分离与原代小鼠胚胎腭间充质细胞的延时成像以分析集体运动特性

本方案使颅面研究领域的研究人员能够定量比较对照组与突变组细胞的集体运动特征，从而理解腭突融合过程中间充质的重塑机制。利用原代小鼠胚胎腭间充质细胞并结合延时成像技术，为评估腭突融合动力学提供了一种便捷的替代方法。为获取小鼠胚胎的腭突组织，应在体视显微镜下使用无菌打孔匙将胚胎第13.5天的小鼠胚胎转移至盛有无菌MEPM培养基的无菌10厘米培养皿中。

断头后，将一把灭菌的5号精细镊子的一侧镊尖插入颊部内侧的口腔中，并推进镊子尖端，直至其从颅骨后部穿出。调整镊子方向，使另一侧镊臂恰好位于耳道上方，然后闭合镊子以剪切组织。在头部另一侧重复此切口操作，持续进行夹捏式剪切，直至下颌、舌头及颅骨下部被完全移除，暴露出腭板结构。

将头部侧放，将一对小型无菌不锈钢剪刀的尖端置于胚胎头颅的眼部水平位置的前后两侧，在眼睛上方稍高处剪开，以去除颅骨的顶部，形成一个平坦的表面。接着，将头部倒置，使颅骨上表面平贴于培养皿底部，找到腭突，它们应表现为头部前半部分中央沟两侧可见的两个隆起的桥状结构。为固定头部，用精细镊子的一侧尖端穿过腭突前方鼻部区域附近的组织，另一侧尖端穿过腭突后方颅底部位。

用第二把非常锋利、精细的镊子的两个尖端插入腭板侧面基部的组织中，缓慢而小心地夹紧以切断组织。沿腭板内侧面的基部以及腭板的前、后两端重复进行切割，以将腭板从头部附着处分离，然后轻轻提起腭板，必要时进行额外的夹切，以完全将其从周围组织中游离出来。用同样方法取下第二块腭板后，使用无菌塑料胶头移液器将腭板转移至预冷的含约500 µL PBS的无菌1.5 mL微量离心管中，置于冰上。

建立MEPM细胞培养时，当所有腭架组织均已收集完毕，吸除PBS，注意不要扰动组织，立即向每管腭架组织中加入200微升37摄氏度的0.25%胰蛋白酶。使用1,000微升移液器将组织短暂吹打数次，于37摄氏度孵育10分钟，在5分钟时再次短暂吹打。孵育结束后，在向每管中加入800微升MEPM培养基之前，再次吹打组织，随后离心各管以收集细胞。

吸去上清液后，每管中加入一毫升新鲜的MEPM培养基重悬细胞沉淀，并将细胞接种至六孔组织培养板的各个孔中，每孔预先加入两毫升培养基，使每孔终体积为三毫升，然后将细胞置于无菌细胞培养箱中孵育12小时，使其贴附于塑料表面。为建立二维群体迁移实验，取无菌的双孔硅胶插件，用无菌镊子将每个待分析样品的插件顶部剪至约一毫米高度，然后用无菌镊子将截短后的无菌双孔插件放置于六孔板各孔的中央。沿插件所有边缘轻轻按压，确保插件完全贴合孔底，随后在每个插件的截短区域以每平方毫米接种300个MEPM细胞，每插件加入40至50微升MEPM培养基，总体积不超过50 µL，在细胞培养箱中过夜培养。

进行伤口修复实验时，使用无菌镊子将一个未经修饰的无菌双孔硅胶插件置于六孔板中每个样品孔的中央，并用力按压插件边缘，使其牢固附着于培养板上。随后，在每个插件中加入100微升MEPM培养基，接种密度为每平方毫米1,400个细胞，并在细胞培养条件下孵育48小时。进行二维集体迁移实验时，在大培养皿中使用双孔硅胶插件接种细胞，通常可获得更适宜成像的细胞密度。

将小型3D打印环置于35毫米培养皿中，也可用于二维细胞迁移分析。对于伤口修复实验，细胞在双孔硅胶插件中培养至高度融合状态。随后移除插件，并对伤口区域进行成像，直至伤口闭合。

MEPM细胞的运动轨迹具有持续性，细胞迁移方向可维持数小时。平均位移与时间关系分析表明，位移的持续性与经过的时间成正比。对运动数据的流动分析显示，随动的MEPM细胞簇大小约为300微米。

在野生型和突变型MEPM细胞之间也观察到显著的运动能力差异。该方法可应用于多种转基因小鼠品系，并可用于以各种生化试剂处理MEPM细胞，以研究这些试剂对细胞运动的影响。我们主要关注原代腭间充质细胞，但延时成像与定量分析也可用于探究任何运动性细胞类型在动态发育过程中的迁移特性。