Une méthode de co-culture pour étudier la croissance de la neurite en réponse aux signaux dentaires de paracrine de pulpe

Ce protocole fournit un aperçu détaillé de la façon de co-culture des cellules souches de pulpe dentaire avec des neurones trigeminaux. Avec elle, nous pouvons étudier les réponses multiples entraînées par leur crosstalk. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’étudier et de manipuler l’une ou l’autre des populations cellulaires ou les deux et de mesurer précisément les résultats.

Cette méthode a une pertinence directe pour la recherche neuronale et pourrait fournir un aperçu de la recherche sur la façon dont les cellules souches de pulpe dentaire réparer les tissus neuronaux endommagés par des événements traumatiques ou des maladies neurodégénératives. Il ya plusieurs étapes de cette technique à apprendre et il peut être difficile de garder une partie de tous. Ce protocole détaille chaque étape pour aider à cela.

La pulpe dentaire et les ganglions sont difficiles à disperser et nécessitent divers tourbillons et tuyaux. Même alors, vous n’obtiendrez pas la dispersion complète de sorte que l’optimisation et les répliques seront nécessaires. Après l’euthanasie de la souris, placez la tête sur le dessous jetable de sorte que la bouche est vers le plafond et la base du cou est plate sur la surface de travail.

Utilisez une lame de rasoir et un mouvement de sciage pour séparer la mandibule du maxillaire. Retirez la langue avec des ciseaux ou des forceps pour faciliter l’accès aux molaires. Placez la tête ouverte dans le plat au sommet d’un tampon stérile de gaze et placez le spécimen sous le microscope dissectionnant.

Enlever le tissu osseux alvéolaire entourant les premières molaires. Insérez des forceps dans l’ouverture alvéolaire et taquinez le tissu loin de la dent vers le buccle ou le côté lingual de la bouche. Recueillir toutes les premières molaires maxillaires et transférer délicatement les premières molaires submandibulaires et maxillaires dans un plat de culture cellulaire séparé avec 1X PBS sur glace.

Retirez l’organe extérieur d’émail entourant l’extérieur de chaque première molaire maxillaire. Avec un ensemble de forceps tourner la molaire de sorte que les cuspides sont vers le bas et la racine ouverte est exposée. Il y a une ouverture ovale sur le fond de la dent et un tissu opaque de pulpe dentaire encapsulé par une fine couche de dentine et d’émail.

À l’aide de la pointe des forceps, relâchez doucement la pulpe dentaire en exécutant un bras des forceps autour de la circonférence interne du tissu minéralisé. Retirer le tissu de pulpe dentaire de la structure minéralisée et transférer dans un troisième plat contenant 1X PBS. Retirer l’organe externe de l’émail s’il n’était pas déjà séparé.

Transférer tous les tissus dentaires de pulpe à 0,25% trypsine EDTA dans un tube conique de 50 millilitres. Vortex le mélange et le placer dans un bain d’eau chaude de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Sous une hotte stérile, ajouter des supports de co-culture réchauffés à un rapport final d’au moins un-à-un médias à la trypsine pour inactiver l’enzyme.

Pipet les médias de haut en bas plusieurs fois avec un tuyau de 10 millilitres pour disperser davantage la pulpe dentaire dans les médias, éviter les grosses bulles. Transférer un millilitre de pulpe dentaire dispersée à chaque puits de plaque de culture tissulaire de 24 puits. Placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Et permettre aux cellules de s’attacher et de migrer hors du tissu non perturbé pendant 48 heures avant de changer de média. Après euthanasie et ablation de la peau, insérer le bout d’une paire de micro ciseaux disséquants dans la base du crâne. Couper le long de la suture sagittale du crâne.

Faire quatre petites coupes horizontales le long des sutures coronaires par les oreilles jusqu’à ce que le long des sutures lambdoid de la base du crâne. Cela crée deux volets d’os. Utilisez les forceps pour peler les deux volets de l’os pour révéler le cerveau.

Localiser les ganglions trigeminaux logés dans le mater dura entre le cerveau et l’os du processus maxillaire. Coupez les trois branches qui se déplacent vers les yeux, maxillaires et mandibules. Et utilisez des forceps fins de bord droit pour transférer les ganglions au 1X PBS froid dans un plat sur la glace.

Une fois que tous les faisceaux trigeminaux sont récoltés utiliser forceps fichier pour transférer les ganglions à 50 millilitres tube conique contenant cinq milligrammes par millilitre de collagène filtré stérile type II.Vortex le mélange et placer le tube dans le bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 25 à 30 minutes. Toutes les cinq à dix minutes, sortez le tube du bain d’eau, vortex et retournez au bain. Centrifugeuse la solution de neurone trigeminal de collagène pendant deux minutes à 643xg.

Sous une hotte de culture tissulaire, aspirez doucement la collagène avec un micropipet et ajoutez cinq millilitres de trypsine filtrée stérile de type II.Then placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 25 à 30 minutes et dans ce délai vortex le tube brièvement toutes les cinq minutes. Ajoutez des supports à un rapport un pour un de trypsine aux médias pour désactiver la trypsine restante. Comptez le nombre de cellules et diluez le mélange à 200 000 cellules par millilitre dans les médias.

Placer les filtres transwell enduits dans des puits avec de la pulpe dentaire. Pipet 250 microlitres sur le filtre transwell et la culture des cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez les médias par un millilitre de médias de co-culture complétés par une uridine micromolaire et 15 micromolaires 5-Fluoro-2'deoxyuridine pour arrêter la prolifération excessive des cellules mésenchymales qui peuvent empêcher l’excroissance neurite.

Vous devez ajouter des inhibiteurs mitotiques le deuxième jour ou la croissance du neurite ne se produira pas. Dans cette étude, la croissance trigeminale de neurite a été augmentée en présence des cellules dentaires primaires de pulpe dans le puits fondamental comparé au contrôle de la monoculture trigeminal de neurite. Les cellules primaires isolées du récepteur TGF-bêta 2 flox/flox mouse étaient équivalentes en nombre après des injections d’ade-Cre-GFP ou d’ade-eGFP.

Le PCR semi-quantitatif démontre que l’adénovirus-Cre-GFP a supprimé le gène flanqué transformant le récepteur bêta du facteur de croissance 2 avec l’adénovirus-eGFP servant de vecteur viral de contrôle. Dans les cultures avec le facteur de croissance transformant bêta récepteur 2 suppression, la excroissance de neurite a été diminuée. L’imagerie en champ lumineux des filtres transwell après la coloration violette cristalline des populations cellulaires montre que les grands pores sont répandus.

La grande flèche indique une cellule avec la morphologie mésenchymale tandis que la petite flèche indique une cellule de morphologie neuronale. Violet cristal taché les deux cellules sans biais. En outre, la coloration d’immunofluorescence de la tubuline bêta-III avec un anticorps secondaire alexa 488 montre la coloration non spécifique des cellules multiples rendant la formation image des structures afferentes difficile.

Puisque ni les cellules dentaires de pulpe ni les neurones trigeminal se dispersent facilement, chaque chercheur devra optimiser leurs procédures de placage. Si vous culturez les cellules dentaires de pulpe seules dans les puits séparés vous pouvez employer l’immunofluorescence ou vous pouvez quantifier des niveaux d’ARN ou de protéine pour déterminer comment les cellules dentaires de pulpe réagissent aux neurones. N’oubliez pas de blanchir les contenants ou les pourboires qui entrent en contact avec l’adénovirus.

Assurez-vous de jeter correctement les rasoirs dans un bac pointu.