غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على تحديد الحالة القلة الأصلية لبروتينات الغشاء بشكل أكثر دقة من خلال استخدام نظام الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلي جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها توفر بيانات هيكلية دقيقة لبروتينات الغشاء في بيئة شبيهة بغشاء الخلية الأصلية ، ويمكن استخدامها لتحديد الهيكل عالي الدقة في المستقبل. سيوضح الإجراء كايل كروك ، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري.

لتحضير الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلية ، قم بإعادة تعليق جرام واحد من حبيبات الغشاء ذات الأهمية في 10 ملليلتر من NCMN Buffer A.استخدم الخالط الزجاجي Dounce لتجانس عينة غشاء الخلية المعلق عند 20 درجة مئوية ونقل العينة المعلقة إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل. أضف محلول مخزون البوليمر النشط الغشائي و NCMN Buffer A الإضافي إلى العينة إلى التركيز النهائي للبوليمر النشط الغشائي بنسبة 2.5٪ ورج المحلول لمدة ساعتين عند 20 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، الطرد المركزي الفائق العينة.

أثناء الطرد المركزي ، قم بموازنة عمود NTA سعة خمسة ملليلتر من النيكل مع 25 مل من NCMN Buffer A.At نهاية الطرد المركزي ، وانقل المادة الطافية إلى العمود واستخدم مضخة حقنة مضبوطة على معدل تدفق 0.5 ملليلتر في الدقيقة لتحميل المادة الطافية على العمود عند 20 درجة مئوية. اغسل خطوط آلة الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع باستخدام ما يكفي من NCMN Buffer B لشطف النظام بالكامل وتوصيل العمود بآلة الكروماتوغرافيا. اغسل العمود ب 30 مل من NCMN Buffer B بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة واجمع التدفق.

اغسل العمود ب 30 مل من NCMN Buffer C بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة واجمع التدفق. قم بتخفيض البروتين ب 20 مل من NCMN Buffer D بمعدل تدفق 0.5 مليلتر في الدقيقة واستخدم مجمع الكسر لجمع أجزاء مليلتر واحد من العينة ، ثم قم بتخزين عينات البروتين عند أربع درجات مئوية باستخدام SDS-PAGE للتحقق من العينات التي تتوافق مع القمم التي لوحظت على الرسم البياني لشطف الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع. لتحضير شبكات البقع السلبية ، لف شريحة زجاجية بورق ترشيح بحيث يكون جانب الكربون متجها لأعلى وضع الشبكات التي سيتم استخدامها لتحضير العينة على الشريحة.

ضع الشريحة الزجاجية مع شبكات المجهر الإلكتروني في حجرة مفرغ التوهج بين القطبين واستبدل الغطاء الزجاجي مع التأكد من أن الغطاء في المنتصف ومحكم الغلق. قم بتشغيل آلة تفريغ التوهج وتأكد من أن الضوء الأرجواني الناتج عن البلازما مرئي. عند الانتهاء من تشغيل الماكينة ، انتظر حتى تصل الغرفة إلى الضغط الجوي قبل إزالة الغطاء الزجاجي ووضع الشريحة على المقعد.

اضبط تركيز عينات البروتين المنقى إلى حوالي 0.1 ملليغرام لكل مليلتر وقم بتحميل 3.5 ميكرولتر من عينة البروتين على شبكة الكربون بسماكة 10 نانومتر. بعد دقيقة واحدة ، استخدم قطعة من ورق الترشيح لإزالة السائل من سطح شبكة المجهر الإلكتروني وغسل سطح الشبكة ثلاث مرات بقطرة واحدة من الماء سعة ثلاثة ميكرولتر لكل غسلة. بعد آخر غسيل بالماء ، اغسل سطح الشبكة مرتين أخريين بثلاث قطرات ميكرولتر من أسيتات اليورانيوم الطازجة المفلترة بنسبة 2٪ لكل غسلة.

بعد آخر غسل لأسيتات اليورانيوم ، قم بتلطيخ الشبكة بقطرة ثلاثة ميكرولتر من أسيتات اليورانيوم الطازجة المفلترة بنسبة 2٪ لمدة دقيقة واحدة. في نهاية الحضانة ، استخدم قطعة جديدة من ورق الترشيح لإزالة القطرة وتجفيف الشبكة بالهواء لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل تخزين الشبكة في صندوق شبكي لاستخدامها لاحقا. هنا ، يمكن ملاحظة صور البقع السلبية التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الإلكتروني المنقول كما هو موضح.

تكشف صورة البقع السلبية لعينة بروتين قناة مقاومة الأكرافلافين B من النوع البري المنقاة بالمنظفات عن محلول متجانس من الجسيمات أحادية التشتت مع عرض البروتين بنية رباعية ثلاثية محددة جيدا. تتوافق هذه الهياكل الثلاثية مع مخطط الكروماتوغرام لاستبعاد الحجم المرصود بعد التنقية. بالمقارنة ، في صورة البقعة السلبية لمتحور P223G المنقى أيضا بالمنظف ، يوجد محلول غير متجانس من الجسيمات النانوية متعددة التشتت مع ميل نحو التجميع ولكن لا يمكن ملاحظة أدوات تشذيب أصلية يمكن ملاحظتها.

هذه النتائج مدعومة أيضا بكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. لوحظت نتائج مماثلة للبروتينات البرية والطافرة بعد التنقية باستخدام NCMNP11 البوليمر النشط الغشائي يسهل استخدام البوليمر NCMNP52 توليد الجسيمات النانوية لغشاء الخلية الأصلية بأحجام أكبر بكثير مما يسمح بتصوير العديد من بروتين قناة مقاومة الأكرافلافين B في جسيم غشاء خلية أصلي واحد.

ومع ذلك ، في العينة الطافرة ، لم يتم ملاحظة أي جزيئات تشذيب ، حتى عند النظر إلى بقع غشاء الخلية الأصلية الكبيرة ثنائية الطبقة. يؤكد تحليل SDS-PAGE لعينات البروتين المنقى وجود مقاومة الأكرافلافين B في جميع العينات ذات النقاء الأكبر من 95٪ عند الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين. عند تعديل هذا البروتوكول للبروتينات الأخرى ، من المهم تحديد الكمية المناسبة من جزء الغشاء تجريبيا والطول والوقت ودرجة الحرارة لعملية الذوبان.

إذا كشفت صور العينة عن محلول متجانس من الجسيمات أحادية التشتت بوحدات هيكلية محددة جيدا ، فيمكن استخدام العينة لتحديد الهيكل عالي الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد.