Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

Notre protocole peut être utilisé pour améliorer la qualité et la quantité des données d’expression génétique générées à partir d’échantillons d’ARN dérivés du FFPE, en particulier dans des échantillons de qualité sous-optimale. Cette technique évalue la qualité de l’ARN dans les échantillons de tissus FFPE et permet d’optimiser leur traitement en aval afin d’améliorer la quantité et la qualité des données de séquençage de l’échantillon. Cette méthode permet la caractérisation complète d’une transcription dans l’échantillon biologique et clinique et peut fournir un aperçu des éléments fonctionnels du génome dans le développement et la maladie.

La dégradation ffpe-ARN et la sélection des méthodes pour l’échantillon QC, la préparation de la bibliothèque, et l’analyse des données peuvent tous être très difficiles. Soyez méticuleux lorsque vous choisissez les bonnes méthodes et les contrôles appropriés. La démonstration visuelle permet aux spectateurs d’observer les petites modifications subtiles et les précautions nécessaires lors de la planification, de l’évaluation et du processus de séquençage, en particulier pour les échantillons de FFPE mal conservés.

Pour vérifier la qualité de l’échantillon d’ARN, exécutez l’échantillon sur un système d’ARN QC selon les instructions du fabricant et utilisez le logiciel de bioanalyse approprié pour analyser la distribution des fragments d’ARN dans l’échantillon et calculer la proportion de fragments de plus de 100 et 200 nucléotides. Sur la base des mesures qc, identifier les échantillons avec moins de 40% des fragments de plus de 100 nucléotides pour permettre l’exclusion de ces échantillons du traitement. Pour le séquençage, décongeler les kits de rééquençage appropriés en fonction des paramètres de fonctionnement dans un bain d’eau à température ambiante et placer le plateau de réapprovisionnement à quatre degrés Celsius après le dégel.

Placez l’emballage des cellules d’écoulement à température ambiante pendant 30 minutes. Pendant que le paquet se réchauffe, ouvrez l’application Illumina Experiment Manager et sélectionnez Créer une feuille d’échantillon. Sélectionnez le séquenceur à utiliser et cliquez sur Suivant.

Entrez le code à barres du kit de reagent et les autres paramètres de flux de travail appropriés. Téléchargez ensuite une feuille d’échantillon créée selon les critères de séquence Illumina. Pour préparer la bibliothèque d’échantillons et la bibliothèque de contrôle PhiX, dénominatez et diluez les bibliothèques aux concentrations appropriées et mélangez l’échantillon et les bibliothèques de contrôle PhiX pour obtenir un rapport de volume de contrôle PhiX de 5 %.

Lorsque les cellules d’écoulement sont prêtes, retirez l’emballage, nettoyez la surface vitrée avec un lingette d’alcool sans peluche et séchez le verre avec un tissu de laboratoire à faible pommade. Retirez la cartouche de reagent de quatre degrés Celsius de stockage et inversez la cartouche cinq fois pour mélanger les reagents. Appuyez doucement sur la cartouche sur le banc pour réduire les bulles d’air et charger l’échantillon dénaturé et dilué dans la cartouche de reagent dans le réservoir désigné.

Chargez la cellule d’écoulement, la cartouche tampon et la cartouche de réaccente sur le système. Effectuez ensuite une vérification automatisée et passez en revue la sortie pour vous assurer que les paramètres d’exécuter passent la vérification du système. Lorsque la vérification automatisée est terminée, sélectionnez commencer l’exécuter de séquençage.

Pour visualiser les résultats qc pré-traitement et qc post-alignement, exécutez multi-QC pour générer un rapport agrégé en format HTML. Pour déterminer les effets des lots et évaluer la carte de qualité de l’ensemble de données donné, utilisez un script R pour exécuter une analyse des composants principaux. L’analyse de corrélation de l’échantillon peut ensuite être effectuée à l’aide de la corrélation Pearson entre les différents échantillons.

L’estimation de la proportion de fragments de plus de 100 nucléotides est plus utile qu’une estimation des fragments de plus de 200 nucléotides, car elle est plus sensible pour mesurer avec précision la proportion de fragments plus petits pour les échantillons d’ARN fortement dégradés. Compte tenu du degré élevé de dégradation de l’ensemble de l’échantillon, une méthode totale de préparation de la bibliothèque d’ARN est recommandée. Par exemple, ici, les bibliothèques de séquençage préparées à partir de quatre échantillons différents sont affichées.

Ici, des aperçus de la qualité brute du séquençage des fichiers FastQ et du contenu de l’adaptateur d’échantillon sont affichés. Le dépistage rapide de la QQC peut aider à détecter la contamination comme la contamination bactérienne ou de souris dans les échantillons. L’alignement star peut être utilisé pour déterminer la proportion de lues cartographiées au génome de référence, le pourcentage de lectures cartographiées de façon unique au génome de référence et la proportion de lues qui n’ont pas été cartographiées, ou qui ont été cartographiées en loci multiples.

Les statistiques de la carte et du RSeQC peuvent être utilisées pour déterminer le pourcentage d’ARN messagers, de bases introniques et intergéniques présentes dans les lectures cartographiées. Pour ces analyses représentatives, certaines bibliothèques dégradées avaient un biais de trois principaux dans lequel plus de lectures ont été cartographiées plus près des trois premières que des cinq extrémités principales. En outre, l’analyse des composants principaux peut être effectuée pour déterminer le pourcentage de la variation totale capturée par les principaux composants pour les répliques biologiques de chaque échantillon.

Prenez soin d’éviter la dégradation de l’échantillon, préparez des répliques et plusieurs couches pour chaque échantillon, utilisez les mesures appropriées pour évaluer la qualité de l’échantillon et utilisez la bonne méthode de préparation de la bibliothèque. En utilisant cette méthodologie, de plus grandes études ngs peuvent être réalisées avec des échantillons ffpe auparavant inutilisables avec des temps et des conditions de stockage variables pour obtenir un aperçu d’une variété d’états de la maladie différents. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour étudier les grandes archives existantes de l’échantillon ffpe avec de riches informations cliniques et peut grandement améliorer les études sur le cancer en fonction de la population.