Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Canlı hücre görüntüleme, dinamik hücresel süreçlerin zaman içinde tek bir hücre içinde gözlemlemesini sağlar. Bu yaklaşımlar, hücre bölünmesinin dinamik sürecini etkileyen koşulları değerlendirmek ve mitoz bölünmedeki kusurların kız hücre çoğalması ve canlılığı üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için güçlüdür. Görüntüleme sırasında ışığa maruz kalma sonucu fototoksisite bu protokol ile ilişkili önemli bir sorun temsil eder.

Bu nedenle, maruz kalma süreleri ve görüntüleme aralığı ve süresi optimize edilmelidir. Aseptik tekniği ve biyogüvenlik seviyesi iki güvenlik kabini kullanarak, ilgi ifadesi yapı taşıyan hücre hattı içeren kültür plakası orta aspire steril tek kullanımlık cam Pasteur pipet kullanın. Kısaca girdap ile steril PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın ve 0.05% tripsin iki mililitre ile hücreleri tedavi.

37 santigrat derece de iki ila beş dakika sonra, reaksiyonu durdurmak ve nazik pipetleme ile müstakil hücreleri yeniden askıya plaka ya santigrat sekiz mililitre ekleyin. Hücre çözeltisini steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve santrifüj ile hücreleri toplayın. PBS 10 mililitre pelet resuspend ve hücreleri tekrar santrifüj.

Toplama için orta 10 mililitre pelet resuspend ve hücre kültürü orta konsantrasyon mililitre başına 5 hücreleri bir ila iki kez 10 seyreltmek. Daha sonra steril 12-iyi görüntüleme alt plaka her kuyuiçine hücrelerin 500 mikrolitre tohum ve hücrelerin plaka yüzeyine uymak için izin vermek için hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Görüntülemeden en fazla 30 dakika önce, bir veya daha fazla kuyuya ilgili bir mitotik ilaç konsantrasyonu ekleyin ve kontrollerle aynı sayıda kuyuya inhibitör diluent eşit miktarda ekleyin.

Mikroskobu görüntülemeye hazırlamak için plakayı yüksek çözünürlüklü bir kamera, 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış bir çevre odası ve nemlendirilmiş %5 karbondioksit için bir dağıtım sistemi ile donatılmış ters epifloresans mikroskobunun aşamasına yerleştirin. 0,5 sayısal diyafram açıklığı ile 20 kez hava hedefi seçin ve yüksek kontrastlı floresan ve faz kontrastı için donatılmıştır veya parlak alan görüntüleme ve dersi ayarlamak ve hücreleri odak haline getirmek için odak bulmak için hücreleri görüntüleyin. Parlak alan, GFP ve RFP görüntü edinimi için en uygun pozlama sürelerini ayarlamak için, görüntülenecek floroforlar için uygun uyarma ve emisyona sahip ilgili filtre küplerini seçin ve Oynat'ı tıklatın.

Sinyal yeterince yoğun değilse, otomatik pozlamayı ayarlayın ve her florofor kanalında Biçim açılır menüsünden uygun binning'i seçin. Mikroskop aşamasını üreticinin talimatlarına göre çok kuyulu çanağa kalibre edin ve görüntülenecek kuyuları vurgulamak veya başka bir şekilde seçmek için görüntü edinme yazılımını kullanın. Oluşturulan puan kontrol panelini açın ve Çalışma Alanı altında, kuyunun sınırlarını dışlamak için koordinat seçim alanını kısıtlamak için Kısıtlı ve Kenarlık'ı seçin.

Alan Kısıtlaması açılır menüsünde, Tüm Alan'ı seçin ve rasgele bir nokta yerleşimi seçin. Sayısı altıya ayarlayın ve sırasıyla kuyu başına yakalanacak noktaların sayısını ve dağıtımını seçmek için Randomize'yi tıklatın. Ardından, zaman aralığını ve görüntüleri toplama süresini seçmek ve girmek için zaman sırası kontrol panelindeki değerleri tıklatın ve girin.

RFP-H2B etiketli kromatini görselleştirmek için, RFP filtre küpüyle yakalanan görüntüleri yerinde seçin ve metafaz hizalamasının mitotik zamanlamasını belirlemek için ilk kromatin sıkıştırma ve nükleer zarf dökümünde belirtildiği gibi mitoz girilen bir hücreyi tanımlayın ve tek tek hücrelerde anafaz başlangıcını belirleyin. RFP-H2B etiketli kromatin metafaz sırasında hücre ekvator hizasını tamamlayana kadar mitotik girişten zaman noktaları veya dakika sayısını belirlemek için satın alınan filmde ardışık zaman noktaları ile ilgi hücresini izleyin. Mitotik zamanlamayı, mitotik sadakati ve hücre kaderini izlemek için, anafaz kromozom ayrımının belirgin olduğu ve/veya kromatin ayrıştırma ve nükleer zarf reformasyonu meydana geldiğinde zaman koordinatını belirlemek için hücreyi ardışık zaman noktaları üzerinden izlemeye devam edin.

Daha sonra, anafaz kromozom ayrımı sırasında gecikmeli kromozomlar ve kromatin köprüleri de dahil olmak üzere mitotik bozukluklar sergileyen her popülasyondaki hücreleri tanımlamak için RFP-H2B'yi görselleştirin. Alfa tubulin-EGFP görselleştirilerek, mil çekme odaklama elde edilir ken ve hücre bölünmesine hazırlık olarak bipolar mitotik mil oluşturulduğu için mil bozulması yaşayan hücrelerin dinamik değişikliklere maruz kaçtığı gözlenebilir. Mil montajı ile eşzamanlı olarak kromozom hareketi RFP-H2B ile görüntülenarak kromozom hizalamasını ve ayırma doğrusunu değerlendirebilir.

Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları kullanılarak, bu temsili sonuçlar normal bir centrozsome içeriğe sahip hücrelerin metafaz hizalama ve anafaz başlangıçlı metafaz hizalama yoluyla nükleer zarf arıza yoluyla devam edebiliyoruz göstermektedir 30 dakika altında bir bipolar bölünme elde etmek için. Ekstra centrozomların varlığında, hücrelerin yaklaşık%50'si geçici çok kutuplu mitotik milin üstesinden gelebiliyor ve tam hücre bölünmesinde bipolar bir mil oluşturabiliyor. Kalan hücreler bipolar iğ elde edemez ler ve sonuç olarak mitoz bölünmeden çok kutuplu bir bölünme ile çıkarlar.

Mil bipolaritesinin sağlanıp sağlanmadığına bakılmaksızın, ekstra centrozomlu hücreler iki sentrozomlu hücrelere göre mitoz süresinde önemli ölçüde artış sergilerler. Mitotik sonuçlardaki değişiklikler belirgin olmasa bile mitotik progresyon dinamiğinin değişebileceğini gösterir. Floresan kanallar için maruz kalma sürelerini tanımlarken, fototoksisiteyi sınırlamak için pozlama sürelerini optimize edin.

Ayrıca kamera piksel binning daha düşük pozlama süreleri kullanılmak üzere izin vermek için seçilebilir. Bu işlem farmakolojik taramalar, invazyon ve göç analizi uygulamaları vardır. Bu yaklaşımlar aynı zamanda ilaç tedavilerinin etkinliğini veya hücresel hareketlilik dinamiklerini incelemek için de kullanılabilir.