Name: Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a medir potenciais de ação ópticos em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando fotometria modular de alta velocidade. Este método simplificado permite triagens de toxicidade em larga escala.

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Os autores gostariam de reconhecer a Cairn Research Ltd. por sua gentil contribuição financeira que cobria os custos de produção desta publicação. Além disso, agradecemos à Sra. Ines Mueller e à Sra. Stefanie Kestel pelo excelente apoio técnico.
A pesquisa dos autores é apoiada pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK), o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 e sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2067/1- 390729940) e o Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Preparações celulares
NOTA: Os iPSCs humanos utilizados neste protocolo foram derivados de doadores saudáveis e diferenciados em monocamadas utilizando modulação de moléculas pequenas totalmente definidas de técnicas de sinalização e purificação de lactatos, conforme descrito anteriormente12,13,14. os iPSC-CMs foram mantidos a cada 2-3 dias com um meio de cultura descrito abaixo.
<ol><li>Prepare um meio de cultura de meio basal (RPMI 1640) e 2% de suplemento (B27). Armazenar a 4 °C. Use à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prepare um meio de revestimento de meio basal (RPMI 1640), 2% de suplemento (B27) e 1:2000 INibidor ROCK. Armazenar a 4 °C. Use em RT.</li>
	<li>Cubra as tampas de vidro redondo #0 de 10 mm com 150 μL de matriz de membrana de porão livre de fator 1:60 e incubar a 4 °C por 4 h. NOTA: A otimização do volume do deslizamento de tampas é necessária para garantir que todo o vidro esteja coberto, mantendo a tensão adequada da superfície para evitar derramamentos. Recomenda-se 150 μL para tampas redondas de 10 mm. Tamanho do lote, tipo de deslizamento de cobertura, volume de deslizamento e tipo de placa de cultura podem ser adequados às necessidades dos experimentadores.</li>
	<li>Inicie a dissociação iPSC-CM com um reagente de dissociação celular baseado em EDTA. Certifique-se de que a monocamada esteja completamente separada, lavando suavemente com uma pipeta de 1.000 μL.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione o meio de revestimento de duplo volume. Centrífuga por 10 min a 100 x g.</li>
	<li>Resuspense a pelota com um volume desejado (volume de ressuspensão) de meio de revestimento. Conte células manualmente ou eletronicamente.</li>
	<li>Selecione a densidade ideal por deslizamento de cobertura (15.000) que permitirá a análise celular isolada mais tarde.</li>
	<li>Calcule o volume de suspensão celular 'ativa' (A) necessária para emplacar todas as tampas nesta densidade desejada. Aplique a seguinte fórmula e retire-se em um tubo separado: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Calcule o volume de meio de revestimento extra (B) necessário para acomodar cada deslizamento de cobertura em um volume desejado. Aplique a seguinte fórmula e adicione o volume resultante ao tubo de suspensão ativa: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Remova a matriz das manchas e aplique o 'volume de deslizamento de cobertura' da suspensão celular (A+B) em cada deslizamento de cobertura. Resuspensar regularmente no tubo para garantir até mesmo a distribuição celular.</li>
	<li>Incubar a 37 °C por 1 h. Encha suavemente o poço com meio de revestimento.</li>
	<li>Após 24h, troque mídia com meio de cultura normal e mantenha a cada 2-3 dias.</li>
</ol>2. Configuração experimental
<ol><li>Equipar um microscópio de epifluorescência invertido com uma ampliação de 40x, lente de alta abertura numérica (N.A: &gt; 0,75) para realizar experimentos.</li>
	<li>Junte um LED branco quente de comutação rápida para a porta de iluminação transmitida do microscópio. Insira um simples filtro vermelho de 660 nm no caminho da luz transmitida. NOTA: Esta luz pode ser ativada durante experimentos de fotometria para observar a amostra sem contaminar o sinal fluorescente verde.</li>
	<li>Monte uma cabeça LED de 470 nm de comutação rápida para gravação de fotometria. Insira um filtro de excitação 470/40 na porta epifluorescente do microscópio para limpar a luz gerada pelo LED. NOTA: Para a quantificação ideal de sinal é recomendado um sistema de iluminação com controle de feedback de alta velocidade da saída óptica.</li>
	<li>Insira um cubo de microscópio contendo um divisor de feixe de passagem de 495 nm no carrossel da unidade espelho dentro do microscópio.</li>
	<li>Encaixe um braço de detecção contendo um diafragma de campo ajustável na porta de montagem C do microscópio para permitir a seleção da região de interesse.</li>
	<li>Separadamente, acasalar um detector de fotomultiplier (PMT) e uma câmera USB no microscópio. Isso formará a base do sistema de detecção de emissões.</li>
	<li>Insira um cubo de filtro contendo um divisor de feixe de passagem de 565 nm de comprimento e um filtro de emissão 535/50 na porta PMT. Isso divide a luz de emissão entre os dois detectores. NOTA: Uma câmera conectada à porta transmitida do sistema de detecção de emissões pode detectar luz transmitida sob campo brilhante durante todos os experimentos.</li>
	<li>Acoplam o PMT a uma fonte de alimentação e um amplificador PMT. Conecte a saída do amplificador PMT a um pino de entrada analógico de um sistema de aquisição de dados.</li>
	<li>Filtrar dados analógicos do PMT a 1 kHz ou superior.</li>
	<li>Digitalize os dados em uma frequência que seja pelo menos o dobro da maior frequência presente no sinal analógico (2 kHz ou superior) para cumprir os critérios de Nyquist e evitar o aliasing.</li>
</ol>3. Carregamento celular com VF2.1Cl
NOTA: Todas as etapas que envolvam este corante devem ser realizadas em condições de baixa luz.
<ol><li>Prepare uma solução de banho de Tyrode (em mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glicose, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 e quente a 37 °C.</li>
	<li>Prepare uma alíquota de solução de carregamento em um tubo de microcentrifuuge misturando 5 μL de 1.000x VF2.1Cl e 50 μL de solução poloxamer solubilizadora de 20%.</li>
	<li>Aplique 5 μL da solução de carregamento a 5 mL de solução de Tyrode aquecida (concentração total de 0,1x de corante) em uma placa de Petri de 20 mm. NOTA: A concentração final de corante é de 0,1x. Este é o 1/10sugerido pelo fabricante. Isso conserva recursos, garante citotoxicidade insignificante e, importante, ainda retém sinais ópticos claros de células carregadas com altas relações de sinal a ruído.</li>
	<li>Adicione um único deslizamento de tampa iPSC-CM ao prato e incubar a 37 °C por 20 min.</li>
	<li>Monte uma câmara de imagem de células vivas aquecidas. Monte no palco do microscópio e preencha com 500 μL de solução fresca de Tyrode.</li>
	<li>Lave o deslizamento com a solução de Tyrode fresco a 37 °C.</li>
	<li>Aplique cuidadosamente a tampa iPSC-CM na câmara de banho pré-aquecida usando fórceps de ponto fino. NOTA: Certifique-se de que a câmara e seu conteúdo estão sempre aquecidos a temperaturas fisiológicas. Se desejar, comece com perfusão contínua da solução aquecida de Tyrode.</li>
</ol>4. Estimulação elétrica do campo
NOTA: O acionamento externo do iPSC-CM é opcional, mas útil para a padronização da dinâmica celular e parâmetros experimentais. Aumenta a facilidade de análise e permite a investigação de efeitos dependentes da frequência.
<ol><li>Conecte uma inserção de estimulação com dois eletrodos de platina espaçados 5 mm de distância na câmara de gravação.</li>
	<li>Conecte um estimulador externo à inserção de estimulação. Definido para 5 ms pulsos de campo bipolar a 0,5 Hz.</li>
	<li>Determine a tensão de estimulação ideal aumentando o estímulo de 1 V para cima. O estímulo limiar é definido como a menor tensão na qual as células começam a se contrair. Aplique tensões cerca de 25% acima deste limite. A faixa normal é entre 1 V e 30 V.</li>
	<li>Corrija a frequência de estimulação com o estimulador externo ou ativá-lo com software de aquisição.</li>
</ol>5. Aquisição potencial de ação óptica
NOTA: Este protocolo utiliza um software comercial para aquisição e análise.
<ol><li>Visualize os miócitos na vista brightfield usando o caminho de luz transmitido e a câmera USB.</li>
	<li>Selecione uma célula isolada e corte firmemente seu caminho óptico com o diafragma de campo garantindo que apenas a luz da célula de interesse seja monitorada.</li>
	<li>Ative o amplificador PMT e defina a fonte PMT para 750 V.</li>
	<li>Execute o protocolo de estimulação (ver passo 4) juntamente com o software de aquisição e ative simultaneamente a luz de excitação de 470 nm. Este último pode ser feito através de um painel remoto ou automatizado a uma intensidade fixa (sinal TTL).</li>
	<li>Ajuste o ganho e o deslocamento do amplificador PMT para garantir que o sinal não satura e seja otimizado para a faixa de detecção do sistema de gravação.</li>
	<li>Recorde de 10 varreduras garantindo que potenciais de ação estáveis sejam detectados.</li>
	<li>Continue gravando e mova imediatamente o estágio do microscópio para adquirir brevemente o sinal de fundo de uma região desprovida de células. Desligue a luz de excitação. NOTA: Este valor de fundo(F offset ) será usado para responder por qualquer fluorescência de fundo.</li>
	<li>Se desejar, perfuse localmente perfuse drogas como 1 μM nifedipine para identificar respostas celulares à manipulação farmacológica.</li>
	<li>De forma sequencial, repita os passos 5.2-5.7, cada vez selecionando uma nova célula. Troque as tampas se desejar para garantir um alto volume de negócios experimental em uma única sessão. NOTA: Os protocolos de carregamento e aquisição de imagens estão descritos na Figura 2.</li>
</ol>6. Análise de dados
<ol><li>Abra uma gravação salva com o software de análise e uma média de 10 varreduras contendo potenciais de ação estimulados de uma única célula.</li>
	<li>Pegue uma média do sinal da linha de base representando Fdeslocamento e subtraia isso a partir do traço médio.</li>
	<li>Calcule ∆F/F0 com a seguinte fórmula (onde F é medido fluorescência e F0 é fluorescência diastólica): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identifique a linha de base de rastreamento (diastólica) e a área de interesse (AP) e meça os parâmetros potenciais de ação cardíaca desejados. Isso inclui, mas não se limita ao tempo de decadência para 50% (APD50) e 90% (APD90) de repolarização.</li>
	<li>Exporte os dados desta única célula para um software de planilha.</li>
	<li>Repita as etapas 6.1 – 6.5 para todas as gravações. Avalie os resultados com testes não pagos adequados ou análises de variância.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Figura 2: Protocolos de carregamento e aquisição de imagens. (A) Gráfico de fluxo do protocolo completo de carregamento VF2.1Cl para iPSC-CMs e cardiomiócitos nativos. (B) Um esquema simplificado de configurações de divisor de feixe (BS) e filtro utilizado neste protocolo para excitação e detecção de emissão de VF2.1Cl em resposta a alterações na tensão transmembrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514(2008).</li>
<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2%2C3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li>
<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

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Aqui descrevemos um protocolo básico para adquirir facilmente perfis de AP detalhados de iPSC-CMs isolados adequados para modelagem eletrofisiológica e rastreamento de medicamentos cardíacos. Detectamos APs regulares e robustos de nossos iPSC-CMs pouco semeados, o que sugere a funcionalidade do indicador e a fidelidade metodológica.
Devido ao amplo espectro de metodologias comerciais para reprogramação do iPSC e falta de padronização para protocolos de diferenciação cardíaca, os modelos basead...

A modelagem eletrofisiológica de cardiomiócitos e a construção de plataformas eficientes para rastreamento de medicamentos cardíacos é essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para uma variedade de distúrbios arrítmicos. A rápida expansão da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) produziu incursões promissoras na modelagem de doenças humanas e na investigação farmacológica usando cardiomiócitos isolados derivados do paciente (iPSC-CM). Técnicas "padrão-ouro" para caracterização eletrofisiológica dessas células através de patch-clamp (grampo atual) podem quantificar o potencial de ação (AP) morfologia e duração, no entanto, este método é incrivelmente complexo e lento, e não é adequado para aquisição de dados de alto rendimento1. IPSC-CMs são regularmente relatados como com um potencial de membrana diastólica aumentada e aumento da corrente de vazamento quando comparados aos cardiomiócitos nativos adultos2. Sugere-se que o tamanho celular menor e a redução da capacitância da membrana observada nos iPSC-CMs podem produzir algum erro sistemático ao usar a técnica de grampo atual, talvez explicando esses desvios3. A fim de maximizar a utilidade de uma plataforma iPSC-CM, um método adicional é valioso para aumentar o throughput e garantir a precisão dos dados ao caracterizar alterações de tensão transmembrana em um único nível celular em iPSC-CMs.
Os corantes sensíveis à tensão (VSD) têm sido há muito tempo um método proposto para fornecer análises mais rápidas, não invasivas e equivalentes da cinética AP cardíaca comparativa com as das técnicas tradicionais4. Um estudo recente demonstrou a adequação da fotometria da sonda sensível à tensão racionmétrica para quantificar com precisão o AP5cardíaco . Além disso, a capacidade de escalar prontamente abordagens de fotometria óptica empresta essa técnica a telas de cardiotoxicidade em larga escala críticas no desenvolvimento de medicamentos terapêuticos (por exemplo, CiPA). O desenvolvimento de protocolos padronizados de cardiotoxicidade em um estudo cego de vários sites usando matriz de microeletrodos e técnicas ópticas de sensoriamento de tensão demonstrou o valor-chave desta abordagem6.
Muitos corantes potencialiométricos estão comercialmente disponíveis, e o desenvolvimento sintético contínuo de novas sondas mostra um potencial empolgante para simplificar sua eficácia em uma variedade de construções cardíacas e neurais. O VSD ideal terá cinética aumentada e sensibilidade, enquanto exibe menor carga capacitiva, fotobleaching e citotoxicidade. O recém-sintetizado VF2.1Cl (FluoVolt) expressa muitas dessas propriedades benéficas em grande parte devido à sua nova estrutura molecular baseada em fios, compartilhada por outros membros da nova família VoltageFluor (VF)7. Em contraste com vsds eletrocrômicos comuns em que sondas simples molecular e eletricamente conjugam à membrana plasmática, este corante consiste em um fio sintético passivamente inserido, de abrangência de membrana, que emparelha um doador rico em elétrons com um fluoróforo de fluoresceína modificada (FITC). Detalhes mecanicistas são fornecidos na Figura 1. Este corante demonstra excelente sensibilidade às flutuações de tensão da membrana, exibindo uma mudança de 27% na intensidade de emissão por 100 mV em oposição a ~10% visto em outras sondas comuns a velocidadescomparáveis 7. Além disso, os sistemas PeT baseados em fios não interagem diretamente com o campo elétrico celular que produz interferência elétrica mínima e mudanças insignificantes na carga capacitiva celular.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Figura 1: Parâmetros químicos, espectrais e mecanicistas de corante VF2.1Cl. (A) Estrutura química de VF2.1Cl. Características moleculares a notar incluem múltiplos grupos de alquila dentro do fio molecular de fenileno vinylene que facilitam a inserção na membrana plasmática. Um grupo de ácido sulfônico carregado negativamente conjugado à sonda FITC garante estabilização de fluoróforo na superfície extracelular e auxilia perto da inserção perpendicular em relação ao campo elétrico da bicamada lipídica. (B) Um esquema simplificado de VF2.1Cl perpendicular incorporando na membrana plasmática de uma célula alvo. (C) Espectro de absorção e emissão de corante VF2.1Cl. O espectro é idêntico ao dos testes FITC e GFP padrão. (D) Representação do modo mecanicista de ação de VF2.1Cl. Em condições de repouso (hiperpolarizadas), tensões intracelulares negativas conduzem elétrons livres em direção ao fluoróforo rostral. A abundância de elétrons garante que a transferência de elétrons induzidos por foto (PeT) seja favorecida como um caminho para fora do estado animado após a excitação óptica, efetivamente saciando a fluorescência. Em contraste, um potencial de membrana despolarizada influencia o movimento de elétrons descendentes favorecendo a fluorescência após a excitação óptica. A resposta fluorescente resultante está linearmente relacionada à tensão da membrana e pode ser precisamente utilizada para coletar informações temporais detalhadas sobre cinética eletrofisiológica celular. (E) Representativo brightfield (superior) e fluorescência a 470 nm (inferior) imagens de cardiomiócitos leporina carregados com VF2.1Cl. (F) Z pilha de um único cardiomiócito carregado. As setas indicam áreas de localização clara de VF2.1Cl para a membrana celular. As imagens foram adquiridas com um sistema confocal de disco giratório consistindo de uma cabeça confocal de disco giratório X-lightv3 com um padrão de pinhole de 50 μm; Iluminador LDI-7; Câmera Prime95B e um objetivo PlanApo Lambda 100x. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A sonda FITC conjugada ao VF2.1Cl garante que ele pode ser usado efetivamente sob configurações padrão e filtro GFP, e requer apenas um único sistema de aquisição de canais, ambos características comuns de plataformas de imagem fluorescentes. A análise de monocamadas humanas densas com este corante foi recentemente relatada8,9,10,11. Nosso protocolo difere desses estudos devido à nossa investigação de iPSC-CMs únicos e isolados, imperturbáveis pelas influências elétricas e paracrinas de monocamadas sincicial densas, e pelo uso de um sistema de fotometria acessível e personalizável em oposição a complexos arranjos de imagem confocal ou de campo amplo.
Aqui, descrevemos nosso protocolo para a rápida aquisição e análise de APs ópticos robustos de cardiomiócitos isolados derivados do iPSC e cardiomiócitos nativos (ver Arquivo Suplementar). Usamos VF2.1Cl juntamente com uma plataforma de última geração personalizável para medições de fotometria de célula única. Esses protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética do Centro Médico Universitário Göttingen (nº 10/9/15).

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose anidra&nbsp; BioChemica</td><td>ITW Reagents</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Potencial de Membrana FluoVolt&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inibidor Y27632</td><td>Stemolecule</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dichroic Beamsplitter&nbsp;</td>Amplificador Axopatch 200B <td>da Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas circulares, espessura 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação Dual OptoLED&nbsp;</td><td>Pesquisa de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Excitação ET470/40x&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gravado Neubauer Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter Cubes&nbsp;</td><td>Pesquisa de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido IX73</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pesquisa MonoLED</td><td>Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores Multiportas&nbsp;</td><td>Pesquisa de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de Células Myopacer</td><td>Obturador IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask&nbsp;</td><td>Pesquisa de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador de Sistema Optoscan</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de Temperatura Controlada PH-1 &nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector Fotomultiplicador&nbsp;</td><td>Pesquisa de Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserção de Amplificador PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserção de Fornecimento PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Banho Aberta RC-26G&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Palco SA-OLY/2AL&nbsp;</td><td>Olympus&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Dichroic Beamsplitter&nbsp;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660lpxr Dichroic Beamsplitter</td> Controlador de Temperatura de Canal <td>Duplo Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20&nbsp;</td><td>Objetiva Eletrônica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NPI UPLFLN 40X Olympus</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera colorida USB 3.0</td><td>Fonte</td><td></td><td></td> de Imagem</tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Captura de IC 2.4&nbsp;</td><td>Fonte de imagem&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloco de gráficos</td><td></td><td></td> <td>Prism 8</td></tr></tbody></table>

medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

As técnicas convencionais de microeletrodos intraecelulares para quantificar a eletrofisiologia cardiomiocócica são extremamente complexas, intensivas em mão-de-obra e tipicamente realizadas em baixo rendimento. A rápida e contínua expansão da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) apresenta um novo padrão em pesquisa cardiovascular e métodos alternativos são agora necessários para aumentar o throughput de dados eletrofisiológicos em um único nível celular. VF2.1Cl é um corante sensível à tensão recentemente derivado que fornece uma resposta rápida de canal único e de alta magnitude às flutuações no potencial da membrana. Possui cinética superior às de outros indicadores de tensão existentes e disponibiliza dados funcionais equivalentes aos das técnicas tradicionais de microeletrodo. Aqui, demonstramos uma caracterização potencial de ação simplificada e não invasiva em cardiomiócitos derivados do iPSC humanos com ritmo externo usando um sistema de fotometria modular e altamente acessível.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Figura 3: Perfis de potencial de ação óptica (AP) de cardiomiócitos nativos isolados e cardiomiócitos pluripotentes induzidos por humanos derivados de células-tronco (iPSC-CM). (A) Ap óptico representativo de um único cardiomiócito murino (centro) com média ± SEM de APD50 e APD90 (n = 7, à direita). (B) Ap óptico representativo de um...

Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Este protocolo pode fornecer medições de alto rendimento de eletrofisiologia celular de uma maneira que convém à tecnologia em rápido desenvolvimento de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos complexa e menos trabalhosa do que a técnica tradicional de patch clamp, mas é capaz de produzir resultados equivalentes. Portanto, este protocolo pode ser expandido para programas de triagem de toxicidade em larga escala usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos.Por exemplo, o abrangente ensaio de pró-arritmia in vitro. Para preparar culturas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para o experimento, primeiro reveste lamínulas de vidro redondas individuais de 10 milímetros com 150 microlitros de matriz de membrana basal 1:60 dentro de cada poço de uma placa de 24 poços e incube as lamínulas a quatro graus Celsius por quatro horas. No final da incubação, remova o excesso de matriz das lamínulas e aplique o volume apropriado de células em cada lamínula.Após uma hora a 37 graus Celsius, encha cuidadosamente cada poço com meio de revestimento e retorne a placa à incubadora. Para se preparar para imagens de corante sensíveis à tensão, equipe um microscópio de epifluorescência invertida com uma lente de alta abertura numérica com ampliação de 40x e acople um LED branco quente de comutação rápida à porta de iluminação transmitida. Insira um filtro vermelho simples de 660 nanômetros no caminho da luz transmitida e monte uma cabeça de LED de 470 nanômetros de comutação rápida para gravação de fotometria.Insira um filtro de excitação 470/40 na porta de epifluorescência para limpar a luz gerada pelo LED e insira um cubo de microscópio contendo um divisor de feixe de passagem de 495 nanômetros de comprimento no carrossel da unidade de espelho dentro do microscópio. Encaixe um braço de detecção contendo um diafragma de campo ajustável na porta de montagem C para permitir a seleção da região de interesse e acople um detector PMT e uma câmera USB ao microscópio. Insira um cubo de filtro contendo um divisor de feixe de passagem de 565 nanômetros e um filtro de emissão 535/50 na porta PMT para dividir a luz de emissão entre os dois detectores.Acople o PMT a uma fonte de alimentação e a um amplificador PMT e conecte o PMT ampsaída do amplificador a um pino de entrada analógica de um sistema de aquisição de dados. Para atender aos critérios de Nyquist e evitar aliasing, filtre os dados analógicos do PMT em um kilohertz ou mais e digitalize os dados em uma frequência que seja pelo menos o dobro da frequência mais alta presente no sinal analógico. Para carregar as células com corante sensível à tensão, misture cinco microlitros de 1000x FluoVolt e 50 microlitros de solução de carga de energia e adicione três microlitros da solução de carga resultante a três mililitros de solução de Tyrode aquecida em uma placa de Petri.Adicione uma única lamínula revestida de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas ao prato e coloque-o a 37 graus Celsius por 20 minutos. Monte uma câmara de imagem de células vivas aquecida no estágio do microscópio e encha a câmara com 500 microlitros de solução fresca de Tyrode. Em seguida, lave a lamínula com solução fresca de Tyrode a 37 graus Celsius e use uma pinça de ponta fina para transferir cuidadosamente a lamínula para a câmara de banho pré-aquecida.Para padronizar a dinâmica celular e os parâmetros experimentais, insira dois eletrodos de platina na câmara, espaçados cinco milímetros, e conecte os eletrodos a um estimulador externo. Defina o estimulador para pulsos de campo bipolar de cinco milissegundos a 0,5 hertz e aumente o estímulo de um volt até que as células comecem a se contrair. Em seguida, defina a tensão para aproximadamente 25% acima desse limite.Para aquisição do potencial de ação óptica, use o caminho da luz transmitida e a câmera USB para visualizar os miócitos em condições de campo claro. Selecione uma célula isolada e use o diafragma de campo para cortar firmemente seu caminho óptico, garantindo que apenas a luz da célula de interesse seja monitorada. Ative o PMT amplifier, e defina a alimentação PMT para 750 volts.Execute o protocolo de estimulação junto com o software de aquisição enquanto ativa simultaneamente a luz de excitação de 470 nanômetros. Registre 10 varreduras, garantindo que potenciais de ação estáveis sejam detectados. Após a última varredura, mova imediatamente o estágio do microscópio enquanto ainda grava para adquirir brevemente o sinal de fundo de uma região desprovida de células e desligar a luz de excitação.Para analisar os dados do potencial de ação, abra uma gravação salva no software de análise apropriado e calcule a média de 10 varreduras contendo potenciais de ação estimulados de uma única célula. Subtraia a média do sinal de linha de base que representa o deslocamento de fluorescência do traço médio e, em seguida, use a fórmula para calcular a mudança na fluorescência usando a fluorescência diastólica como F0. Identifique as áreas de interesse diastólica e de potencial de ação e meça os parâmetros desejados do potencial de ação cardíaca, incluindo, mas não se limitando a, a duração da repolarização de 50% e 90%. Em seguida, exporte os dados dessa única célula para um programa de planilha.Este método permite a quantificação rápida e precisa da mecânica de repolarização, que pode fornecer informações valiosas sobre anormalidades iônicas celulares. Características pronunciadas de fase um podem ser observadas em sinais ópticos de cardiomiócitos murinos, que são morfologicamente distintos daqueles de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Além disso, os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos respondem à manipulação farmacológica com nifedipina, um conhecido antagonista dos canais de cálcio do tipo L.Durante a aplicação contínua de medicamentos, foi observada uma redução de 41,5% na duração do potencial de ação com 90% de repolarização, sugerindo a funcionalidade da imagem baseada em indicadores de tensão fluorescente como uma plataforma para estudos prospectivos de triagem de medicamentos cardíacos de alto rendimento. É importante ter em mente que, embora o corante sensível à voltagem usado neste estudo seja menos citotóxico do que outros, a luz de excitação ainda deve ser usada com moderação para conservar a viabilidade celular. O equipamento de fotometria modulatória usado neste protocolo é incrivelmente versátil.Por exemplo, pode ser usado para medições simultâneas de outros parâmetros eletrofisiológicos, como cálcio intracelular.

single-cell-optical-action-potential-measurement-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

Aqui, demonstramos um método de avaliação da contratilidade de dispositivos médicos cardíacos não invasivos usando monocamadas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D (hiPSC-CM), banhadas em um substrato flexível, juntamente com microscopia baseada em vídeo. Esta ferramenta será útil para a avaliação in vitro das propriedades contráteis de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.

Avaliação da Terapia de Modulação da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Humanas 2D

Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

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Aprenda a medir potenciais de ação ópticos em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando fotometria modular de alta velocidade. Este método simplificado permite triagens de toxicidade em larga escala.

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