Mesurer la stabilité enzymatique par calorimétrie isotherme de Titration

L’utilisation d’enzymes comme catalyseurs dans les réactions peut réduire la quantité d’énergie nécessaire à la réaction et réduire les sous-produits toxiques. Cependant, l’utilisation d’enzymes dans l’industrie est limitée, parce que les enzymes ne sont pas stables et peuvent être coûteuses. Ce protocole pourrait réduire le temps qu’il faut pour déterminer si les conditions sont délétères à l’activité enzymatique, ou si les modifications apportées à l’enzyme ont augmenté sa stabilité.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle nécessite moins d’heures d’homme que les analyses traditionnelles de stabilité enzymatique. En outre, ce protocole peut être utilisé avec un large éventail d’enzymes, car il peut être utilisé avec n’importe quelle réaction qui libère ou absorbe la chaleur. Pour commencer, préparez un tampon d’acétate de sodium molaire de 0,1 molaire.

Mesurez 800 millilitres d’eau distillée dans un bécher gradué de 1000 millilitres. Ensuite, pesez 8,2 grammes d’acétate de sodium anhydre et ajoutez-le au bécher. Déposer le bécher sur une plaque à remuer.

Placer une tige de remuer dans le bécher et allumer la plaque remuer pour la remuer jusqu’à dissolution complète. Lorsque l’acétate de sodium anhydre est complètement dissous, utilisez un compteur de pH calibré pour mesurer le pH de la solution. Utilisez une pipette pour ajouter 1 acide chlorhydrique molaire ou hydroxyde de sodium en conséquence pour obtenir le pH désiré à 4,6.

Ajouter de l’eau distillée dans le bécher jusqu’à ce que le volume total atteigne 1000 millilitres. Pour préparer la solution enzymatique, dans un cylindre gradué de 15 millilitres, mesurez 8 millilitres du tampon d’acétate de sodium molaire de 0,1. Ensuite, ajoutez la solution tampon dans un tube conique de 15 millilitres avec de l’enzyme, et secouez vigoureusement jusqu’à ce que l’enzyme se soit dissoute.

Ajouter plus de solution tampon jusqu’à ce que le volume total atteigne 10 millilitres. Conserver la solution enzymatique à 4 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour préparer la solution de substrat, peser le substrat et le placer dans un bécher en verre de 100 millilitres.

Utilisez un cylindre gradué pour mesurer 20 millilitres de la solution tampon, puis ajoutez-le au bécher en verre. Placez le bécher sur une plaque à remuer et placez une tige magnétique dans le bécher. Allumez le feu et ajustez la vitesse d’agitation en conséquence.

Laisser continuer l’agitation jusqu’à ce que le substrat se soit dissous. Verser la solution de substrat dans un tube conique de 15 millilitres et ajouter le tampon d’acétate de sodium préalablement préparé, jusqu’à ce que le volume total soit de 45 millilitres. Agiter le tube pour mélanger.

Conserver la solution de substrat à température ambiante jusqu’à utilisation. Sur l’ordinateur, ouvrez ITC Run et cliquez sur configuration. Cliquez sur la vitesse d’agitation, et réglez à 350 rpm.

Vérifiez que la taille de la seringue est de 50 microlitres. Réglez la température à 55 degrés Celsius, et appuyez sur mise à jour. Attendez au moins une heure avant de procéder, pour laisser suffisamment de temps à l’instrument ITC pour se réchauffer ou se rafraîchir au besoin.

Avant de charger l’enzyme, assurez-vous que la cellule de référence est chargée de 350 microlitres d’eau distillée. Pour nettoyer la cellule de l’échantillon, remplissez la seringue de chargement de 500 microlitres de solution de nettoyage à 2 %. Insérez soigneusement l’aiguille dans la cellule de l’échantillon, remplissez la cellule et retirez lentement le liquide à l’aide de la même seringue.

Jeter le liquide dans un bécher. Répétez cette étape deux fois avec 2 pour cent de solution de nettoyage, trois fois avec 70 pour cent d’éthanol, puis laver dix fois avec de l’eau distillée. Après le nettoyage de la cellule de l’échantillon, remplissez la seringue de chargement de 450 microlitres de solution enzymatique.

Insérez soigneusement l’aiguille jusqu’au fond de la cellule échantillonnée et appuyez lentement sur le piston jusqu’à la ligne de 100 microlitres pour empêcher la formation de bulles d’air. Ensuite, lavez la seringue de titration de 50 microlitres avec de l’eau distillée trois fois en plaçant la pointe de l’aiguille dans l’eau pour prendre lentement l’eau dans la seringue, puis en distribuant l’eau dans un récipient à déchets. Rincer avec la solution de substrat trois fois pour enlever l’eau résiduelle.

Après cela, remplissez la seringue de titration avec la solution de substrat en tirant la solution jusqu’à ce que la seringue soit pleine sans bulles d’air. Avec la seringue encore dans la solution de substrat, retirez le piston et laissez environ 2 microlitres d’air pénétrer dans le haut de la seringue et réinsérer le piston. Retirer la poignée de burette de l’ITC, placer la seringue à l’intérieur de la poignée de burette et visser jusqu’à ce qu’elle soit serrée.

Essuyez le bout de la seringue de titration avec un tissu sans peluche, puis placez soigneusement la poignée de burette dans l’instrument ITC, et verrouillez-la en place. Pour la configuration de l’expérience, sélectionnez titration incrémentielle. Cliquez sur insérer pour configurer les injections.

Réglez l’intervalle d’injection à 5 400 secondes, le volume d’injection à 4 microlitres et le nombre d’injections à quatre. Appuyez sur OK pour confirmer les paramètres. Dans la boîte d’équilibrage, sélectionnez l’équilibre automatique et les grandes chaleurs attendues.

Réglez la ligne de base initiale à 300 secondes. Pour démarrer la course, cliquez sur le symbole de démarrage à côté de la vitesse d’agitation, puis cliquez sur démarrer, qui est situé à côté du symbole clé. Enregistrez le fichier et laissez l’instrument s’exécuter.

Pour analyser les données, ouvrez le fichier dans Nano Analyze. Cliquez sur les données et sélectionnez les colonnes de données. Sélectionnez toutes les données, copiez, puis coller les données dans Microsoft Excel.

Ajustez 0 ligne de base en ajoutant la valeur requise à 300 secondes pour en faire 0. Appliquez cette correction à l’ensemble de la colonne de valeurs de taux de chaleur. Ensuite, tracez des graphiques des valeurs minimales ou maximales par rapport au moment où la valeur s’est produite pendant la titration.

Dans ce protocole, les traces de données ITC de l’activité de la lactase sont montrées avec quatre injections séquentielles de lactose dans une solution de lactase dans le tampon de pH 4.6 à 55 degrés Celsius, 45 degrés Celsius, 35 degrés Celsius, et 25 degrés Celsius. Un aucun contrôle d’enzyme n’a été exécuté à 55 degrés Celsius pour la chaleur du mélange. Pour chaque injection d’enzyme, il y a une chaleur exothermique initiale de mélange, et plus tard, l’hydrolyse endothermique catalysée de la lactase du lactose se produit jusqu’à ce que la réaction soit accomplie, et le taux de chaleur retourne à la ligne de base.

Le maximum endothermique minimum après chaque injection, est un peu moins que l’injection précédente en raison de la diminution de l’activité enzymatique. Comme prévu, la stabilité enzymatique de chaque injection diminue avec l’augmentation de la température. L’expérience de contrôle montre que l’activité de la lactase à 25 degrés Celsius a eu une diminution de 8 pour cent de l’activité enzymatique, due à la dilution après quatre injections.

Considérant la quatrième injection montre une diminution de 73 pour cent de l’analyse, la perte réelle de l’activité enzymatique était donc de 65 pour cent. Ainsi, la dilution de la lactase a résulté de chaque injection, a eu un effet relativement petit de 11 pour cent sur l’activité enzymatique. Il est important que le tampon utilisé pour fabriquer les solutions enzymatiques et substrats soit apparié le plus étroitement possible.

L’inadéquation du pH ou de la concentration peut entraîner une plus grande chaleur de mélange qui peut masquer la chaleur de réaction. Vous pouvez appliquer ce protocole pour étudier les enzymes et déterminer leur stabilité en mesurant le taux de chaleur libérée ou absorbée au cours d’une réaction.