Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Alle Membranproteine sind wichtige Angriffspunkte in der Wirkstoffforschung. Die Produktion von Membranproteinen im größten Maßstab ist nach wie vor ein Engpass bei der Durchführung biochemischer, biophysikalischer und struktureller Membranproteinstudien. Mit dieser Methode können Membranproteine in-vitro effizient synthetisiert und gereinigte Proteoliposomen in kurzer Zeit mit einer hohen Erfolgsquote hergestellt werden.

Nach Zugabe der entsprechenden Reagenzien, einschließlich des zellfreien Expressionsplasmids, zur Erzeugung eines Transkriptionsreaktionsgemisches wird der Röhrcheninhalt durch sanfte Umkehrung oder Klopfen gemischt und eine schnelle Drehung in einer Mikrozentrifuge durchgeführt. Nach dem Schleudern inkubieren Sie das Gemisch der Transkriptionsreaktion sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einem Mischen und einem Schleuderschritt. Zur Herstellung des Translationspuffers wird die Stammlösung mit frischem Reinstwasser verdünnt.

Verwenden Sie für die Translation in kleinem Maßstab 100-Mikroliter-Dialysebecher, die mit Reinstwasser gewaschen werden, um das Glycerin von der Dialysemembran zu entfernen. Geben Sie einen Milliliter Reinstwasser in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie einen Dialysebecher mit kleinem Maßstab in das Röhrchen ein. Geben Sie dann 500 Mikroliter Reinstwasser in die Tasse für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Zur Herstellung von Liposomen wird eine Lipidlösung mit 50 mg Lipiden in einen Verdampfungskolben gegeben. Stellen Sie den Kolben in einen Rotationsverdampfer, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Wenn auf der Oberfläche des Kolbenbodens eine dünne, gleichmäßig verteilte Lipidschicht gebildet wurde, wird der Kolben über Nacht unter Unterdruck in einen Vakuumexsikkator überführt, um das Lösungsmittel vollständig zu entfernen.

Nehmen Sie am nächsten Morgen die Kolben aus dem Exsikkator und überprüfen Sie den dünnen Lipidfilm. Geben Sie einen Milliliter Translationspuffer in den Kolben und drehen Sie den Kolben, um den Puffer über den dünnen Lipidfilm zu verteilen. Nach fünf Minuten wird der Kolben mit Ultraschall beschallt, wobei der Winkel gelegentlich geändert wird, damit die Lösung die gesamte Lipidfilmoberfläche berühren kann.

Die Beschallung wird gestoppt, wenn das Lipid vollständig aus dem Kolben entfernt wird und die Liposomensuspension gleichmäßig wird. Übertragen Sie dann die Liposomensuspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bevor Sie eine In-vitro-Proteintranslation durchführen, lassen Sie ein Röhrchen mit Weizenkeimextrakt aus einer Lagerung bei minus 80 Grad einige Minuten lang bei Raumtemperatur in Wasser schwimmen, um das Material schnell aufzutauen.

Nach dem Auftauen des Extrakts den Tubeninhalt sofort durch leichtes Indrehen mischen. Dann schleudern Sie nach unten und legen Sie das Rohr auf Eis. Fügen Sie den Weizenkeimextrakt, die mRNA und die Liposomen hinzu, um ein Translationsreaktionsgemisch zu erzeugen.

Mischen Sie den Röhrcheninhalt durch sanftes Wenden oder Klopfen und führen Sie eine schnelle Drehung in einer Mikrozentrifuge durch. Um eine In-vitro-Proteintranslation in kleinem Maßstab durchzuführen, entfernen Sie das Wasser aus dem Dialysebecher und dem Röhrchen und geben Sie einen Milliliter Translationspuffer in das Röhrchen und 300 Mikroliter in den Becher. Nehmen Sie 60 Mikroliter Translationsreaktionsgemisch.

Führen Sie die Pipettenspitze in den Translationspuffer im Dialysebecher ein. Dann spritzen Sie die Mischung langsam und sanft ein. Das Reaktionsgemisch mit höherer Dichte sinkt spontan auf den Boden des Bechers und bildet eine Schicht.

Decken Sie den Becher mit einem Deckel ab, um eine Verdunstung zu verhindern. Um eine großflächige Translation durchzuführen, geben Sie 22 Milliliter Translationspuffer in ein 25-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie einen Zwei-Milliliter-Dialysebecher in das Röhrchen ein. Geben Sie zwei Milliliter Translationspuffer in den Dialysebecher.

Nehmen Sie 500 Mikroliter des Translationsreaktionsgemisches, injizieren Sie das Gemisch langsam und vorsichtig in den Translationspuffer im Becher. Inkubieren Sie die Reaktionen 24 Stunden lang bei 15 Grad Celsius. Am nächsten Tag mischen Sie die Reaktion im Dialysebecher durch Pipettieren gründlich und überführen die rohen Proteoliposomensuspensionen in neue Röhrchen.

Um die Proteoliposomen zu reinigen, sedimentieren Sie das Proteoliposom in den Rohsuspensionen durch Zentrieren. Waschen Sie dann das Proteoliposom, indem Sie dreimal in der entsprechenden Menge eiskalten PBS-Puffers resuspendieren. Nach dem Waschen die Proteoliposomenpellets in einem kleinen Volumen PBS gründlich resuspendieren und das Suspensionsvolumen mit einer Mikropipette messen.

Fügen Sie dann PBS hinzu, um die Lautstärke der Suspension anzupassen. Übertragen Sie jede Suspension in ein neues Mikroröhrchen. Um eine SDS-Seitenanalyse einzurichten, fügen Sie 70 Mikroliter Wasser und 40 Mikroliter dreifach konzentrierten SDS-Seiten-Probenpuffer zu 10 Mikrolitern jeder Proteoliposomensuspension hinzu.

Richten Sie ein SDS-Seitengel mit fünf bis 20 % Gradient in einer Elektrophoresekammer ein. Beladen Sie das Gel mit zwei Mikrolitern des Proteingrößenmarkers, drei, sechs und 12 Mikrolitern jeder Proteoliposomenprobe und 10 Mikrolitern Rinderserumalbuminstandards. Führen Sie nach dem Laden der Proben die Elektrophorese durch und färben Sie das Gel anschließend mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue.

Zum Schluss entfärben Sie das Gel in heißem Wasser unter leichtem Schütteln und scannen das Gelbild. Unter Verwendung dieses Protokolls, wie gezeigt, kann eine Vielzahl von Membranproteinen mit drei oder mehr Transmembranhelices in kurzer Zeit leicht als Proteoliposomen hergestellt werden. Bei diesem Doppelschicht-Dialyseverfahren kann eine kontinuierliche Zufuhr von Substraten und die Entfernung des Nebenprodukts sowohl an der Ober- als auch an der Unterseite des Reaktionsgemisches über einen langen Zeitraum effizient durchgeführt werden, was zu einer hervorragenden Translationseffizienz führt.

Die Doppelschicht-Dialysemethode führt zu einer vier- bis 10-fachen Steigerung der Produktivität im Vergleich zur alleinigen Verwendung der Doppelschicht- oder Dialysemethoden. Die Sammlung der synthetisierten Proteoliposomen durch Zentrifizierung und ihre teilweise Aufreinigung mit einem Waschpuffer verkürzt den Aufreinigungsprozess der Membranproteine erheblich. Dieses zellfreie System ist einfach zu manipulieren und hochgradig skalierbar.

Es kann auch zur Herstellung von Gedächtnisproteinen verwendet werden, die mit anderen Methoden nur schwer zu exprimieren sind. Diese Methode ist äußerst hilfreich für Untersuchungen und Experimente, die Membranproteine wie Antimembranprotein, Antikörperproduktion, SPR, Elisa und AlphaScreen verwenden oder darauf abzielen.