免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

この方法を用いることで、IGA腎症におけるマイクロRNAの変化を小動物モデルを用いて簡便に確認することができ、ヒト腎生検を行わずにIGA腎症の研究が可能となります。このプロトコルは、IGA腎症の遺伝学に関する新たな洞察を提供することができ、腎臓病の新しい診断法や新しい治療法の発見に役立つ可能性があります。マウスが適切に麻酔されていることを確認した後、外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの腹壁に3〜4センチメートルの正中線切開を行い、腎臓の両側を特定します。

肋骨と横隔膜を切開して心臓を露出させます。右心房を切開した後、マウスの全身にPBSが灌流されていることを示す腎臓の色が淡黄色に変わるまで、左心室にPBSを注入します。腎動脈、腎静脈、尿管を切開し、腎臓を摘出します。

シリコンホモジナイザーと700マイクロリットルのフェノールグアニジンベースの溶解試薬を使用して、室温で30ミリグラムの腎臓サンプルをホモジナイズします。ライセートを生体高分子シュレッダースピンカラムに移し、室温で15, 000Gで2分間遠心分離します。原稿の指示に従ってRBNA精製を続けます。

最終洗浄後、シリカ膜ベースのスピンカラムに30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加え、それを8, 000Gで1分間遠心分離してRNAを溶出させます。cDNA合成には、2マイクロリットルの核酸ミックス、2マイクロリットルの逆転写酵素ミックス、および4マイクロリットルのバッファーをサンプルあたり合計8マイクロリットルのマスターミックスを調製します。8マイクロリットルのマスターミックスを8ウェルチューブストリップの各ウェルに加えます。

全RNAをヌクレアーゼフリー水で希釈します。次に、12マイクロリットルの全RNA溶液をストリップの各ウェルに加えます。サンプルをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で60分間インキュベートし、次に摂氏95度で5分間インキュベー

定量的なリアルタイムPCRを行うには、原稿の指示に従ってマスターミックスを調製し、96ウェル反応プレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのマスターミックスを加えます。調製したcDNAを2.5マイクロリットルを各ウェルに加えます。反応プレートをリアルタイムPCR装置に入れます。

次に、摂氏95度で15分間の初期活性化、続いて摂氏94度で15秒間の変性サイクルを40サイクル、摂氏55度で30秒間アニール、摂氏70度で30秒間の伸展をプログラムします。デルタデルタCT法を用いて遺伝子発現を定量化します。このプロトコルは、Balb/cマウスの腎臓をコントロールとして使用して、HIGAマウスの腎臓におけるmicroRNAの発現レベルを調査するために使用されました。

3つのIGA腎症関連マイクロRNAの発現レベルを測定しました。2つのグループの相対的なmicroRNA発現レベルをT検定を使用して比較し、Pが0.05未満であれば統計的に有意であった。miR-155-5pは対照群と比較してHIGA群で3.3倍、miR-21-5pは1.58倍高発現しました。

miR-1461-5pの発現は、両群間で有意差は認められませんでした。このプロトコールを試みる際には、マスク、手袋、キャップを着用し、環境中のヌクレアーゼが実験に影響を与えるのを防ぐために、実験室のテーブルとツールを清潔に保つことが重要です。この実験手法は、現在、当研究室で実用化されています。

IGA腎症の新しい診断法と治療法を確立することが目標です。