Name: 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 인간 PBMC를 이용한 인간화 제종이식 마우스 모델 수립 방법으로 면역종양학 연구를 수행하세요. 이 프로토콜은 경제적이고 재현성 높은 인간 면역 재구성을 가능하게 합니다.

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우리는 도움이 토론에 대한 우리의 실험실의 구성원에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 보조금 협정 번호에 따라 베이징 시 과학 기술위원회의 생물 의학 및 생명 과학 혁신 및 재배 연구 프로그램에 의해 지원되었다. Z151100000039915070 (프로젝트 "새로운 면역 종양학 항종양 약물 BGB-A317에 대한 전임상 연구"), 또한 전임상 연구를위한 내부 회사 자금 조달에 의해 부분적으로 지원되었다.

인간 참가자와 관련된 연구에서 수행된 모든 절차는 BeiGene 및/또는 국가 연구 위원회의 윤리 기준과 1964년 헬싱키 선언 및 그 이후의 개정 또는 비교 가능한 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 고지된 동의는 연구에 포함된 모든 개별 참가자로부터 얻어졌다. 동물과 관련된 연구에서 수행 된 모든 절차는 BeiGene의 내부 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜은 인간화된 NOD/SCID 마우스에서 BGB-A317(Tislelizumab)의 평가를 위해 특별히 조정되었습니다.
1. 인간 PBMC 기반 모델 구축

<ol><li>
사이클로포스파미드를 사용한 NOD/SCID 마우스의 골수성 절제술: 최적의 용량 결정
	<ol>
<li>구매 여성 NOD/SCID 마우스 (6-8 주). 참고: 이 연구에 참여한 모든 마우스는 여성이었다.</li>
		<li>식염수에 다른 용량 (50, 100 및 150 mg/kg)에서 사이클로 포스파미드 (CP)를 준비하십시오. 125 mg/kg에서 식염수로 0.8% 트웬-80에 디설피람(DS)을 준비합니다. 참고: CP의 상이한 농도는 CP의 상이한 복용량을 얻는 마우스에 동등한 양의 약물 용액의 투여를 가능하게 하기 위해 제조되었다.</li>
		<li>동물을 CP(i.p.) 및 DS(p.o.)로 하루에 한 번 2일 동안 치료하십시오. CP의 각 투여 후 DS (p.o.) 2 h를 준다. 참고: DS는 마우스에서 CP의 비뇨독성을 감소시키고, DS와 결합된 CP는 CP 단독으로 치료한 동물보다 더 오래 지속되는 호중구 감소증을 가지는 것으로 제안되었다10 CP의 투여량 요법은 실제 연구 이전에 미리 결정되어야 할 수도 있고 변화하는 것으로 나타났다. 약간 다른 면역 결핍 마우스 긴장 사이.</li>
		<li>궤도 정맥 부비동에서 혈액 샘플을 수집하고 0일째(1st 투여 전 1시간), 2일째(2nd 투여 후 24시간) 및 4일째(2nd 투여 후 72시간)에 얼음위에 EDTA-K 코팅 튜브로 옮김을 전달한다.</li>
		<li>FACS에 의한 CP 및 DS 치료 후 골수제 효과를 검사한다. 쥐 안티 마우스 CD11b (M1/70), 쥐 반대로 마우스 Ly6C (HK1.4, ) 및 쥐 반대로 마우스 Ly6G (1A8) 게이팅 CD11b+ Ly6G높은 호중구로 높은, CD11b+Ly6C높은 단핵구11,12.</li>
		<li>1 주일 동안 매일 쥐의 체중과 건강 상태를 기록하십시오. CP와 DS의 최적 용량은 마우스에 심각한 독성을 유발하지 않고 호중구 및 단핵구의 최대 고갈을 초래하는 처방으로 결정된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 PBMC 이식 및 종양 생착: 모델 설정
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 건강한 기증자로부터 인간 PBMC를 분리합니다.</li>
		<li>이식 효율을 높이기 위해 1.1.2 단계 및 1.1.3단계로 표시된 바와 같이 마우스를 CP 및 DS로 미리 치료하였다.</li>
		<li>CP와 DS의 두 번째 투여 후 20~24시간, A431 세포(ATCC, 2.5x 10 6) 및 5 x 106 단종 PBMC(50% 마트리겔을 함유하는 총 200μL 인산완충식염수(PBS)에 혼합)과 같은 인간 종양 세포주 주입 , 또는 종양 단편(3 x3 x 3 mm 3, 총 부피 200 μL PBS에서 50% 마트리겔을 함유하고) 및 200 μL의 5 x 106 PBMC (생착종양 단편의 좌우측에 각각 100 μL) (s.c.) 동물의 우측 측면에 피하로.</li>
		<li>원발성 종양 량을 측정하고 4-6 주 동안 일주일에 두 번 기록하십시오. 참고: 마우스는 그들의 바디 무게가 20% 이상 분실하거나 그들의 종양 양이 2,000 mm3에 도달하거나 종양이 궤양성되면 안락사될 것입니다.</li>
		<li>이산화탄소와 가스 실에서 마우스를 안락사. 안과 가위로 희생 된 마우스에서 전체 종양 조직을 수집하고 조직학 및 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 위해 처리하십시오. 이들 조직에서 인간 CD8, PD-1 및 PD-L1 발현을 조사한다. 프로토콜 단계 4를 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>
2. PBMC 기증자 화면

<ol><li>개인으로부터 수집된 PBMC에서 발생할 것으로 예상되는 변화로 인해 PBMC 기증자패널을 심사합니다. 1.2단계로 표시된 절차에 따라 다른 공여자로부터 PBMC와 공동 주입하는 A431 세포를 사용한다. 참고: 50명 이상의 건강한 PBMC 기증자가 충분한 수의 적당한 기증자를 얻기 위해 연구에서 선별되었습니다. 이 프로토콜을 채택하고자하는 연구원은 계획된 연구의 디자인에 따라 얼마나 많은 건강한 PBMC 기증자가 선별 될 지 스스로 결정할 수 있습니다.</li>
	<li>캘리퍼스로 측정하여 일주일에 두 번 종양 볼륨을 모니터링하십시오. 참고: 종양 성장 속도는 상이한 공여자로부터의 PBMC와 다를 수 있다.</li>
	<li>200-500 mm 3의 평균 부피에서 종양 조직을 수집하고 조직학 및 면역 조직 화학 (IHC) 분석을 위해 처리합니다. 인간 CD8, PD-1 및 PD-L1 식을 검사합니다. 자세한 프로토콜은 4단계를 참조하십시오.</li>
	<li>적당한 종양 성장 (종양 부피 > 200 mm3 14 일 접종 후) 및 상대적으로 높은 PD-1, PD-L1 및 CD8 발현 (평균 IHC 점수 > 2)을 초래하는 PBMC 공여체를 선택합니다. 자세한 IHC 채점 프로토콜은 4단계를 참조하십시오.</li>
</ol>
3. 인간 암 세포주 및 PDX 스크린

<ol><li>1.2단계에서 기재된 절차에 따라 스크린 세포주 및 PDXs는 종양 성장 속도, 인간 PD-L1 발현 종양 및 면역 세포 침투를 평가한다. 참고: 30개 이상의 인간 암 세포주와 20개 이상의 다른 암 유형의 PDX가 저자에 의해 선별되었습니다. 선택된 종양 모델의 데이터는 결과 섹션에 나타내어졌다.</li>
</ol>
4. 면역 화학 (IHC)

<ol><li>단계 1.2.5에 의해 표시된 대로 수확하고 포르말린에 침지하여 종양 조직을 수정합니다. 파라핀에 고정 된 조직을 탈수하고 포함시킴. 고정 된 조직을 3 μm에서 섹션과 폴리 리신 코팅 슬라이드에 놓습니다.</li>
	<li>자일렌에서 각각 7분씩 3회 탈파합니다. 등급이 매겨진 알코올을 통해 섹션에 수화: 100% 에탄올 각 3 분 동안 두 번, 다음 90%, 80% 그리고 70% 에탄올 차례로 3 분 동안. 탈이온화한 H2O로3회 헹구고 슬라이드에서 여분의 액체를 제거합니다.</li>
	<li>10 mM 구연산 나트륨 버퍼 (pH 6.0) 또는 Tris-EDTA (pH 9.0)로 커버 용기에 슬라이드를 배치하여 항원 검색을 수행합니다. 슬라이드 용기를 전자레인지로 3분간 가열합니다. 95°C에서 수조에서 30분간 끓인 다음 실온으로 식힙니다. 탈이온화H2O로 3회 헹구고 슬라이드에서 과량의 액체를 흡인한다.</li>
	<li>PBS에서 3% 소 혈청 알부민을 10분 동안 PBS에서 0.3% H2O2 용액으로 차단. 인간 CD8(EP334), PD-1(NAT105), PD-L1(E1L3N)에 대한 항체에 의한 얼룩에 의한 얼룩은 4°C에서 하룻밤 사이에, HRP 는 2nd 항체에서 RT에서 2nd 항체를 컨쥬게이트화하였다. 1 시간 동안 기판 DAB (3,3'diaminobenzidine)를 슬라이드에 떨어 뜨리고 현미경에서 갈색을 모니터링하여 반응 시간 (초에서 분)을 제어합니다.</li>
	<li>슬라이드를 0.5% 염산 알코올과 0.5% 암모니아 물에 각각 5s씩 침지한 후 중성 발삼으로 슬라이드를 덮은 다음, 각각 80%, 90%, 100% 에탄올을 순차적으로 3분동안, 그리고 마지막으로 5분 동안 3가지 변화를 사용하여 자일렌에 가십시오. 현미경을 사용하여 DAB의 갈색을 관찰하여 항체를 검출합니다. 참고: 인간 CD8 및 PD-1 발현종양 침투 백혈구(TIL)에 대한 발현 점수는 5점 척도(IHC 점수, 범위 0-4)를 높은 객관적인 배율(20x, 40x)에서 할당하여 평가하였다. 0, 결석; 1, 약한 강도 / 미만 20 % 세포; 2, 약한 중간 강도 / 20 %-50 % 세포; 3, 중간 강도 / 50 %-80 % 세포; 4, 강한 강도 / 80 % 이상의 세포. 종양 세포 내의 인간 PD-L1 염색은 상대적으로 확산된 신호 때문에 5점 척도(IHC 점수, 범위 0-4)에 조정된 스코어링 시스템을 사용하여 채점되었다. 0, 결석; 1, 약한 강도 / 미만 10 % 세포; 2, 약한 중간 강도 /10%-30% 세포; 3, 중간 / 30 %-50 % 세포; 4, 강한 강도 / 50 % 이상의 세포.</li>
</ol>
5. 인간화 된 PBMC-NOD / SCID 이종이식 모델에서 생체 내 효능 및 약력 학 연구

<ol><li>단계 1.1.3에 의해 지시된 대로 NOD/SCID 마우스를 전처리하십시오. 간단히 말해서, 생쥐를 100 mg/kg CP(i.p.) 및 125 mg/kg DS(p.o.)로 2일 동안 하루에 한 번 치료하십시오.</li>
	<li>2회 투여 후 20 내지 24시간, 동물의 오른쪽 전면 측면에 인간 암세포의 지시된 수와 2.5-5 x 106개의 PBMC(총 200 μL 세포 혼합물 50% 마모리겔)를 피하(s.c.)로 주입한다. 참고: 단일 연구에서 개별 마우스에 사용되는 PBMC의 수는 동일해야 합니다. 그러나, 각 연구의 시간에 총 격리 된 PBMC의 가용성의 변화로 인해, 저자는 다른 연구에서 2.5 x 106,4 x 106,또는 5 x 106 PBMC를 사용하기로 결정했습니다. PBMC의 관리 된 금액에 이 2 배 차이 인간화의 정도에 영향을 미칠 수 있지만, 저자는 테스트 된 면역 요법의 항 종양 효능평가에 상당한 차이를 관찰하지 않습니다.</li>
	<li>PDXs 생착의 경우, 동물의 오른쪽 전면 측면에 피하 종양 조각(3 x 3 x 3mm 3)을 주입하십시오. 이식된 종양 단편의 왼쪽과 오른쪽에 피하 200 μL의 5 x 106 PBMC (각 면 100 μL)를 주입합니다. 참고: PDX 종양 조직은 세포주 모델에 대해 기재된 바와 동일하게 마트리겔 용액으로 투여되었다.</li>
	<li>세포 접종당일, 동물을 무작위로 그룹화하고 계획된 연구 프로토콜로 치료한다.  후보 약물의 항 종양 활성을 평가, BGB-A317 (QW, i.p.) 이 경우, 다양한 종양 모델에서 표시된 투여량. 참고: 3개의 인간 암 세포주(즉, A431(epidemoid 암), SKOV3(난소암) 및 SK-MES-1(폐암)과 2개의 PDX 모델(즉, BCLU-054(폐암) 및 BCCO-028(결장암))은 I-O 치료에 좋은 종양 모델로 간주됩니다. 이 인간화 마우스 모델에서 평가.</li>
	<li>캘리퍼를 사용하여 매주 두 번 원발성 종양 량을 측정합니다. 참고: 간 몸 무게 손실 주위 관찰 되었다 4-6 우리의 연구에서 PBMC 생착 후 주, 허용 하는 1-2 치료 효능 평가 대 한 개월 창.</li>
	<li>종양 침투 면역 세포의 약력 역학 분석을 위해, 작은 조각으로 종양 조직을 잘라 와 콜라게 나아제 유형으로 소화 (1 mg / mL) 및 DNase I (100 μg / mL) RPMI1640 플러스 5 % 태아 소 혈청 (FBS) 37 °C에서 30 분. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 소화된 조직을 통과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.</li>
	<li>세포를 세척하고 96 웰 라운드 바닥 판에서 얼음 차가운 FACS 버퍼 (PBS, 1 % FBS)에서 1 x 107 세포 / mL의 농도로 세포 수를 조정합니다. 세포를 원심분리하여 세척하고 30 분 동안 20 μg / mL 인간 IgG를 추가하여 세포를 차단한 다음 4 °C에서 항 인간 CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) 및 PD-1 (MIH4) 항체로 염색한 다음 30 분 동안. 그런 다음 스테인드 샘플을 세포 분석 방식으로 유동시키고 guavaSoft 3.1.1을 사용하여 분석합니다.</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자는 베이진에 대한 소유권을 가지고 있습니다. 통장과 강리는 본 연구에서 기술된 BGB-A317을 포함하는 특허에 대한 발명자이다.

암 발달과 진행에 대한 우리의 지식은 종양 세포와 관련 기질 모두에 대한 포괄적 인 이해에 초점을 맞추어 최근 몇 년 동안 크게 발전했습니다. 숙주 면역 기계장치를 이용하는 것은 유망한 처리 전략을 나타내는 암세포에 대하여 더 중대한 충격을 유도할 수 있었습니다. 합성 및 GEM 모델과 같은 손상되지 않은 마우스 면역 체계를 가진 Murine 모델은 체크포인트 매개 면역을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이러한 모델을 이용한 효능 평가는 주로 대리 항마우스 표적 항체13,14에의존한다. 그러나, 인간과 뮤린 면역 계통 사이의 내재적인 차이와 뮤린 모델에서 일부 인간 표적의 부족은 I-O 항종양 효과15,16의전임상 연구를 제한한다. 따라서, 인간 면역 세포와 인간 종양을 모두 포함하는 견고한 마우스 모델이 시급히 요...

면역 종양학 (I-O)는 암 치료의 급속하게 확장하는 분야입니다. 연구원은 최근에 종양을 공격하는 면역 계통의 변조 기능의 치료 잠재력을 평가하기 시작했습니다. 면역체크포인트 봉쇄는 흑색종, 신장세포암, 두경부암, 폐암, 방광및 전립선암1,2를포함한 다양한 암 유형에서 고무적인 활동을 입증했다. 암세포를 직접 죽이는 표적 치료와는 달리, I-O 요법은 종양을 공격하기 위해신체의 면역 체계를 강력하게 합니다 3.
현재까지 수많은 관련 I-O 동물 모델이 설립되었습니다. 이들은: 1) 마우스 종양 세포주 또는 합성 마우스에서의 종양 동종 이식; 2) 유전자 조작 마우스 (GEM) 또는 발암 물질 유도로부터 유래 된 자발적 종양; 3) 기능성 뮤린 면역계에서 인간 약물 표적(들)의 노크인을 가진 키메라 GEM; 및 4) 인간 암세포 또는 환자 유래 이종이식(PDX)으로 이식된 재구성된 인간 면역을 가진 마우스. 이러한 각 모델은 명백한 장점뿐만 아니라 제한 사항이 있으며, 다른 곳에서 광범위하게 설명하고 검토한4.
면역결핍 마우스에서 인간 면역의 재구성은 번역I-O 연구를 위한 임상적으로 관련있는 접근법으로서 점점 더 평가되고 있다. 이것은 일반적으로 성인 면역 세포의 1) 생착 (예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PMBC)) 5,6,또는 2) 조혈 줄기 세포 (HSC)의 생착, 예를 들어, 탯줄 혈액 또는 태아를 통해 달성됩니다. 간7,8. 이 인간화한 마우스는 인간적인 종양의 성장을 지원할 수 있었습니다, 따라서 인간적인 면제 및 인간적인 암 둘 다의 맥락에서 I-O 치료의 평가를 허용하. 장점에도 불구하고, I-O 연구에서 인간화 마우스의 응용은 일반적으로 긴 모델 개발 시간과 상당히 높은 비용과 같은 몇 가지 우려에 의해 방해되었다.
여기서, 우리는 번역 I-O 연구에 널리 적용될 수 있는 인간 PBMC 기반 모델을 설명합니다. 이 모델은 효능 연구에서 높은 재현성을 가진 비교적 시간 및 비용 효율적입니다. 그것은 현재 전임상 및 임상 개발 하에 여러 I-O 치료제의 평가를 위해 사내에서 사용되어 왔다. BGB-A317 (Tislelizumab), 조사 인간화 된 항 PD-1 항체9는 항 종양 효능 분석을위한 모델 개발, 특성 화 및 가능한 응용 프로그램을 논의하는 예로 사용됩니다.

<table><tbody><tr><td>PBMC 분리 /Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>세포 분리</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CVR</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-076-CV</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 액상</td><td>Gibco</td><td>15140-163</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.25%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25200-114</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td></td><td>356237 CDX 접종</td></tr><tr><td>FACS 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>: 콜라겐 분해 효소 유형 I</td><td>시그마</td><td>C0130</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>: 안티 마우스 / 인간 CD11b (M1 / 70) 항체</td><td>BioLegend</td><td></td><td>101206 FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6C (HK1.4) 항체</td><td>BioLegend</td><td>128008</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 마우스 Ly-6G (1A8) 항체</td><td>BioLegend</td><td>127614</td><td>FACS</td></tr><tr><td>안티 human CD8 (OKT8) 항체</td><td>Sungene Biotech</td><td>H10082-11H</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-human CD279 (MIH4) 항체</td><td>eBioscience</td><td>12-9969-42</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-human CD3 (HIT3a) 항체</td><td>4A Biotech</td><td>--</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Guava easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Tumor/PDX 이식 /투여 / 측정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시클로포스파미드</td><td>J& K</td><td>Cat#419656, CAS#6055-19-2</td><td>생체 내 효능</td></tr><tr><td>디설피람</td><td>J& K</td><td>Cat#591123, CAS#97-77-8</td><td>생체 내 효능</td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>300841</td><td>CDX 접종</td></tr><tr><td>피하 주사 바늘 (14G)</td><td>Shanghai SA Mediciall & 공급자:Plastic Instruments Co., Ltd.</td><td>0.7*32 TW SB</td><td>PDX 접종</td></tr><tr><td>버니어 캘리퍼스 (MarCal)</td><td>Mahr</td><td>16ER</td><td>종양 측정</td></tr><tr><td>IVC 개별 환기 케이지</td><td>Lingyunboji Ltd.</td><td>IVC-128</td><td>동물 시설</td></tr><tr><td>IHC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP200 진공 조직 처리기</td><td>Leica</td><td>ASP200</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Leica RM2235 일상 절편용 수동 로터리 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Leica EG1150 H 가열식 파라핀 임베딩 모듈</td><td>Leica</td><td>EG1150 H</td><td>IHC</td></tr><tr><td>아리올-임상 IHC 및 FISH 스캐너</td>, <td>Leica</td><td>Ariol</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Anti-human CD8 (EP334) 항체</td><td>ZSGB-Bio</td><td>ZA-0508</td><td>IHC</td></tr>, <tr><td>Anti-human PD1 [NAT105] 항체</td><td>Abcam</td><td>ab52587</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Anti-human PD-L1 (E1L3N) 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>13684S</td><td>IHC</td></tr><tr><td>Polink-2 plus Polymer HRP Detection System</td><td>ZSGB-Bio</td><td>PV-9001/9002</td><td>IHC</td></tr></tbody></table>

인간 말초 혈액 단핵 세포 (pbmc) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (i-o) 연구

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

최근 몇 년 동안 면역 종양학 (I-O) 치료의 발견과 개발은 암 치료의 이정표를 나타냅니다. 그러나, 치료 도전은 지속. 강력하고 질병과 관련된 동물 모델은 다양한 추가 적인 면역 체크포인트를 해결하기 위해 지속적인 전임상 연구 및 개발을 위한 중요한 자원입니다. 여기에서, 우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 기지를 둔 인간화한 이종이식 모형. BGB-A317(Tislelizumab)은 후기 임상 개발에서 인간화된 항PD-1 항체로 플랫폼 설정, 모델 특성화 및 약물 효능 평가를 논의하는 예로 사용됩니다. 이 인간화한 마우스는 시험된 대부분의 인간적인 종양의 성장을 지원합니다, 따라서 인간적인 면제 및 인간적인 암 둘 다의 맥락에서 I-O 치료의 평가를 허용하. 일단 확립되면, 우리의 모델은 비교적 시간과 비용 효율적이며, 일반적으로 매우 재현 가능한 결과를 산출한다. 우리는 이 문서에 설명된 프로토콜이 I-O 연구를 위한 인간 PBMC 및 종양으로 재구성된 마우스 모형을 설치를 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었다는 것을 건의합니다.

여기에 제시된 절차에 따라 PBMC 기반의 인간화 이종이식 모델이 성공적으로 확립되었습니다. 간단히 말해서, NOD/SCID 마우스에서의 CP 골수제 효과는 CP 및 DS 치료 후 호중구 및 단핵구집단의 유세포 분석 분석에 의해 결정되었다(도 1). 100 mg/kg CP 플러스 125 mg/kg DS 최적의 복용량으로 결정 하 고 처방으로 후면 연구에 사용 하 여 호중구와 단핵구의 최대 고갈 쥐에 심각한 독성을 유발 하지 않고. 다음으로, 인간 PBMC 및 종양 이식을 수행하였다. 종양 미세환경 내의 인간 면역 세포의 존재는 IHC에의해 확인되었다(도 2).
PBMC 공여자의 패널은 종양 미세 환경 및 허용 가능한 종양 성장 속도에서 상대적으로 높은 면역 세포 침윤을 보장하기 위해 생체 내에서 스크리브되었다(섹션 2, 도 3</stro...

우리는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 기술합니다 - 번역형 면역 종양학 연구를 위한 기지를 둔 인간화한 이종이식 마우스 모형. 이 프로토콜은 I-O 치료 평가를 위한 유사한 모형을 설치하고 특성화하기 위한 일반적인 지침으로 봉사할 수 있었습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

우리의 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 PBMC 및 종양으로 재구성된 마우스 모형을 설치하기 위한 일반적인 지침역할을 할 수 있습니다. 이 절차는 인간 적인 종양 을 베어링 마우스에 있는 인간 면역을 부분적으로 재구성하고 암 이체와 인간 PBMC의 혼합을 위한 비용 효과적이고 높게 재현가능한 접근을 제공합니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 신신 쿠이, 얀후안 장, 휘첸 바이, 샤오롱 양이 약리학과에서 우리를 보내게 될 것입니다.골수성 세포 고갈의 경우 복막시 시클로포스파미드의 킬로그램당 100mg을 전달하고 구두로 2일 동안 하루에 한 번 NOD/SCID 암컷 마우스를 6~8주 에 디설피람킬로그램당 125mg을 전달한다. 사이클로포스파미드와 디설피람의 두 번째 투여량 후 24시간 후, 갓 고립된 6개의 인간 PBMC 중 5배, 인간 종양 세포세포 6개 중 2.5배, PBS 200마이크로리터+ 동물1인당 50%의 메트로겔을 동물 실험의 오른쪽 측면에 피하한다. 4~6주 동안 일주일에 두 번 1차 종양 부피를 측정하고 기록한다.종양이 200 에서 500 밀리미터 의 평균 부피에 도달하면, 각 동물에서 전체 종양을 수확하기 위해 검안 가위를 사용합니다. PBMC 기증자 종양 세포주 및 상대적으로 높은 PD-1, PD-L1 및 CD8 발현을 가진 온건한 종양 성장을 초래하는 환자 유래 이종이이식은 후속 분석을 위해 이용되어야 한다. 수확된 종양 조직의 면역 조직 화학적 분석을 위해, 파라핀에 있는 조직의 탈수 및 포함 전에 24 72 시간 전에 견본 및 포르말린을 고칠 수 있습니다.폴리리신 코팅 슬라이드에 내장 된 조직의 세 마이크로 미터 섹션을 얻고 3 7 분 자일렌 몰입으로 샘플을 분리하십시오. 세 번째 치료 후 3 분 등급 알코올 침전으로 섹션을 수화합니다. 그런 다음 슬라이드를 탈온 된 물에 세 번 헹구고 슬라이드에서 여분의 액체를 제거합니다.항원 검색을 수행하려면 슬라이드를 용기에 넣고 슬라이드를 10 밀리미터 소디오이트 버퍼로 덮습니다. 슬라이드, 컨테이너를 전자레인지에 넣고 3분간 가열한 후 슬라이드를 섭씨 95도의 수조에 30분간 놓습니다. 실온으로 냉각한 후 슬라이드를 탈온된 물에 세 번 헹구고 슬라이드에서 여분의 액체를 흡인시합니다.10분 동안 0.3%의 과산화수소로 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 차단한 다음 1시간 동안 3%BSA 및 PBS로 차단합니다. 과산화수소 배양의 끝에서, 하룻밤 4섭씨에서 적절한 1 차 항체로 슬라이드를 라벨. 다음날 아침, 고추냉이 과산화제 접합이 부추형 항체로 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 처리한 후 가벼운 현미경검사법에 의해 적절한 수준의 갈색 염색이 관찰될 때까지 슬라이드에 기판을 드롭와이즈로 적용한다.다음으로, 헤마톡슬린으로 샘플을 얼룩지게 합니다. 1분 후 증류수와의 반응을 멈추고 0.5%의 염산 알코올로 5초, 암모니아 물 0.5%로 5초 가시화됩니다. 그런 다음 3분 에탄올 3분, 자일렌 3분, 5분 짜리 자일렌 침수로 샘플을 탈수합니다.관심 있는 약물의 항종양 활성을 평가하기 위하여는, 계획된 실험 프로토콜에 따라 세포 접종의 날에 처리를 시작하고 4 6 주 동안 주 2회 1 차 종양 부피를 감시합니다. 약청에 침투된 면역 세포의 PharmaCODE 동적 분석을 위해 종양 조직을 작은 조각으로 잘라내고 콜라게나아제 타입 1과 DNase I 및 RPMI-1640 배지와 5%FBS를 섭씨 37도에서 30분 동안 소화합니다. 소화의 끝에서, 40 마이크로미터 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 필터링하여 단일 세포 현탁액을 얻고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.얼음 차가운 팩스 버퍼 농도의 밀리리터 당 일곱 번째 세포의 1회 10번에서 펠릿을 재연하고 96웰 라운드 하단 플레이트에서 적절한 수의 우물로 동일한 양의 세포를 이송한다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 어떤 비특이적 결합을 차단하기 위해 30 분 동안 인간 IGG의 밀리리터 당 20 마이크로 그램에서 펠릿을 재중단. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 세포측정을 유동하여 분석하기 전에 섭씨 4도에서 30분 동안 적절한 1차 항체로 세포를 얼룩지게 한다.입증 된 바와 같이, 킬로그램 사이클로포스파미드 당 100 밀리그램과 킬로그램 당 125 밀리그램 디설피람 골수 절제술은 호중구와 단핵구의 상당한 고갈을 초래한다 4 일 후 치료. 인간 PBMC 및 종양 이식 후, 면역 세포 침투의 존재는 면역 조직 화학에 의해 종양 미세 환경 내에서 확인할 수 있습니다. PBMC 기증자의 패널의 생체 내 스크리닝은 수용 가능한 종양 성장 율에서 종양 미세 환경으로 상대적으로 높은 면역 세포 침투의 존재를 확인하기 위해 수행 될 수있다.상이한 암 유형의 환자 유래 xenografts에서 인간 암 세포라인은 또한 종양 성장 속도 및 면역 세포 침투를 평가하기 위하여 평가될 수 있다. 본 대표적인 실험에서, 인간화된 항PD1 항체를 가진 PBMC 와 접목된 인간화된 마우스의 치료는 상당한 항종양 활동을 초래하였다. 디술피람은 사이클로포스파미드의 비뇨기독성을 감소시며, 이 조합은 마우스에서 더 오래 지속되는 호중구 감소니아 효과를 발휘할 수 있다.사이클로포스파미드와 디술피람의 정확한 투여량 요법은 미리 결정될 필요가 있다. 인간 면역 재구성과 감소된 외국인 성 GvHD 효과를 위한 면역 결핍마우스의 새로운 변종이 확립되었으며 문서화된 프로토콜로 추가 조사를 보류중입니다. 우리의 모형은 T 세포 가관여하는 암 면역 치료를 평가하는 데 유용합니다, 특히 짧은 타임 라인에서 작업하거나 더 복잡한 다중 리니지 면역 모델로 이동하기 전에 에이전트를 선택하는 데 유용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

인간화 마우스를 사용하여 종양 특정 T 세포의 생성 및 특성이 여기에 설명되어 있습니다. 인간 thymic 조직 및 유전자 변형 인간의 조혈 줄기 세포는 면역 저하 된 쥐에 이식되어 있습니다. 안티 종양 면역 반응의 생체 시험에서 허용하는 엔지니어링 인간의 면역 시스템의 reconstitution에이 발생합니다.

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

이 비디오는 인간화된 이종 이식 마우스 모델을 생성하기 위한 분석을 보여줍니다. 면역이 저하된 마우스에게 시클로포스파마이드를 주사하여 면역 세포를 고갈시킵니다. 하이드로겔에서 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혼합된 환자 유래 종양 세포를 마우스에 피하 주입하여 T 세포가 침투하는 종양을 형성합니다.

인간 PBMC가 이식된 인간화 이종이식 마우스 모델을 생성하는 기술

인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

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오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

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인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

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