Name: Katyonik Peptit Taşıyıcılarının Kıkırdak İçi Taşıma Özelliklerinin Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Keşfedin kıkırdak içi taşıma özelliklerini katyonik peptit taşıyıcılar için. Bu yöntem, negatif yüklü dokuları hedefleyen optimal yüklü ilaç taşıyıcıları tasarlamaya yardımcı olur ve in vivo tedavi etkinliğini öngörür.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, W81XWH-17-1-0085 sözleşmesi kapsamında Kongre Tarafından Yönlendirilmiş Tıbbi Araştırma Programları (CDMRP) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü R03 EB025903-1 aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir. AV, Northeastern Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Dekan Bursu tarafından finanse edilmiştir.

Ölü dokularla yapılan deneylerin yapılması için üniversite onayı alındı. Büyükbaş hayvanlar ticari olarak bir mezbahadan elde edilebildi.
1. Kıkırdak ekstrektifi ekstraksiyonu
<ol><li>Bir neşter kullanarak (#10 bıçak), kesme ve yağ kaldırmak, kaslar, ligamentler, tendonlar ve sığır diz eklemleri femoropatellar oluk kıkırdak ortaya çıkarmak için diğer tüm bağ dokusu.</li>
	<li>3 mm ve 6 mm dermal zımba kullanarak, silindirik fişleri ayıklamak için kıkırdak içine dik yumruklar yapmak. Fişleri hemen %1 v/v antibiyotik antimikotik ile desteklenen ve %1 v/v antibiyotik antimikotik ile desteklenen 500 μL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 48 kuyulu bir plakanın tek tek kuyularına yerleştirin.</li>
	<li>Bir kıkırdak fişinin yüzeysel tarafını dilimleme armatüründe bir kuyuya doğru yerleştirin(Şekil 2). Bir jilet kullanarak, yüzeysel bölge dahil 1 mm kalınlığında kıkırdak ekstrplant elde etmek için dilimleme fikstür yüzeyi boyunca fişi dilimleyin. Her kıkırdak fişi için tekrarlayın.</li>
	<li>-20 °C'de 500 μL 1x PBS içeren polipropilen tüplerde kıkırdak ekspertonları ayrı ayrı depolayın.</li>
	<li>Aşağıdaki taşıma deneylerinin her birini gerçekleştirmeden önce, eksplant içeren şişeleri 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dk boyunca eritin.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig02.jpg"> Şekil 2: Özel olarak tasarlanmış dilimleme armatürü. 3 ve 6 mm çapındaki kıkırdak ekskilere dilimleme için kullanılan paslanmaz çelik dilimleme armatürlerinin tasarım parametreleri. Dilimlenmiş eksponerlerin kalınlığını ayarlamak için kuyuların içine farklı kalınlıkta plastik kesici uçlar yerleştirildi. &lt;1 mm çapında paslanmaz çelik silindirik pim, eksplantın fikstürden dışarı itilen kısmı için kullanılmıştır. Tüm sayısal değerler mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig02large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
2. Kıkırdakta KTK'ların denge alımı
<ol><li>Xırtıcı eksplantı (3 mm dia. X 1 mm kalınlığında.) ilave yüzeyinden fazla 1x PBS'yi çıkarmak için hassas bir görev silme ile yavaşça dab kıkırdak eksplantları (3 mm dia. X 1 mm kalınlığında.) Bir denge kullanarak, hızlı bir şekilde her explant ıslak ağırlığı kaydetmek ve sonra hemen dehidratasyon önlemek için 1x PBS banyo yerleştirin.</li>
	<li>1x PBS-PI'de floresan etiketli CPC'lerden 30 μM 'lik (ekstrper başına 300 μL) çözüm hazırlayın. Yeniden yapılanma için RNase içermeyen polipropilen tüplerkullanın.</li>
	<li>96 kuyulu bir plakada, her 30 μM TBM çözeltisinin 300 μL'si ayrı kuyulara dönüştürülür. Buharlaşmayı önlemek için plakanın kenarına yakın kuyular kullanmaktan kaçının. Bir spatula kullanarak, kuyuiçeren çözelti için her explant aktarın.</li>
	<li>Çevredeki kuyuları 300 μL 1x PBS ile doldurun ve kuyu plakasını kapakla kapatın. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarını esnek bir filmle kapatın.</li>
	<li>37 °C'lik bir kuluçka makinesinin içine, parçacık sedimantasyonunu sınırlamak için plakayı bir plaka çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Kıkırdakta CpC'lerin denge alımına izin vermek için hafif rotasyon (15 mm yörüngeile 50 rpm) altında 24 saat kuluçka(Şekil 3).</li>
	<li>Floresan ile TBM konsantrasyonu arasındaki korelasyon için standart bir eğri oluşturma<ol>
<li>Polipropilen tüplerde 1x PBS-PI'de 30 μM – 0 μM (10 2 kat seyreltme) cpc çözeltilerinin seri seyreltmelerini hazırlayın. Her seyreltmenin en az 500 μL'si mevcut olduğundan emin olun.</li>
		<li>Siyah 96 kuyuluktaki ardışık kuyulara her seyreltmenin 200 μL'sini ekleyin. Örnek boyutunu artırmak için başka bir satırda çoğaltın.</li>
		<li>Floresan etiketin uyarma ve emisyon dalga boylarında bir plaka okuyucusu kullanarak her numunenin floresan okumalarını elde edin.</li>
		<li>Çizim floresan okuma vs CPC konsantrasyonu ve eğrinin doğrusal kısmı için bir denklem türetmek. NOT: Floresan okumalarında değişkenliği sınırlamak için, Standart eğrinin üretilmeden önce TBM stok çözeltisini numune plakası ile aynı koşullar altında kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuluçka 24 saat sonra, ayrı polipropilen tüpler her kuyudan denge banyosu toplamak.</li>
	<li>Her çözeltinin 200 μL'sini siyah 96 kuyunun ayrı kuyularına aktarın. Standart eğri yle aynı floresan ayarları altında her numunenin floresan okumalarını alın. Gerekirse, okumaların standart eğrinin doğrusal kısmına düşmesini sağlamak için numuneyi 1x PBS-PI olarak seyreltin.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig03.jpg"> Şekil 3: Denge alım deneylerinin şeması. Kıkırdak ekspları (3 mm dia. x 1 mm kalınlığında) floresan etiketli TBM çözeltisi içeren 96 kuyulu bir plakaya yerleştirildi. 24 saat Sonra CpCs kıkırdak tarafından, böylece çevredeki banyo floresan azaltarak yükseltildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Kıkırdak tabir derinliği
<ol><li>1x PBS-PI'de floresan etiketli CPC'lerden 30 μM 'lik (ekstrper başına 300 μL) çözüm hazırlayın. Yeniden yapılanma için RNase içermeyen polipropilen tüplerkullanın.</li>
	<li>Yarım diskler yapmak için bir neşter kullanarak, yarı yarıya kıkırdak eksplants (6 mm çapında x 1 mm kalınlığında) kesme. Kesme sırasında eksplant1x PBS-PI tabakası ile sulu tutun.</li>
	<li>Bir epoksi kullanarak özel olarak tasarlanmış 1 boyutlu taşıma odasının bir kuyunun ortasına yarım disk eksplant yapıştırın (Şekil 4, Şekil 5). Epoksi ekstrandancın çevresel (kavisli) tarafına uygulandığından emin olun. Kıkırdak difüzyon yüzey alanı ile temas önlemek için kuyudan fazla tutkal çıkarın ve ekstrenin yüzeysel tarafında bir not yapmak.</li>
	<li>Ekstryenin her iki tarafına 80 μL 1x PBS-PI ekleyin. Pipette the liquid up and down from one side of the explant to check for leakage to the other side. Sızıntı oluşursa, yeniden ekstrekti ve gerektiği gibi epoksi uygulayın.</li>
	<li>1x PBS-PI'yi kıkırdağın yüzeysel yüzeyine bakan taraftan (yukarı akım) 80 μL 30 μM CPC çözeltisi ile değiştirin. Kıkırdağın (aşağı) derin bölgesine bakan tarafta 80 μL 1x PBS-PI koruyun.</li>
	<li>Taşıma odasını dikkatlice kapatılabilir bir konteynerin içinde yerleştirin. Çözeltilerin buharlaşmasını önlemek için kabın tabanını bir katman 1x PBS ile kapatın. Yukarı ve aşağı odalarından gelen çözümler arasında doğrudan temas olmadığından emin olun.</li>
	<li>Partikül sedimantasyonunu sınırlamak için kapalı kabı bir tabak çalkalayıcıüzerine yerleştirin. Hafif rotasyon (15 mm yörünge ile 50 rpm) altında oda sıcaklığında 4 veya 24 saat için kuluçka.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra eksplantı hazneden çıkarın ve eksplantın merkezinden ~100 μm dilim kesti. NOT: Bu kesit kıkırdağın yüzeysel, orta ve derin bölgelerini kapsatır.</li>
	<li>Dilimi cam bir kaydırak ile kapak kayması arasına yerleştirin. Dilimi 1x PBS-PI tabakası ile nemlendirin.</li>
	<li>10x büyütme, bir konfokal mikroskop kullanarak floresan görüntüleri z-yığın elde etmek için dilimin tam kalınlığı ile görüntü.</li>
	<li>ImageJ kullanarak kıkırdak CpCs penetrasyon derinliğini belirlemek için z-yığını içinde görüntülerin ortalama yoğunluğunu yansıtın.<ol>
<li>Dosya'ya tıklayarak resim yığınını açın | Aç.</li>
		<li>Görev çubuğundaki 'Resim''e tıklayın ve Resim'e tıklayın | Yığınlar | Açılır menüden Z Projesi.</li>
		<li>Dilim numaralarını 1'den son dilime giriş leyin. Projeksiyon Türü altında 'Ortalama Yoğunluk' seçin. 'Tamam'ıtıklatın .'</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig04.jpg"> Şekil 4: Özel olarak tasarlanmış 1-B taşıma odası. 6 ayrı kuyulu PMMA 1D taşıma odasının tasarım parametreleri. Tüm sayısal değerler mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig04large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig05.jpg"> Şekil 5: Penetrasyon derinliği çalışmalarışeması. Kıkırdak eksültörleri (6 mm çapında x 1 mm kalınlık) ikiye bölündü ve 1-D difüzif taşıma kuyularının ortasına sabitlendi. Floresan etiketli TBM çözeltisi kıkırdağın yüzeysel bölgesi (SZ) ile temas halinde kuyunun yan tarafına eklendi. 1x PBS-PI kıkırdağın derin zonu (DZ) ile temas kuyunun yan eklendi. Difüzyondan sonra, kıkırdak kesiti (3 mm x 1 mm) konfokal mikroskopi ile görüntülendi. Bu rakam Vedadghavami ve ark.4 ve Bajpayee ve ark.3bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig05large.jpg" target="_blank">değiştirilmiştir.</a>
4. Kıkırdaktaki KBM'lerin denge dışı difüzyon hızı
<ol><li>Özel olarak tasarlanmış taşıma odasının iki yarısı(Şekil 6)bir araya getirin ve odayı kapatın. Bir anahtar ile hazneyi sıkıca kapatmak için yıkama, somun ve cıvata kullanın. NOT: Taşıma odası floresan okumalara müdahale etmeyecek şekilde yarı saydam olmalıdır. Bu protokolde kullanılan taşıma odaları polimetilmetakrilat (PMMA) yapılır.</li>
	<li>1x PBS 'de (her oda için 2 mL) 15 dk boyunca %0,5 w/v yağsız büyükbaş süt çözeltisi ile odanın iç alanını 15 dk boyunca katlayın ve CpC'lerin oda duvarlarına spesifik olmayan bağlanmasını önleyin. Daha sonra 1x PBS (her oda için 2 mL) ile odayı durulayın.</li>
	<li>Özel olarak tasarlanmış dilimleme armatürü(Şekil 2)ve jilet kullanarak, yüzeysel bölge dahil 500-800 μm kalınlığında 6 mm çapında kıkırdak ekstrplant (enine düzlem) dilim. Explant 1x PBS ile sulu tutun.</li>
	<li>Çekiç tahrikli ve dermal zımbakullanarak, Şekil 7'degösterildiği gibi kauçuk levhalardan contalar oluşturun.</li>
	<li>Her yarım taşıma odasını 1 büyük kauçuk conta, 1 PMMA kesici uç ve her biri 1 küçük kauçuk conta içerecek şekilde monte edin. Yüzeysel bölge yukarı oda bakan plastik eklemek kuyularında ekstrüzyon. Sandviç birlikte montaj tamamlamak ve sıkıca bir anahtar kullanarak vida iki yarısı(Şekil 7).</li>
	<li>Yukarı daki hazneyi 2 mL 1x PBS-PI ile doldurun ve yukarı akış odasından sıvı sızıntısı için aşağı akış odasını gözlemleyin. Sızıntı varsa, conta konumunu ve vidaların sıkılığını ayarlayarak hazneyi yeniden monte edin. Sızıntı yoksa, aşağı daki hazneyi 2 mL 1x PBS-PI ile doldurun.</li>
	<li>Yukarı ve aşağı odaları hem de bir mini karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakası üzerinde oda yerleştirin. Spektrofotometreden gelen lazerin aşağı odanın merkezine doğru odaklandığı odayı hizalayın. Spektrofotometrenin sinyal alıcısı kısmını aşağı akış odasının arkasına yerleştirin (Şekil 8). NOT: Spektrofotometrenin lazeri ve alıcısı floresan etiketli proteinden gelen sinyalleri heyecanlandırmak, yaslamak ve iletmek için uygun filtrelerle donatılmalıdır. Floresan sinyaline müdahaleden kaçınmak için deneme sırasında kara kutu kullanarak taşıma odasını ışıktan koruyun. Buharlaşmayı önlemek için odanın üzerine açıklıkları esnek filmle kapatmak en iyi uygulamadır.</li>
	<li>Gerçek zamanlı akış aşağı floresan emisyon okumaları toplamak ve en az 5 dakika için istikrarlı bir sinyal sağlamak. NOT: Alt bölmeden aliquots elde edilebilir ve bir plaka okuyucu kullanılarak floresan için değerlendirilebilir özel olarak tasarlanmış spektrofotometre veya yarı saydam taşıma odası mevcut değilse.</li>
	<li>Pipet, floresan etiketlenmiş CpC'lerin önceden hesaplanmış bir stok çözeltisi hacmi, yukarı akış odası içinde 3 μM'lik son konsantrasyonu sağlamak için yukarı doğru odaya aktarır. Aşağı floresan sinyalini gözlemleyin ve solute transport'un eğimde sabit bir artışa ulaşmasını bekleyin. NOT: Daha kalın bir kıkırdak ekstrektinde sabit duruma ulaşmak için daha uzun zaman gerekir.</li>
	<li>Sabit duruma ulaşıldıktan sonra, yukarı akış odasından 20°L alın ve akış odasına ("başak testi") ekleyin. NOT: Akıntının aşağısında bir artış gözlenecektir. Bu floresan okumaları ve TBM konsantrasyonu arasında korelasyon sağlayacaktır.</li>
	<li>Gerçek zamanlı aşağı floresan okumaları toplayın.</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig06.jpg"> Şekil 6: Özel olarak tasarlanmış non-denge difüzyon taşıma odası. PMMA non-denge difüzyon taşıma odasının tasarım parametreleri. Oda floresan okumaları müdahale etmeyecek şekilde yarı saydam olmalıdır. Tam taşıma odası, gösterilen fikstürün iki özdeş yarısından oluşuyordu. Haznenin yarısının hizalanmasını ve tamamen kapanmasını sağlamak için iki silindirik paslanmaz çelik pim (~2,94 mm çapında, ~18 mm uzunluğunda) gerekiyordu. 6-32 iplik vidaları için dört özdeş yuva vida sıkı montaj için haznenin her köşesinde yapılmıştır. Tüm sayısal değerler milimetre cinsinden sunulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig07.jpg"> Şekil 7: Denge olmayan difüzyon taşıma odasının montajı. Tasarım parametreleri (A) siyah PMMA kesici uçlar ve (B) büyük ve küçük kauçuk contalar. Kauçuk contaların kalınlığı, haznenin sıkı kapanmasını sağlayacak şekilde ayarlandı. Tüm sayısal değerler mm. (C) Şematik olarak, merkeze yerleştirilen kıkırdak ekstrandası ile taşıma odasının iki yarısı için montaj sırasını gösteren şematik olarak sunulur. SZ yukarı oda bakan kıkırdak yüzeysel bölge gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig08.jpg"> Şekil 8: Denge selfüzyon deneyleri şeması. Kıkırdak eksültöyörleri (6 mm çapında x 1 mm kalınlık) yukarı akım haznesine bakan yüzeysel yüzeyi ile taşıma odasının ortasına yerleştirildi. Odanın yukarı ve aşağı tarafları 1x PBS-PI ile dolduruldu ve mini bir karıştırma çubuğu kullanılarak karıştırıldı. Floresan okumaları toplamak için aşağı bölmeye doğru işaret edilen bir lazer ile floresan etiketli TBM çözeltisi yukarı bölmeye eklenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage-targeting+drug+delivery%3A+can+electrostatic+interactions+help%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).</li>
<li>Maroudas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+solutes+through+cartilage%3A+permeability+to+large+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules.</a> Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).</li>
<li>Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+as+a+model+for+charge+driven+transport+into+cartilage+and+drug+delivery+for+treating+early+stage+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis.</a> Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).</li>
<li>Vedadghavami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+penetrating+cationic+peptide+carriers+for+applications+in+drug+delivery+to+avascular+negatively+charged+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues.</a> Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).</li>
<li>Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+%28IL-1Ra%29+is+more+effective+in+suppressing+cytokine-induced+catabolism+in+cartilage-synovium+co-culture+than+in+cartilage+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture.</a> Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238(2019).</li>
<li>Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+negatively+charged+tissue+barriers%3A+Drug+delivery+using+cationic+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins.</a> Nano Today. 34, 100898(2020).</li>
<li>Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectricity+for+Drug+Delivery%3A+The+Promise+of+Cationic+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics.</a> Bioelectricity. , (2020).</li>
<li>Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis of the knee.</a> New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).</li>
<li>Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+-+An+untreatable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis - An untreatable disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).</li>
<li>Martel-Pelletier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).</li>
<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+articular+cartilage%3A+Structure%2C+composition%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Chevalier, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraarticular+injection+of+anakinra+in+osteoarthritis+of+the+knee%3A+A+multicenter%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Care+and+Research%22%5BJournal%5D)">Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).</li>
<li>Cohen, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+double-blind+study+of+AMG+108+%28a+fully+human+monoclonal+antibody+to+IL-1R1%29+in+patients+with+osteoarthritis+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125(2011).</li>
<li>Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+intra-articular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Progress in intra-articular therapy.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).</li>
<li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-arm+Avidin+nano-construct+for+intra-cartilage+delivery+of+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs.</a> Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).</li>
<li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rabbit+model+demonstrates+the+influence+of+cartilage+thickness+on+intra-articular+drug+delivery+and+retention+within+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).</li>
<li>Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+based+intra-cartilage+delivery+of+single+dose+dexamethasone+using+Avidin+nano-carriers+suppresses+cytokine-induced+catabolism+long+term%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin-biotin+technology+to+synthesize+multi-arm+nano-construct+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery.</a> MethodsX. , 100882(2020).</li>
<li>Wagner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+grafted+dextran+nanostructure+enables+a+month-long+intra-discal+retention%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention.</a> Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).</li>
<li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+involved+in+cartilage+matrix+degradation+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).</li>
<li>Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+dehydration+on+the+surface+morphology+of+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).</li>
<li>Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solute+transport+across+a+contact+interface+in+deformable+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Solute transport across a contact interface in deformable porous media.</a> Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).</li>
<li>Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphasic+modeling+of+charged+solute+transport+across+articular+cartilage%3A+Application+of+multi-zone+finite-bath+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model.</a> Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).</li>
<li>Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+finite+element+protocol+to+investigate+the+transport+of+neutral+and+charged+solutes+across+articular+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).</li>
<li>Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+loading+on+solute+transport+through+the+human+cartilage+endplate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate.</a> Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).</li>
<li>Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+interactions+enable+rapid+penetration%2C+enhanced+uptake+and+retention+of+intra-articular+injected+avidin+in+rat+knee+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research+%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints.</a> Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).</li>
<li>Bajpayee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+intra-cartilage+delivery+of+low+dose+dexamethasone+using+a+cationic+carrier+for+treatment+of+post+traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis.</a> European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+Mice%2C+Men+and+Elephants%3A+The+Relation+between+Articular+Cartilage+Thickness+and+Body+Mass%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass.</a> PLoS One. 8 (2), 57683(2013).</li>
<li>Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+articular+cartilage+thickness+in+the+stifle+of+animal+species+used+in+human+pre-clinical+studies+compared+to+articular+cartilage+thickness+in+the+human+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+and+Comparative+Orthopaedics+and+Traumatology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee.</a> Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntem ve protokoller, negatif yüklü dokulara hedeflenen ilaç teslimatı alanında önemli. Bu dokularda bulunan negatif yüklü aggrecanların yoğunluğunun yüksek olması nedeniyle, bir bariyer oluşturularak ilaçların matrisin derinliklerinde bulunan hücresel hedef bölgelerine ulaşmasını engeller. Bu olağanüstü sorunu gidermek için, ilaçlar taşıma oranını artırabilir pozitif yüklü ilaç taşıyıcıları dahil etmek için değiştirilebilir, alım ve doku içinde ilaçların bağlanması1,<...

Vücutta negatif yüklü dokulara ilaç teslimi hücre ve matris hedef sitelere ulaşmak için doku içine nüfuz etmek için ilaçların yetersizlik nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir1. Bu dokuların bazıları doku içinde yüksek negatif sabit yük yoğunluğu (FCD)2 oluşturmak ve enmakromoleküllerinteslimi için bir engel olarak hareket yoğun paketlenmiş, negatif yüklü agrecans oluşur 3,4. Ancak, pozitif yüklü ilaç taşıyıcılarının yardımıyla, bu negatif yüklü doku bariyeri aslında sürekli ilaçteslimi 1,5,,6,7(Şekil 1)için elektrostatik yük etkileşimleri yoluyla bir ilaç deposuna dönüştürülebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61340/61340fig01.jpg"> Şekil 1: CpC'lerin şarj bazlı kıkırdak içi teslimi. Diz eklemi alanına Eklem içi enjeksiyon. Pozitif yüklü TBM'ler ile negatif yüklü agrega grupları arasındaki elektrostatik etkileşimler kıkırdak yoluyla hızlı ve tam derinlikte penetrasyon sağlar. Bu rakam Vedadghavami ve ark4değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61340/61340fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Son zamanlarda, kısa uzunlukta katyonik peptid taşıyıcıları (CpCs) negatif yüklü kıkırdak teslim için büyük boyutlu terapötik taşıma kapasitesine sahip küçük katyonik etki alanları oluşturma amacı ile tasarlanmıştır4. Yaygın8,,9 ve osteoartrit gibi dejeneratif hastalıkların tedavisi için kıkırdak etkili ilaç teslimi için (OA)10, bu ilaçların terapötik konsantrasyonları doku içinde derin nüfuz kritiktir, kıkırdak hücrelerinin çoğunluğu (konkolitler) yalan11. Mevcut çeşitli potansiyel hastalık modifiye ilaçlar olmasına rağmen, bu etkili kıkırdak 12 ,,13hedef mümkün değildir, çünkü hiçbiri FDA onayı kazanmıştır.12 Bu nedenle, terapötik yanıt ın indüklemede ilaçların etkinliğini tahmin etmek için uyuşturucu taşıyıcılarının taşıma özelliklerinin değerlendirilmesi gereklidir. Burada, denge alımını, penetrasyon derinliğini ve CpCs4'ündenge dışı difüzyon oranını değerlendirmek için kullanılabilen üç ayrı deney tasarladık.
En iyi terapötik yanıt sağlayabilir kıkırdak içinde yeterli bir ilaç konsantrasyonu olduğundan emin olmak için, uptake deneyler kıkırdak denge CPC konsantrasyonu ölçmek için tasarlanmıştır4. Bu tasarımda, kıkırdak ve çevresindeki banyo arasındaki dengeyi takiben, kıkırdak içindeki toplam solute miktarı (matrise bağlı veya serbest) alım oranı kullanılarak belirlenebilir. Bu oran, kıkırdak içindeki solutelerin konsantrasyonunun denge banyosuna normalleştirilmesi yle hesaplanır. Prensip olarak, kıkırdak yoluyla difüzyon şarj etkileşimleri ile desteklenmez nötr solutes, daha az bir alım oranı olurdu 1. Tersine, taşınması elektrostatik etkileşimler yoluyla geliştirilmiş katyonik solutes, 1'den büyük bir alım oranı gösterir. Ancak, TBM'lerde gösterildiği gibi, optimal pozitif yük kullanımı çok daha yüksek alım oranlarına (300'den büyük)4neden olabilir.
Kıkırdak içinde yüksek ilaç konsantrasyonu terapötik yarar elde etmek için önemli olmasına rağmen, aynı zamanda ilaçların kıkırdak tam kalınlığı ile yayılır önemlidir. Bu nedenle, penetrasyon derinliğini gösteren çalışmalar, ilaçların kıkırdak içinde derinlere ulaşmasını sağlamak için gerekli olup, böylece matris ve hücresel hedef bölgelere ulaşılabilmekte ve böylece daha etkili bir tedavi sağlanmaktadır. Bu deney, solutelerin kıkırdak yoluyla tek yönlü difüzyonu değerlendirmek ve in vivo intra-artiküler enjeksiyonsonrasında kıkırdak içine ilaç difüzyonu simüle etmek için tasarlanmıştır. Konfokal mikroskopi ile floresan görüntüleme kıkırdak içine penetrasyon derinliği nin değerlendirilmesi için izin verir. Net parçacık yükü, derin ilaçların matris boyunca nasıl yayılabilir moderating önemli bir rol oynar. Katyonik parçacıklar ve anyonik doku matrisi arasındaki zayıf-geri dönüşümlü bağlanma etkileşimlerine izin vermek için fcd dokusuna dayalı optimal bir net yük gereklidir. Bu, herhangi bir etkileşimin parçacıkların matristen kopabilmesi için yeterince zayıf olduğu anlamına gelir, ancak doğada geri döndürülebilir, böylece doku içinde daha derin bir matris bağlama bölgesine bağlanabilir4. Tersine, çok güçlü matris bağlama kıkırdağın yüzeysel bölgesinde ilk bağlama sitesinden parçacıkların ayrılmasını önler gibi, bir parçacığın aşırı pozitif net yük difüzyon doğru zararlı olabilir. Bu hedef sitelerin çoğunluğu doku11içinde derin yalan olarak yetersiz bir biyolojik yanıt neden olur.
Bağlayıcı etkileşimlerin gücünü daha fazla ölçmek için, kıkırdak yoluyla ilaç difüzyon oranlarının analizi avantajlıdır. Non-denge difüzyon çalışmaları farklı solutes arasında gerçek zamanlı difüzyon oranlarının karşılaştırılması için izin verir. İlaçlar kıkırdağın yüzeysel, orta ve derin bölgelerinden yayıldıkça, bağlayıcı etkileşimlerin varlığı difüzyon oranlarını büyük ölçüde değiştirebilir. İlaçlar ve kıkırdak matrisi arasında bağlayıcı etkileşimler mevcut olduğunda, etkili difüzivite (DEFF)olarak tanımlanır. Bu durumda, tüm bağlayıcı bölgeler işgal edildikten sonra, ilaçların difüzyon oranı sabit durum difüzyonu (DSS)tarafından yönetilir. Farklı solute DEFF arasındaki karşılaştırma matris ile solutes göreli bağlama mukavemeti belirler. Belirli bir çözüniçin, DEFF ve DSS büyüklük aynı sırada ise, bu difüzyon sırasında ilaç ve matris arasında minimal bağlayıcı mevcut olduğunu ima eder. Ancak, DEFF DSS'denbüyükse, parçacıkların matrislere önemli ölçüde bağlanması vardır.
Tasarlanan deneyler ayrı ayrı kıkırdak yoluyla çözünür taşıma karakterizasyonu için izin, ancak, tüm sonuçları kapsayıcı bütünsel bir analiz en iyi ücret uyuşturucu taşıyıcı tasarımı için gereklidir. Şarj etkileşimlerinin zayıf ve geri dönüşümlü doğası parçacık difüzyon hızını kontrol eder ve kıkırdak yoluyla yüksek denge alımı ve hızlı tam derinlik penetrasyonu sağlar. Denge alım deneyleri ile, non-denge difüzyon hızı çalışmaları kullanılarak doğrulanabilir şarj etkileşimleri sonucunda yüksek alım gösteren taşıyıcılar aramak gerekir. Ancak, bu bağlayıcı etkileşimler kıkırdak yoluyla çözünür tam kalınlıkta penetrasyon sağlamak için doğada zayıf ve geri dönüşümlü olmalıdır. İdeal bir ilaç taşıyıcı alımı ve yüksek intra-kıkırdak ilaç konsantrasyonları için yeterince güçlü bağlayıcı sağlayan optimal bir şarj sahip olacak, ama tam kalınlıkta difüzyon engel olarak çok güçlü değil4. Sunulan deneyler, ilaç taşıyıcılarını hedef alan şarj tabanlı dokuların tasarım özelliklerine yardımcı olacaktır. Bu protokoller kıkırdak4ile TBM taşımacılığı karakterize için kullanılmıştır, Ancak, bu da kıkırdak ve diğer negatif yüklü dokular yoluyla ilaç ve ilaç taşıyıcıları çeşitli uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>316 Paslanmaz Çelik SAE Yıkayıcı</td><td>McMaster-Carr</td><td>91950A044</td><td>5 numara vida boyutu için, 0.14 "ID, 0.312" OD</td></tr><tr><td>96 Kuyulu Polistiren Plaka</td><td>Fisherbrand</td><td>12566620</td><td>Siyah</td></tr><tr><td>Akrilik Kalın Ölçer Levha</td><td>Reynolds Polimer</td><td>Yok</td><td>Denge dışı difüzyon ve 1-D difüzyon taşıma odası için</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>100x</td></tr><tr><td>Sığır Kıkırdak</td><td>Araştırması 87</td><td>N / A</td><td>2-3 haftalık, femoropatellar oluk</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Fisher</td><td>BioReagents</td><td>BP671-1</td><td></td></tr><tr><td>CPC + 14</td><td>LifeTein</td><td>LT1524</td><td>Özel tasarlanmış peptit</td></tr><tr><td>CPC + 20</td><td>LifeTein</td><td>LT1525</td><td>Özel tasarlanmış peptit</td></tr><tr><td>CPC + 8</td><td>LifeTein</td><td>LT1523</td><td>Özel tasarlanmış peptit</td></tr><tr><td>Hassas Görev Silecekleri</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Dermal Punch</td><td>MedBlades</td><td>MB5-1</td><td>3, 4 ve 6 mm</td></tr><tr><td>Ekonomi Düz Cam Mikroskop Slaytları</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>Düz Tabanlı Hücre Kültürü Plakaları</td><td>Corning Costar</td><td>3595</td><td>Şeffaf, 96 kuyulu</td></tr><tr><td>Esnek Sarma Filmi</td><td>Bemis Parafilm M Laboratuvar</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Altın Mühür Kapağı Cam</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>6378701</td><td># 1.5, 18x18 mm</td></tr><tr><td>Çekiçle Çalışan Delgeç</td><td>McMaster-Carr</td><td>3427A15</td><td>1/2" Çaplı</td></tr><tr><td>Çekiçle Tahrikli Delgeç</td><td>McMaster-Carr</td><td>3427A19</td><td>3/4" Çaplı</td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td>AT480/30m</td><td>Spektrofotometre Lazer Hafif</td></tr><tr><td>Düşük Mukavemetli Çelik Altıgen Somun</td><td>McMaster-Carr</td><td>90480A007</td><td>6-32 Diş boyutu</td></tr><tr><td>LSM 700 Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Manyetik Karıştırma Çubukları</td><td>Bel-Art Spinbar</td><td>F37119-0007</td><td>7x2 mm</td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Neopren Kauçuk Levha</td><td>McMaster-Carr</td><td>1370N12</td><td>1/32 "Kalınlık</td></tr><tr><td>Yağsız Kurutulmuş Sığır Sütü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7409</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı</td><td>Chemglass Yaşam Bilimleri</td><td>CGN1802145</td><td>150 mm çaplı</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su Corning</td><td>21-040-CMR</td><td>1x</td></tr><tr><td>Plaka Çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Fisherbrand</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>R-Cast Akrilik İnce Ölçer Levha</td><td>Reynolds Polimer</td><td>N/A</td><td>Siyah taşıma haznesi ekleri</td></tr><tr><td>RTV Silikon</td><td>Loctite</td><td>234323</td><td>Epoksi, Aşındırıcı olmayan, şeffaf</td></tr><tr><td>Neşter</td><td>TedPella</td><td>549-3</td><td>#10, #11 bıçaklar</td></tr><tr><td>Sinyal Alıcısı</td><td>Chroma Teknolojisi</td><td>ET515lp</td><td>Spektrofotometre Lazer Sinyal Alıcısı Geçmeli</td></tr><tr><td>Kapaklı Mikrosantrifüj Tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>TedPella</td><td>13508</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Mikroplaka Okuyucu</td><td>Biotek</td><td>H1M</td><td></td></tr><tr><td>Çinko Kaplama Alaşımlı Çelik Soket Başlı Vida</td><td>McMaster-Carr</td><td>90128A153</td><td>6-32 Diş boyutu, 1" Uzun</td></tr></tbody></table>

katyonik peptit taşıyıcılarının kıkırdak İçi taşıma Özelliklerinin karakterizasyonu

Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers

Vücuttaki kıkırdak gibi çeşitli negatif yüklü dokular, negatif yüklü aggrecans yüksek yoğunluklu nedeniyle hedeflenen ilaç teslim için bir bariyer mevcut ve bu nedenle, onların terapötik tepkiyi artırmak için geliştirilmiş hedefleme yöntemleri gerektirir. Kıkırdak yüksek negatif sabit yük yoğunluğuna sahip olduğundan, ilaçlar elektrostatik etkileşimlerden yararlanmak için pozitif yüklü ilaç taşıyıcıları ile değiştirilebilir, gelişmiş intra-kıkırdak ilaç taşıma için izin. Bu nedenle, uyuşturucu taşıyıcılarının taşınmasının incelenmesi, biyolojik bir tepkinin neden olduğu ilaçların etkinliğini tahmin etme de son derece önemlidir. Kıkırdak ekspertizlerinde katyonik peptid taşıyıcılarının denge alımını, penetrasyon derinliğini ve denge selektifüzyon hızını ölçebilen üç deney tasarımını gösteriyoruz. Denge alım deneyleri, kıkırdaktaki ilaçların terapötik konsantrasyonunu artırmada bir ilaç taşıyıcısının potansiyelini tahmin etmek için yararlı olan, çevredeki banyoya kıyasla, kıkırdak içindeki çözünür konsantrasyonunun bir ölçüsünü sağlar. Konfokal mikroskopi ile yapılan penetrasyon çalışmalarının derinliği, 1D çözünür difüzyonun yüzeyselden kıkırdağın derin bölgesine kadar görsel olarak temsil edilmesine olanak sağlar, bu da solutelerin matris ve hücresel hedef bölgelerine ulaşıp ulaşmadığını değerlendirmek için önemlidir. Özel olarak tasarlanmış bir taşıma odası kullanılarak yapılan denge dışı difüzyon oranı çalışmaları, floresan olarak etiketlenmiş solutelerin doku boyunca difüzyon oranlarını karakterize ederek doku matrisi ile bağlayıcı etkileşimlerin gücünün ölçülmesini sağlar; bu kıkırdak ile optimum bağlama gücü taşıyıcıları tasarımı için yararlıdır. Birlikte, üç taşıma deneylerinden elde edilen sonuçlar, ilaç dağıtım uygulamaları için zayıf ve geri döndürülebilir şarj etkileşimlerinden yararlanan en iyi şekilde şarj edilen uyuşturucu taşıyıcılarının tasarlanması için bir kılavuz sağlamaktadır. Bu deneysel yöntemler, uyuşturucu ve uyuşturucu taşıyıcı konjugatlarının taşınmasını değerlendirmek için de uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntemler menisküs, kornea ve vitreus mizah gibi diğer negatif yüklü dokuların hedef alınmasında kullanım için uyarlanabilir.

Kıkırdak tarafından CpCs denge emilimi sonrasında, solute doku tarafından yukarı alındığında banyo floresan azalır. Ancak, son banyonun floresan değeri baş harfine benzer kalırsa, bu, en az çözünür alım Olmadığını gösterir. Solute alımıbaşka bir onay doku gözle görülür floresan boya rengi renk değiştirmiş olmasıdır. Kıkırdaktaki solutelerin kantitatif alımı floresan değerleri standart eğri kullanılarak konsantrasyona dönüştürüldükten sonra alım oranı (RU)kullanılarak belirlendi. İlk banyo konsantrasyonu (C<sub...

Bu protokol kıkırdakta katyonik peptid taşıyıcıları için denge alımını, penetrasyon derinliğini ve non-denge difüzyon oranını belirler. Taşıma özelliklerinin karakterizasyonu etkili bir biyolojik yanıt sağlamak için çok önemlidir. Bu yöntemler, negatif yüklü dokuları hedeflemek için en uygun ücrete uygun bir uyuşturucu taşıyıcısı tasarlamak için uygulanabilir.

Katyonik Peptit Taşıyıcılarının Kıkırdak İçi Taşıma Özelliklerinin Karakterizasyonu

Several negatively charged tissues in the body, like cartilage, present a barrier to the targeted drug delivery due to their high density of negatively ...

Terapötiklerin ve taşıyıcılarının taşıma özelliklerinin karakterizasyonu etkili biyolojik yanıtları sağlamak için çok önemlidir. Bu yöntemler, negatif yüklü dokuları hedeflemek için en iyi şekilde şarj edilen uyuşturucu taşıyıcılarının tasarlanmasına yardımcı dır. Bu tekniklerin en büyük avantajı, doku yoluyla solute taşıma karakterize in vitro deneyler bir dizi in vivo terapötik etkinliğini daha iyi tahmin etmek için yeteneğidir.Kıkırdak hastalıkları, osteoartrit gibi, yoğun avasküler kıkırdak matris nüfuz ilaçların yetersizliği nedeniyle tedavi edilmezse kalır, prolog terapötik etkinliği prolog ilaç taşıyıcıları gerektiren. Üç milimetre çapındaki, bir milimetre kalınlığındaki kıkırdak ekstranında fazla PBS'yi nazikçe çıkarmak için hassas bir görev silme kullanarak başlayın. Hızlı bir şekilde her explant ıslak ağırlığı kaydetmek için bir denge kullanın ve hemen dehidratasyon önlemek için bir PBS banyo içine explants yerleştirin.Daha sonra, 96 kuyulu bir plakanın iç kuyularına her biri için 300 mikrolitre taze hazırlanmış, 30 mikromolar floresan olarak etiketlenmiş katyonik peptid taşıyıcı çözeltisi ekleyin ve çözeltinin her kuyuya bir ekstrüzyon eklemek için bir spatula kullanın. Çevredeki kuyuların her birini 300 mikrolitre PBS ile doldurun ve tabağı bir kapakla kapatın. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakanın kenarlarını esnek bir filmle kapatın ve plakayı 15 milimetrelik bir yörüngeyle dakikada 50 devirde 24 saat boyunca 37 derece lik bir kuvözde çalkalayıcıya yerleştirin.Kuluçka sonunda, her kuyudan ayrı polipropilen tüpler içine denge banyosu aktarın ve standart bir eğri oluşturmak için stok 30 mikromolar katyonik peptid taşıyıcı çözeltiseri seyreltme yapmak. Daha sonra, her çözeltinin 200 mikrolitresini ve standartını siyah 96 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına aktarın ve floresan etiketin uyarma ve emisyon dalga boylarına göre her numune nin ve standardın floresan okumalarını elde edin. Bir kıkırdak ekstrüzyon içinde katyonik peptit taşıyıcı penetrasyon derinliğini belirlemek için, altı milimetre çapında kesmek için bir neşter kullanın, yarım milimetre kalınlığında kıkırdak ekstrüzyon ve proteus inhibitörü takviyeli PBS ile ortaya çıkan yarım disk parçaları nemlendirmek.Özel olarak tasarlanmış tek boyutlu bir taşıma odasının kuyunun ortasına epoksi uygulayın ve ekstronun yüzeysel tarafı odanın yukarı tarafına bakacak şekilde kuyu içinde bir yarım disk ekstronu emniyete alın. Kıkırdağın difüzyon yüzey alanı ile teması önlemek için kuyudan herhangi bir fazla tutkal çıkarın ve ekstrplant her iki tarafına proteaz inhibitörü takviyeli PBS 80 mikrolitre ekleyin. Pipet sıvı yukarı ve aşağı diğer tarafa sızıntı olup yok kontrol etmek için explant bir tarafında.Sızıntı yoksa, proteaz inhibitörü takviyeli PBS'yi yukarı taraftan 30 mikromolar floresan etiketli katyonik peptit taşıyıcı çözeltisi ile değiştirin ve taşıma odasını dikkatlice hücre kültürü yemeğine yerleştirin. Katyonik peptit taşıyıcı çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için yemeğin tabanını PBS ile kapatın. Yukarı ve aşağı odalarından gelen çözümler arasında doğrudan temas olmamasına dikkat etmek.15 milimetrelik bir yörünge ile oda sıcaklığında dört veya 24 saat ve dakikada 50 devir için parçacık sedimantasyon sınırlamak için bir shaker üzerinde kapalı çanak yerleştirin. Kuluçka sonunda, eksplantları hazneden çıkarın ve her ekstronun merkezinden yaklaşık 100 mikron kalınlığında dilimler kesin. Bir cam slayt ve bir kapak kayma arasında explant her dilim yerleştirin ve taze proteaz inhibitörü takviyeli PBS ile dilimleri nemlendirin.Kaydırağı konfokal mikroskobun aşamasına sabitleyin ve dilimin tam kalınlığı boyunca 10X büyütme de bir Z-yığın floresan görüntü elde edin. Resim dosyasını ve resim J'yi açın, Resim'i tıklatın ve açılır menüden Yığınlar ve Z Projesi'ni seçin. Ardından, dilim numaralarını birden son dilime ve Projeksiyon Türü'nün altına girdikten sonra ortalama yoğunluğu seçin ve Tamam'ı tıklatın.Non-denge katyonik peptid taşıyıcı kıkırdak difüzyon oranını değerlendirmek için, taşıma odasının her yarısını monte, bir büyük kauçuk conta dahil etmek, bir polimetilmetakrilat eklemek, ve küçük bir kauçuk conta. Bir kıkırdak ekstrüzyon kalınlığını ölçün, sonra yukarı oda bakan yüzeysel yüzey ve montaj tamamlamak için birlikte iki yarısı sandviç ile plastik eklemek kuyularında explant yerleştirin. Proteaz inhibitörü takviyeli iki mililitre ile upstream odası doldurmadan önce sıkıca birlikte yarım vida için bir anahtar kullanın.Yukarı daki odadan sızıntı olup yok. Herhangi bir sızıntı tespit edilirse, proteaz inhibitörü takviyeli iki mililitre ile aşağı odası doldurun. Hem yukarı hem de aşağı odacıklara tek bir mini karıştırma çubuğu ekleyin ve odayı spektrofotometreden gelen lazer inakış odasının merkezine doğru odaklanmış olacak şekilde hizalanmış bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin.Spektrofotometrenin aşağı çekme odasının arkasındaki sinyal alıcısı kısmıyla, en az beş dakika boyunca kararlı, gerçek zamanlı aşağı floresan emisyon okumaları toplayın. Kararlı bir okuma elde ettikten sonra, üç mikromolar son banyo konsantrasyonuna upstream odasına floresan etiketli katyonik peptid taşıyıcı stok çözeltisi önceden hesaplanmış bir hacim ekleyin ve solute taşıma eğim sürekli bir artış ulaşmak için izin verirken aşağı floresan sinyali izlemek. Sabit bir duruma ulaşıldıktan sonra, 20 mikrolitre çözeltiyi akıntı odasından bir ani test için aşağı akış odasına aktarın ve gerçek zamanlı aşağı floresan okumalarını toplayın.Çok yüksek bir pozitif yük, taşıyıcı kıkırdak matrisinin negatif yüklü agrega gruplarına çok güçlü bağlanan gibi yüzeysel bölgeye solute penetrasyon sınırlandıracaktır. Tersine, zayıf ve geri dönüşümlü yük etkileşimlerinden yararlanabilen taşıyıcılar derin doku bölgesine nüfuz eder. Ancak, en iyi şekilde şarj edilen bir ilaç taşıyıcısı sadece dokunun derin bölgelerine nüfuz etmekle kalmamış, aynı zamanda gösterildiği gibi denge banyosu ve doku ıslak ağırlığının floresan ölçümleri kullanılarak belirlenebilen yüksek bir doku içi alımını da gösterecektir.Non-denge difüzyon taşıma deneyleri giderek artan eğim ile oluşturulan bir veri eğrisi neden. Eğrinin ilk bölümü, solute matris bağlama etkileşimleri oluşurgibi kıkırdak yoluyla solute difüzyon temsil eder. Solutes aşağı odasına ulaştığında, floresan okumaları zamanla arttıkça eğrinin eğimi artar.Eğrinin bu ikinci bölümü daha sonra sabit bir eğime ulaşır ve sabit durum difüzyonu temsil emzilir. Eğrinin sabit durum kısmına çizilen teğet sel bir çizginin X-keseği, sabit durum difüzyonuna veya tau lag'ine ulaşmanın gereken zamanı gösterir. Akıntının yukarısından aşağı odaya çözelti transferinden sonra floresan da bir ani artış gözlenir ve bu noktada floresan yoğunluğu konsantrasyonu ilişkilendirmek için stabilize floresan yoğunluğu kullanılabilir.Temsili etkili diffusivity ve istikrarlı durum difüzyon değerleri daha sonra, belirtildiği gibi hesaplanabilir. Sabit durum difüzörünün, tüm şarj tabanlı bağlama alanlarının işgal edilmesi sonucunda etkili diffusivity'den iki büyüklük sırası olduğunu unutmayın. Bu nedenle, bu noktada, difüzyon aynı boyutta KiK'ler arasında benzer sabit durum difüzyon değerleri ile sonuçlanan, yük değil boyuta dayanır.Kıkırdak morfolojisi ve çözelti konsantrasyonundaki değişiklikleri önlemek ve doğru ve tekrarlanabilir veri toplamayı sağlamak için eksplant hidrasyonunu koruyun ve deney boyunca çözelti buharlaşmasını en aza indirin. En iyi ücret ilaç taşıyıcı tasarımı nı takiben, çeşitli konjugasyon teknikleri gelişmiş doku hedefleme için ilaç değiştirmek ve biyolojik etkinliğinin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için kullanılabilir.

characterization-intra-cartilage-transport-properties-cationic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Kanser ilaçlarını tümör bölgelerine yüksek özgüllük ve azaltılmış yan etkilerle ulaştırmak için nanopartiküllere dayalı yeni yöntemler gereklidir. Burada, hidrojen peroksit aracılı oksidasyon ile kolayca hazırlanabilen ve yükleri serbest bırakmak için indirgeyici bir tümör ortamı altında verimli bir şekilde ayrışabilen disülfür çapraz bağlı miselleri açıklıyoruz.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Geçenlerde geliştirilen deneysel ve sayısal yöntemlerin yardımıyla eklem kıkırdağının genelinde Yüklü ve yüksüz moleküllerin taşınmasını araştırmak için bir protokol öneriyoruz.

Deneysel ve Sonlu Eleman Protokolü Eklem Kıkırdak genelinde Nötr ve Yüklü Çözünenlerin Ulaştırma Araştırma

Bu hücre Penetran dizileri birleştirme biotin avidin açılan yenilik ile tabanlı sisteme intraselüler protein-protein etkileşimleri çalışmaya bir protokoldür. Ana avantajdır hedef sıra canlı hücreler yerine hücre lysates ile inkübe ve bu nedenle etkileşimleri hücresel bağlamı içinde ortaya çıkar.

İntraselüler Protein-protein etkileşimleri çalışmaya Biotinylated hücre Penetran peptidler

Biz macroporous microcarriers bir hücre genişletme protokolü ve kullanımları decellularized doku matris temel için bir perfüzyon biyoreaktör teslim sistemi olarak öneriyoruz. Biz de hücre çoğalması ve canlılığı üzerinde microcarriers kültürlü hücre belirlemek için farklı teknikler içerir. Ayrıca, biyoreaktör kültürler sonra hücreleri işlevselliğini göstermektedir.

Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model

Burada, plasental kondroitin sülfat A bağlama peptid (plCSA-BP) sentezi için bir iletişim kuralı mevcut-Birleşik lipid-polimer nano tanecikleri ile tek adım sonication ve bioconjugate teknikleri. Bu parçacıklar tedavi hedeflenen teslimat en insan tümörleri ve kanserleri ve plasental bozuklukları tedavisinde plasental trophoblasts için bir roman araç oluşturmaktadır.

Sentez ve karakterizasyonu plasental kondroitin sülfat (plCSA) - Lipid hedefleme - polimer nano tanecikleri

Bu iletişim kuralı ile lizin-tirozin-fenilalanin (KYF) tripeptit stabilize bir oleik acids-platinum(II) eşlenik nanoemulsion sentezlemek için verimli bir yöntem açıklanır. Nanoemulsion formlar KYF ve eşlenik olmasını, kendinden montajlı yolu ile hafif sentetik koşullar altında.

Tripeptit stabilize Nanoemulsion oleik asit

Polielektrolit kompleks misellerin, polielektrolitlerin ve hidrofilik yüklü blok kopolimerlerin oluşturduğu çekirdek kabuklu nano partiküllerin tasarımı, montajı ve karakterizasyonu için protokoller ve temsili veriler salıyoruz.

Polielektrolit Kompleksi Misellerinin Montajı ve Karakterizasyonu

Bu protokol, siklik hücreye nüfuz eden peptitlerin aromatik çapraz bağlarla sentezini ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesini açıklar.

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Bu protokol, immün boyama ile hücre adezyonu, organoid morfolojisi ve gen ekspresyonu için biyofonksiyonel kendi kendine birleşen peptitleri değerlendirmeyi amaçlar. Yoğun testler için organoidleri elde etmenin uygun maliyetli bir yolunu sağlamak için bir kolorektal kanser hücre hattı kullanacağız.

Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Bu protokol, tekrarlanabilirliği sağlamak ve farklı bilimsel laboratuvarlarda genel iş akışını kolaylaştırmak için CAGE bazlı iyonik sıvı sistemlerinin hazırlanmasına yönelik standardizasyonu tartışmaktadır.

Transdermal İletim için CAGE Bazlı İyonik Sıvı Sistemlerinin Geliştirilmesi, Karakterizasyonu ve Değerlendirilmesi

Keşfedin kıkırdak içi taşıma özelliklerini katyonik peptit taşıyıcılar için. Bu yöntem, negatif yüklü dokuları hedefleyen optimal yüklü ilaç taşıyıcıları tasarlamaya yardımcı olur ve in vivo tedavi etkinliğini öngörür.

Katyonik Peptit Taşıyıcılarının Kıkırdak İçi Taşıma Özelliklerinin Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet