, duas classes de médias foram geradas de centrírioles monoglutamatados: uma visão superior de 63 objetos e uma visão lateral de 98 partículas. O comprimento da média da classe de visão lateral é de 260 nanômetros com um diâmetro de 250 nanômetros, comparável ao sinal de tubulina monoglutamilado medido que é visto para localizador dentro do núcleo do centriole.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter o centriole isolado no gelo e congelá-los após o isolamento. Após esse procedimento, outro método, como microscopia crio-elétron e espectrometria de massa, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como a arquitetura nativa do centriole ou a composição da proteína centriola.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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