Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

Dit protocol biedt experimentele instellingen om controleerbare 2D- en 3D-coculturen uit te voeren in micro-apparaten om tumor-immuuncelkruisingen te visualiseren en te monitoren en de effecten van antikankerbehandelingen te analyseren. Deze technologie biedt real-time en eenvoudige visualisatie van immuuncelrekrutering en interacties en kan worden gebruikt voor menselijke en patiënt-afgeleide monsters. Het is compatibel met de meeste state-of-the-art microscopieën.

Francesco Noto, promovendus bij de afdeling Oncologie en Moleculaire Geneeskunde, Istituto Superiore di Sanita, en Nicoleta Manduca en Esther Maccafeo, promovendi aan de Universita Cattolica del Sacro Cuore, afdeling Translationele Geneeskunde en Chirurgie, zullen de procedure demonstreren. Chips worden eerder plasma-geactiveerd in een plasmareiniger of reactieve ijzeretsmachine in cleanroom. Murine-miltcellen en een tumorcellijn worden hier gebruikt voor het nabootsen van de in de tekst beschreven protocollen.

Voordat u celsuspensies laadt, trekt u media uit alle zes reservoirs op. Laad vervolgens langzaam 1 x 10 tot de 5e tumorcellen geresuspendeerd in 10 tot 50 microliter groeimedium in het reservoir linksboven en in de onderste put. Aan de rechterkant, pipetteer voorzichtig 1 x 10 tot de 6e drijvende immuuncellen geresuspendeerd in 50 microliter groeimedium in twee putjes.

Wanneer alle cellen zijn toegevoegd, vult u alle zes reservoirs van elke chip met maximaal 100 tot 150 microliter groeimedium en controleert u of de cellen correct zijn verdeeld binnen elk kweekcompartiment. Incubeer de chip gedurende een uur om het systeem te laten stabiliseren vóór de time-lapse-opname. Voor live cell imaging monteer je het tumorimmuunsysteem op de chipplaat in het microscoopstadium.

Pas de instelling van de acquisitieworkflow aan in de microscoopsoftware-interface, zoals Incucyte Live-Cell Analysis Software. Selecteer waarnemingsvensters, de optimale framesnelheid en tijdsduur, afhankelijk van de juiste parameters voor het experiment en de celtypen die worden bestudeerd. Maak een afbeelding van de cellen voor de juiste experimentele periode.

Bereid twee aliquots matrigel verdund met medium dat een medicijn of een combinatie van geneesmiddelen bevat voor de twee experimentele omstandigheden met behulp van koude tips. Pietteer voorzichtig live-compatibele, fluorescerende kleurstof-gekleurde tumorcellen gesuspendeerd in matrixoplossing op ijs om een homogene verdeling van de cellen te verkrijgen. Met de chipplaat op een koelblok of op een mand met ijs, injecteert u langzaam de met geneesmiddelen behandelde tumorcelmatrixoplossing in de linker- en rechtergelpoorten met behulp van koude micropipettepunten van 10 microliter.

Oefen zachte druk uit om de matrixoplossing van de ene kant van het kanaal naar de andere kant te duwen. Wanneer alle tumorcellen zijn geladen, plaatst u het apparaat gedurende 30 minuten in de couveuse in de rechtopstaande positie. Aan het einde van de incubatie, zodra de matrix gelation is voltooid, vult u de mediumkanalen van alle zes reservoirs met 50 microliter kweekmedium.

Controleer de gepolymeriseerde gelintegriteit en tumorcelverdeling onder een microscoop. Plaats de chips vervolgens in een couveuse totdat de voorbereiding van de immuuncel is voltooid. Na incubatie, zuig het medium uit elke put.

Plaats de punt in de buurt van de inlaat van het middelste mediumkanaal en gebruik matige druk om voorzichtig 10 microliter van 10 tot de 6e immuuncellen te injecteren, gelabeld met een contrasterende fluorescerende kleurstof. Injecteer 50 tot 100 microliter van het medium in elk van de vier putten van laterale kanalen, 40 tot 90 microliter van het medium in de bovenste centrale put en 50 tot 100 microliter van het medium in de onderste centrale put. Wanneer alle putten zijn geladen, gebruikt u een microscoop om te bevestigen dat de verdeling van de immuuncellen beperkt is gebleven tot de centrale kamer.

Plaats het apparaat vervolgens voorzichtig op een vlak oppervlak in de celkweekincubator totdat het beeld wordt weergegeven. Om de omvang te berekenen van de fluorescerend gekleurde levende immuuncellen die de tumorcompartimenten infiltreren, brengt u het apparaat in beeld op specifieke aandachtspunten door fluorescentiemicroscopie en stelt u de juiste cameraparameters in de microscoopbeeldsoftware in, zoals Nikon NIS-Elements. Stel ook de parameters in voor gelabelde immuuncellen.

De beweging van leukocyten door goed gebouwde microkanaalbruggen in het microfluïdische platform naar hun doelcellen kan worden gevolgd door videomicroscopie. In deze trackinganalyse werden individuele PBMC's uitgedaagd met stervende met doxorubicine behandelde of levende met PBS behandelde kankercellen. Relevante chemotaxiswaarden en migratieplots werden automatisch gegenereerd en een ander migratieprofiel voor de immuuncellen werd waargenomen wanneer ze samen werden geladen met borstkankercellen die waren blootgesteld aan doxorubicine of PBS.

Toen de PBMC's werden geconfronteerd met apoptotische kankercellen, kruisten ze microkanalen naar de stervende en dode cellen, maar staken ze niet over naar levende, onbehandelde cellen. Een fractie van de leukocyten met een toenemende dichtheid gedurende 24 tot 48 uur vertoonde langdurige contacten met met doxo behandelde kankercellen. In deze analyse werd een nieuw 3D-immunocompetent tumormodel gebruikt om de rekrutering van immuuncellen te kwantificeren als reactie op anti-kankercombinaties van epigenetische geneesmiddelen.

Rood-kleurstof-gelabelde PBMC's werden vervolgens homogeen verdeeld in de centrale vloeistofkamer. Het vermogen van de twee tumormassa's om de PBMC's aan te trekken werd vervolgens vergeleken, waarbij de PBMC's in dit experiment robuust werden gerekruteerd in het rechtermicrokanaal. Meng voor het 3D-model de oplossing met hydrogel en cellen op ijs, vermijd bellen en prepolymerisatie.

Injecteer het langzaam zonder overmatige druk. Stem de polymerisatiestappen af op de gebruikte matrix. Levende/dode celtesten en cytokinesecretieprofilering van supernatanten kunnen worden geïmplementeerd.

Immunofluorescentie voor confocale beeldvorming kan worden uitgevoerd om immuunsubtypen te classificeren en voor expressiemarkers van activering en uitputtingsrijping.