Identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de transfert de Southern et la réaction en chaîne par polymérase

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie moléculaire et cellulaire, comme l’identification d’événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est précise, fiable et largement utilisée. Ainsi, cette méthode peut fournir un aperçu de l’identification des événements de recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires de souris.

Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que les cellules génétiquement modifiées ou les animaux. En général, les nouveaux individus à cette méthode auront du mal parce qu’il faut beaucoup de temps et implique plusieurs étapes. Pour chaque ANDG, mélanger 30 microlitres de 10 x tampon pour DRA un, trois microlitres de DRA un et 10 microgrammes de gDNA par échantillon.

Ajouter de l’eau jusqu’à ce que le volume final soit de 30 microlitres et d’incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour digérer les GDA. Préparer un gel électrophoresis 1% agarose avec du bromure d’éthidium. Chargez les échantillons précédemment acquis avec une échelle KB sur le gel, et exécutez-le à 30 à 40 volts pendant la nuit.

Le lendemain, tremper le gel dans un plateau contenant une solution d’acide chlorhydrique de 0,2 newton. Utilisez un shaker pour secouer doucement le plateau pendant 20 minutes à température ambiante. Transférer le gel sur un plateau contenant une solution de dénaturation de l’ADN.

Agiter doucement pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez le gel dans un plateau contenant une solution neutralisant l’ADN. Et secouez-le doucement pendant 20 minutes à température ambiante.

À l’aide d’un système de transfert rapide vers le bas, transférer les AND du gel à la membrane. Ensuite, assemblez le buvard turble et la pile de ballonnement comme indiqué dans les instructions fournies par le fabricant. Après cela, sortez la membrane et lavez-la avec deux citrate de sodium salin X pendant une minute.

Absorbez le liquide avec des tissus, puis utilisez un lien croisé UV pour relier l’ADN à la membrane. Pour commencer à étiqueter les sondes d’ADN avec de la radioactivité, ajoutez les ADN de sonde dénaturés par la chaleur au tube contenant les perles prêtes à l’étiquetage de l’ADN. Pipette de haut en bas pour mélanger.

Et ajouter cinq microlitres de triphosphate de désoxycytodine étiquetés radioactivement. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Purifiez les sondes étiquetées à l’aide de micro colonnes G 50 selon les instructions fournies par le fabricant.

Utilisez un compteur de scintillation pour mesurer la radioactivité. Pour commencer à hybrider les membranes avec les sondes étiquetées, placez la membrane dans le tube d’hybridation. Ajoutez la solution mixte de pré-hybridation.

Placez le tube dans le four d’hybridation et laissez la pré-hybridation se poursuivre à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, retirez le tube du four et versez la solution de pré-hybridation dans un tube de 50 millilitres. Ajouter la sonde dénaturée et mélanger délicatement.

Pour enlever les sondes non hybridées, placez la membrane dans un plateau contenant un citrate de sodium salin X avec 0,1 % de SDS et secouez doucement à 55 à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après cela, envelopper la membrane avec une pellicule plastique et la fixer dans la cassette d’exposition. Dans une pièce sombre, exposer la membrane à deux feuilles de film à rayons X.

Développez le film pour visualiser les résultats. Déterminez si un clone ES correspondant est celui désiré avec la cible de recombinaison ou non, selon la taille des bandes d’ADN détectées par les sondes. Dans cette étude, le ballonnement méridional et le PCR sont utilisés pour identifier les événements RH qui se produisent dans les cellules ES de souris pour la génération de NM deux modèles génétiques de souris de remplacement utilisant la technologie de ciblage à base de RH basée sur les cellules ES.

Parce que les ADN génomiques sont découpés en de nombreux fragments de longueurs différentes, ils affichent un frottis comme le statut sur le gel d’ADN. Ceci suggère une digestion complète des DNAs génomiques. Comme dernière étape du ballonnement sud, les signaux d’une sonde étiquetée radioactivité hybridant avec un fragment d’ADN cible sont montrés sur le film.

L’apparition de bandes attendues reflète l’apparition d’événements RH chez les clones ES. Selon le prédesignat de l’étude, les clones ES avec allèle muté ont deux bandes de taille distinctes. Alors que les clones es de type sauvage n’ont qu’une seule bande, ce qui suggère que les clones ES désirés sont hétérozygotes.

Suite à la réaction PCR, les produits PCR peuvent être analysés sur le gel ADN. Si une bande NPCR spécifique de la bonne taille est observée, cela suggère la survenue d’événements RH qui peuvent être confirmés par séquençage de cette bande PCR. L’implication de cette technique s’est étendue à la thérapie de mutation ponctuelle d’identification parce que la base est identique.

Tout en essayant cette procédure est important de se rappeler d’être patient et prudent. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la microinjection de la cellule ES en blastocystes peuvent être effectuées afin de répondre à une question supplémentaire comme la formation d’animaux chimériques. À l’arrière de son développement, cette technique a ouvert la voie au chercheur dans son domaine de la biologie moléculaire et cellulaire pour explorer la fonction d’un gène spécifique ou la conséquence d’un gène muté chez la souris ou au-delà.

N’oubliez pas que travailler avec l’étiqueteur de radioactivité P32 DCTB peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le blindage avec une carte de protection devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.