qkat: 杀手细胞免疫球蛋白样受体基因的定量半自动分型

此方法可以回答有关NK细胞受体遗传学的关键问题，如单体型多样性，以及这与疾病的关系。此方法的可视化演示将有助于在实验室中设置协议，包括自动化过程和数据分析。这种技术的主要优点是，与传统方法不同，qKAT代表定量KIR自动打字，是高通量，它提供基因拷贝数。

qKAT 可以提供对疾病关联的认识。这项技术对艾滋病毒和丙型肝炎、癌症、干细胞移植和妊娠疾病等病毒感染的治疗可能有用。qKAT还可用于研究种群遗传学，以及探索KIR和HLA分子之间的表达和功能相互作用。

qKAT由10种多路复用反应组成，这些反应特别针对两个KIR基因和一个参考基因的外向。在此协议中，特定底基因被设计为检测给定基因的等位基因，PCR结果在短孔中。在此之后，使用双标记特定水解探头实时监控 PCR 扩增。

拷贝数分析使用目标KIR基因的相对定量来参考基因。qKAT 被设计并设置为高通量技术。因此，每种反应都可以在1000个样本上进行。

以下步骤显示了每个 96 井 DNA 板的制备和电镀所涉及的步骤。首先，在量化DNA后，稀释96井深井板中的DNA。至少包括一个包含已知副本编号的控件示例和一个非模板控件。

以 450 gs 离心板两分钟。然后，将四分之一酸的每个样品分配到 384 孔 qPCR 板中。之后，在室温下将DNA在清洁区域干燥24小时。

要为 10 个 384 孔板设置一个 qKAT 反应，首先在 4 摄氏度下解冻 qPCR 缓冲液、引头和探针等分。根据文本协议在冰上准备主混合。然后，使用多通道移液器将主混合均匀地分布到 96 井深井板上。

将主的 9.5 微升与干燥的 gDNA 样品混合到板的每个井中。在此之后，用铝箔密封板，并立即将其存放在摄氏四度。如果点胶主混合在多个 384 井 DNA 板上，请记住进行短水洗涤以清洁液体处理系统的针头。

将板与gDNA样品在450克离心3分钟。然后，在4摄氏度下孵育板，以重新消耗DNA并消散任何气泡。孵育板过夜后，重复离心以消散任何气泡。

然后，将板放在冷却的存储坞中。将 qPCR 机器连接到微孔板处理程序。然后，根据文本协议对微孔板处理程序进行编程。

运行完成后，让机器人从 qPCR 机器收集板并将其放在丢弃的扩展坞中。完成放大后，打开 qPCR 软件。在"导航器"选项卡下，打开已保存的板的反应实验文件。

接下来，打开"创建新分析"窗口，为第二个派生 Max 方法选择适当的设置。然后选择"滤芯"，确保为 STAT6 收集的数据被选中。选择适当的颜色补偿。

单击"计算"，然后单击"保存文件"。要使用拟合点方法分析数据，请打开"创建新分析"窗口，然后为"拟合点"方法选择适当的设置。然后，为 STAT6 选择正确的滤镜和颜色补偿。

设置杂色带以排除背景杂色。在此之后，打开"分析"选项卡，将拟合点设置为三个，然后选择"显示拟合点"。保存更改并重复与适合点的适当设置和 KIR 基因的第二个衍生分析的步骤。

打开 qPCR 软件中的"导航器"选项卡，然后选择结果批处理导出。然后，打开包含实验文件的文件夹，然后将它们传输到窗口的右侧。单击"下一步"，然后选择导出文件的名称和位置。

在此之后，选择兴趣的分析类型，然后单击"下一步"。在单击"下一步"开始导出过程之前，请确保文件、导出文件夹和分析类型的名称正确。当导出状态更改为"确定"时，屏幕将自动移动到下一步。

确保所有选定的文件已成功导出，然后单击"完成"。然后使用文本协议中的脚本将导出的板拆分为单个反应，并将文件转换为可通过复制编号分析软件可读的软件。接下来，打开复制编号分析软件并选择导入实时 PCR 结果文件以加载脚本创建的文本文件。

最后，选择"分析"，然后通过选择最频繁的样本拷贝编号进行分析。在此协议中，半自动键入或 qKAT 用于复制数字类型 KIR 基因。KIR2DL4 最常见的副本编号是两个副本，而 KIR3DS1 最常见的副本编号为零。

在尝试此程序时，确保精确量化DNA、执行冰上的所有步骤以及确保试剂被光覆盖是极其重要的。对于不符合 KIR 基因已知 LD 规则的样本，对原始数据进行彻底检查也很重要。按照这个程序，可以执行其他方法，如测序，以回答其他问题，例如，融合基因的存在，或新的等位基因的识别。

该方法开发后，为免疫遗传学领域的研究人员探索KIR在NK细胞生物学、抗病性和人类生殖中的作用铺平了道路。