Name: Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Apprenez la purification et l'expansion des cellules T iNKT de souris pour des études in vitro et in vivo. Cette méthode permet une expansion 30 fois supérieure en deux semaines, facilitant la recherche en immunologie.

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Nous remercions Paolo Dellabona et Giulia Casorati pour leur soutien scientifique et leur lecture critique du manuscrit. Nous remercions également le NIH Tetramer Core Facility pour le tétramère CD1d de souris. L’étude a été financée par la Bourse De la Fondazione Cariplo 2018-0366 (à M.F.) et la bourse de l’Association italienne pour la recherche sur le cancer (AIRC) 2019-22604 (à G.D.).

Les procédures décrites ici ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) (n° 1048) de l’Institut scientifique de San Raffaele.
REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Tous les réactifs utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
1. Traitement de la rate
<ol><li>Euthanasier les souris iVα14-Jα18 par inhalation de CO2 selon la politique institutionnelle. REMARQUE: Les souris iVα14-Jα18 doivent être âgées de 8 semaines ou plus. Pour éviter le rejet des cellules du transfert in vivo des cellules, considérez que les cellules isolées de souris femelles peuvent être transférées de manière adoptive à la fois chez des receveurs mâles et femelles, tandis que les cellules isolées de souris mâles ne peuvent être transférées que chez des receveurs mâles. Pour les expériences in vitro, aucun préjugé sexiste ne doit être pris en compte. Plus de souris peuvent être regroupées afin d’obtenir plus de cellules.</li>
	<li>Disséquez la rate de la souris et écrasez-la à travers une passoire cellulaire de 70 nm pour obtenir une suspension unicellulaire dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 2% de sérum bovin fœtal (FBS).</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant par inversion et traiter avec un tampon de lyse érythrocytaire. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lysage stérile ACK (ammonium-chlorure-potassium), incuber pendant 3 min à température ambiante et bloquer avec 5 mL de PBS avec 2% de FBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. REMARQUE: ACK est disponible dans le commerce; il se compose d’une solution de 0,15 MNH4Cl, 10 mM deKHCO3et 0,1 mMna2EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) dissous dans duH2Obidistillé, pH 7,2-7,4. S’il est fait maison, stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm.</li>
	<li>Retirez le surnageant par inversion. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de PBS avec 2% de FBS et éliminer les résidus de graisse par pipetage. Si nécessaire, mettez en commun les cellules provenant de différentes souris.</li>
	<li>Comptez les cellules et conservez 50 μL pour l’analyse FACS.</li>
</ol>2. Enrichissement des lymphocytes T
REMARQUE: Pour les étapes d’enrichissement, travaillez rapidement, gardez les cellules froides et utilisez des solutions pré-refroidies à 4 ° C pendant la nuit, puis conservées sur de la glace
<ol><li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Remettre en suspension toutes les cellules dans la quantité appropriée de PBS avec 2% FBS (500 μL pour 107 cellules) et un bloqueur Fc (2,5 μL x 107 cellules); incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Laver avec 1-2 mL de tampon de séparation MACS (MB) par 107 cellules totales et centrifuger à 300 x g pendant 10 min. REMARQUE: Le tampon MACS est disponible dans le commerce. Il se compose de PBS pH 7,2, 0,5% d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA. S’il est fait maison, stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm.</li>
	<li>Retirer le surnageant par inversion et colorer les cellules avecCD19-FITC et H2(IA b)-FITC (utiliser 5 μL x 107 cellules dans 100 μL de MB). Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Pipette complètement le surnageant et remise en suspension de la pastille de cellule dans 90 μL de MB pour 107 cellules au total. Ajouter 10 μL de microbilles anti-FITC pour 107 cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.</li>
	<li>Lavez les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifugez à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Pipette complètement le surnageant et remise en suspension jusqu’à 1,25 x 108 cellules dans 500 μL de MB.</li>
	<li>Placez une colonne LD dans le champ magnétique du séparateur MACS pour procéder à l’épuisement. Pour éviter le colmatage, appliquez un filtre de pré-séparation sur la colonne LD et rincez avec 2 mL de MB.</li>
	<li>Lorsque le réservoir de colonne est vide, appliquez la suspension cellulaire sur le filtre. Collectez les cellules non étiquetées qui traversent la colonne.</li>
	<li>Laver 3 fois avec 1 mL de Mb, uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide. Recueillir l’effluent total, qui sera enrichi en lymphocytes T, et compter les cellules. Gardez toujours 50 μL pour l’analyse FACS.</li>
</ol>3. Enrichissement des cellules iNKT
<ol><li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant par inversion.</li>
	<li>Colorez les cellules avec CD1d-tétramère-PE (souris PBS57-CD1d-tétramère), selon le titrage des anticorps dans 50 μL de MB pour 106 cellules. Bien mélanger et incuber pendant 30 min dans l’obscurité sur de la glace. REMARQUE: La procédure peut également être effectuée avec des tétramères mCD1d marqués APC et des billes anti-APC; ajuster les fluorochromes utilisés dans la coloration suivante en conséquence. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé des tétramères PBS-57-CD1d de souris fournis par les NIH. L’αgalactosylcéramide (αGal-Cer) est l’antigène prototypique reconnu par les cellules iNKT ; PBS-57 est un analogue de l’αGal-Cer avec une solubilité améliorée9; l’installation de tétramères des NIH fournit un ligand PBS-57 complexé à des tétramères CD1d. Cependant, d’autres dimères/tétramères/dextramères CD1d sont disponibles dans le commerce et peuvent être chargés d’un antigène lipidique comme αGal-Cer. Nous envisageons la possibilité d’ajuster le protocole pour leur utilisation.</li>
	<li>Lavez les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifugez à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Pipette complètement le surnageant et remise en suspension de la pastille de cellule dans 80 μL de MB pour 107 cellules au total. Ajouter 20 μL de microbilles anti-PE pour 107 cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Pipette complètement le surnageant et remise en suspension jusqu’à 108 cellules dans 500 μL de MB. Sinon, si les cellules dépassent 108, ajustez le volume en conséquence.</li>
	<li>Selon le nombre de cellules, placez une colonne LS (jusqu’à 108)ou MS (jusqu’à10 7)dans le champ magnétique du séparateur MACS. Rincer la colonne avec MB (3 mL pour LS, 500 μL pour MS).</li>
	<li>Appliquez la suspension de cellule sur la colonne.</li>
	<li>Collectez les cellules non marquées qui passent à travers. Lavez la colonne 3 fois en ajoutant la quantité appropriée de Mo (3 x 3 mL pour la colonne LS, 3 x 500 μL pour la colonne MS) uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide. L’effluent total est la fraction négative.</li>
	<li>Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la sur un nouveau tube collecteur.</li>
	<li>Pipette MB sur la colonne (5 mL pour la colonne LS ou 1 mL pour la colonne MS); poussez le piston fourni dans la colonne et débusquez la fraction positive (enrichie en cellules iNKT).</li>
	<li>Pour augmenter encore la récupération de la cellule iNKT, centrifugez la fraction négative à 300 x g pendant 10 minutes et répétez les étapes 3.6-3.7 avec une nouvelle colonne LS ou MS. Regroupez les fractions positives et déterminez le nombre de cellules. Conservez 50 μL de fractions positives et négatives pour l’analyse FACS.</li>
	<li>Vérifiez les étapes de purification par analyse FACS. Les échantillons comprennent: la rate ex vivo, la fraction enrichie en lymphocytes T, la fraction positive iNKT et la fraction négative iNKT. Colorez les cellules avec : CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC et DAPI. REMARQUE: La récupération attendue d’une souris iVα14-Jα18 est de 2x106 cellules iNKT .</li>
</ol>4. Activation et expansion des cellules iNKT
<ol><li>Activez les cellules iNKT purifiées avec des billes magnétiques anti-CD3/CD28 de l’activateur T de souris dans un rapport de 1:1.<ol>
<li>Centrifuger la fraction positive de la cellule iNKT à 300 x g pendant 5 min.</li>
		<li>Pendant ce temps, transférez le volume approprié de billes magnétiques anti-CD3 / CD28 dans un tube et ajoutez un volume égal de PBS, vortex pendant 5 secondes. Placez le tube sur un aimant pendant 1 minute et jetez le surnageant.</li>
		<li>Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans le volume approprié de RPMI complet (milieu RPMI 1640, FCS inactivé à la chaleur à 10%, pyruvate de sodium 1 mM, 1% d’acides aminés non essentiels, 10 U / ml de pénicylline et de streptomycine, 50 μM β-mercaptoéthanol) pour avoir 5 x 105 cellules iNKT dans 1 mL. Utilisez cette suspension pour remettre en suspension la fraction positive iNKT centrifuge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaque 1 mL de la suspension cellulaire (5 x 105 cellules iNKT) et perles magnétiques anti-CD3/CD28 dans une plaque de 48 puits avec 20 U/mL IL-2 et incuber à 37 °C.</li>
	<li>Après 5 jours, ajouter 10 ng/mL IL-7.</li>
	<li>Divisez les cellules 1:2 lorsqu’elles atteignent 80-90% de confluence, ajoutez toujours 20U/mL IL-2 et 10 ng/mL IL-7. Dans ces conditions, les cellules iNKT peuvent être étendues jusqu’à 15 jours.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
<li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li>
<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
<li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li>
<li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous montrons ici un protocole reproductible et réalisable pour obtenir des millions de cellules iNKT prêtes à l’emploi. En raison de la rareté de ces cellules in vivo, une méthode pour les étendre était fortement nécessaire. Le protocole que nous proposons ne nécessite ni une instrumentation particulière ni un nombre élevé de souris. Nous avons exploité des souris transgéniques iVα14-Jα18 à dessein pour réduire le nombre de souris nécessaires à la procédure.
Un autre protocole réussi pour l’e...

Les lymphocytes T tueurs naturels invariants (cellules iNKT) sont des lymphocytes T innés qui expriment un récepteur semi-invariant des lymphocytes T αβ (TCR), formé chez la souris par une chaîne Vα14-Jα18 invariante associée à un ensemble limité de chaînes Vβ diverses1, ce qui est spécifique aux antigènes lipidiques présentés par la molécule CD1d2liée au CMH de classe I. Les cellules iNKT subissent un programme de sélection des agonistes entraînant l’acquisition d’un phénotype effecteur activé/inné déjà dans le thymus, qui se produit à travers plusieurs étapes de maturation3,4, produisant un sous-ensemble CD4+ et un CD4- . Grâce à ce programme, les cellules iNKT acquièrent des phénotypes effecteurs T auxiliaires (TH)distincts, à savoir TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) et TH17 (iNKT17), identifiables par l’expression des facteurs de transcription T-bet, GATA3, PLZF et RORγt, respectivement5. Les cellules iNKT reconnaissent une gamme de lipides microbiens mais sont également auto-réactives contre les lipides endogènes qui sont régulés à la hausse dans le contexte de situations pathologiques de stress cellulaire et de lésions tissulaires, telles que le cancer et l’auto-immunité2. Lors de l’activation, les cellules iNKT modulent les fonctions d’autres cellules effectrices immunitaires innées et adaptatives par contact direct et production de cytokines2.
Les recherches sur les cellules iNKT ont été facilitées par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou en Jα18, et par la production de tétramères CD1d chargés d’antigènes ainsi que par la génération d’anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques au TCR semi-invariant humain. Cependant, la génération de la lignée cellulaire iNKT de souris primaire s’est avérée difficile. Pour mieux caractériser les fonctions antitumorales des cellules iNKT et les utiliser pour la thérapie cellulaire adoptive, nous avons mis en place un protocole pour purifier et étendre les cellules iNKT spléniques de souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, dans lequel les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes que chez les souris de type sauvage.
Les cellules iNKT expansées peuvent être exploitées pour des essais in vitro et in vivo lors du transfert chez la souris. Dans ce contexte, par exemple, nous avons montré leurs puissants effets anti-tumoraux7. De plus, les cellules iNKT étendues in vitro se prêtent à une modification fonctionnelle via le transfert ou l’édition de gènes avant leur injection in vivo8,ce qui permet une analyse fonctionnelle perspicace des voies moléculaires et ouvre la voie à des thérapies cellulaires avancées.

<table><tbody><tr><td>Solution d’ammonium-chlorure-potassium (ACK)</td><td>en maison</td><td></td><td>0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Microbilles anti-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>clone 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetramère -PE</td><td>NIH tétramère core facility</td><td></td><td>souris PBS57-Cd1d-tétramères</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>100528</td><td>clone RM4-5</td></tr><tr><td>Fc blocker</td><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td><td>inactivé thermiquement et filtré .22 avant utilisation</td></tr><tr><td>FOXP3 Tampon de coloration du facteur de transcription</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>clone AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampon MACS (MB)</td><td></td><td></td><td>0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA ; Sigma-Aldrich) et 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Tamponné au phosphate salin (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Filtres de pré-séparation (30 &micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Souris Recombinat IL-7</td><td>R& D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta ; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>clone H57-597</td></tr><tr><td>&alpha ; CD3CD28 activateur T de souris Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

purification et expansion de cellules t tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T de type inné exprimant un récepteur de lymphocytes T semi-invariants (TCR) conservé spécifique aux antigènes lipidiques auto-microbiens ou microbiens présentés par la molécule non polymorphe CD1d liée au CMH de classe I. Des études précliniques et cliniques soutiennent un rôle pour les cellules iNKT dans le cancer, l’auto-immunité et les maladies infectieuses. Les cellules iNKT sont très conservées dans toutes les espèces et leur étude a été facilitée par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou déficientes en iNKT, et la possibilité de les détecter sans équivoque chez les souris et les hommes atteints de tétramères CD1d ou de mAbs spécifiques du TCR semi-invariant. Cependant, les cellules iNKT sont rares et elles doivent être étendues pour atteindre des nombres gérables pour toute étude. Parce que la génération de lignée cellulaire iNKT primaire de souris in vitro s’est avérée difficile, nous avons mis en place un protocole robuste pour purifier et développer les cellules iNKT spléniques des souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg), dans lesquelles les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes. Nous montrons ici que les cellules iNKT spléniques primaires iVα14Tg peuvent être enrichies par un processus de séparation immunomagnétique, produisant environ 95 à 98% de cellules iNKT pures. Les cellules iNKT purifiées sont stimulées par des billes anti-CD3/CD28 plus IL-2 et IL-7, ce qui entraîne une expansion de 30 fois par jour +14 de la culture avec une pureté de 85-99%. Les cellules iNKT élargies peuvent être facilement manipulées génétiquement, fournissant un outil inestimable pour disséquer les mécanismes d’activation et de fonctionnement in vitro et, plus important encore, également lors du transfert adoptif in vivo.

Le protocole décrit dans ce manuscrit permet d’enrichir les cellules iNKT de la rate de souris transgéniques iVa14-Ja18 grâce à un processus de séparation immunomagnétique résumé à la figure 1A. Les lymphocytes T de la rate totale sont d’abord sélectionnés négativement en épuisant les cellules B et les monocytes, suivis par le tri immunomagnétique positif des cellules iNKT avec des tétramères CD1d chargés d’antigène lipidique PBS-57, qui permettent de colorer spécifiquement uniquement les ce...

Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.

Purification et expansion de cellules T tueuses naturelles invariantes de souris pour des études in vitro et in vivo

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Ce protocole permet la purification des lymphocytes T INK, qui sont très rares, et permet une multiplication par 30 de leur nombre. La purification peut être réalisée en une journée et produire un grand nombre de lymphocytes T INK prêts à l’emploi pour des études in vivo et in vitro en deux semaines. Gloria Delfanti, post-doctorante au laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Après avoir disséqué la rate de la souris, écrasez-la à travers une passoire cellulaire de 70 nanomètres pour obtenir une suspension à cellule unique dans 10 millilitres de PBS avec 2% FBS. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de tampon stérile de chlorure d’ammonium potassium lysine.Incuber les cellules pendant trois minutes à température ambiante, puis bloquer avec cinq millilitres de PBS avec 2% FBS. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de PBS avec 2% de FBS et éliminez les résidus de graisse par pipetage.Pour les étapes d’enrichissement, gardez les cellules au froid et utilisez des solutions pré-refroidies à quatre degrés Celsius puis conservées sur de la glace. Centrifuger à 300 fois G pendant cinq minutes. Remettre en suspension toutes les cellules dans la quantité appropriée de PBS avec 2% FPS et un bloqueur Fc et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.Laver avec un à deux millilitres de tampon de séparation MACS par 10 millions de cellules et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes. Après avoir retiré le surnageant, colorez les cellules avec CD19-FITC et H2-IAb-FITC et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité à quatre à huit degrés Celsius. Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS par 10 millions de cellules et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes.Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 90 microlitres de tampon MACS pour 10 millions de cellules. Ajouter 10 microlitres de microbilles anti-FITC pour 10 millions de cellules. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes dans l’obscurité à quatre à huit degrés Celsius.Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS par 10 millions de cellules et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension jusqu’à 125 millions de cellules dans 500 microlitres de tampon MACS. Placez une colonne LD dans le champ magnétique du séparateur MACS.Pour éviter le colmatage, appliquez un filtre de pré-séparation sur la colonne LD et rincez-la avec deux millilitres de tampon MACS. Appliquez la suspension de cellule sur le filtre et collectez les cellules non étiquetées qui traversent la colonne. Lavez le réservoir de colonne vide trois fois avec un millilitre de tampon MACS.Recueillir l’effluent enrichi en lymphocytes T et compter les cellules, en conservant 50 microlitres pour l’analyse FACS. Après centrifugé à 300 fois G pendant cinq minutes, retirez le surnageant et colorez les cellules avec cd1d tétramère-PE. Bien mélanger et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité sur de la glace.Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS pour 10 millions de cellules. Après centrifugation à 300 fois G pendant 10 minutes, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 80 microlitres de tampon MACS pour 10 millions de cellules. Ajouter 20 microlitres de microbilles anti-PE pour 10 millions de cellules.Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes dans l’obscurité à quatre à huit degrés Celsius. Lavez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de tampon MACS par 10 millions de cellules et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension jusqu’à 100 millions de cellules dans 500 microlitres de tampon MACS.Selon le nombre de cellules, placez la colonne LS ou MS dans le champ magnétique du séparateur MACS et rincez la colonne avec un tampon MACS. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne, collectez les cellules non marquées qui passent à travers et lavez la colonne trois fois comme décrit précédemment. C’est la fraction négative.Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la sur un nouveau tube collecteur. Pipettez le tampon MACS sur la colonne et poussez le piston fourni dans la colonne pour éliminer la fraction positive enrichie en cellules T INK. Pour augmenter encore la récupération des lymphocytes T INK, centrifugez la fraction négative à 300 fois G pendant 10 minutes et répétez les étapes précédentes avec une nouvelle colonne LS ou MS.Tirez les fractions positives et déterminez le nombre de cellules. Conservez 50 microlitres de fractions positives et négatives pour l’analyse FACS afin de vérifier la pureté. Pour activer les lymphocytes T INK à un rapport de un pour un, transférez le volume approprié de billes magnétiques anti-CD3 et CD28 dans un tube et à un volume égal de PBS, puis vortexez pendant cinq secondes.Placez le tube sur un aimant pendant une minute et jetez le surnageant. Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans le volume approprié de RPMI. Centrifugez les lymphocytes T INK purifiés à 300 fois G pendant cinq minutes et mélangez-les avec des billes magnétiques anti-CD3 ou CD28 de souris T-activateur.Plaquez un millilitre de la suspension cellulaire, perles magnétiques anti-CD23 et CD28 dans une plaque de 48 puits avec 20 unités par millilitre d’IL-2, puis incubez à 37 degrés Celsius. Après cinq jours, ajoutez 10 nanogrammes par millilitre d’IL-7. Divisez les cellules en deux lorsqu’elles atteignent 80 à 90% de confluence, en ajoutant toujours 20 unités par millilitre d’IL-2 et 10 nanogrammes par millilitre d’IL-7.Dans ces conditions, les lymphocytes T INK peuvent être dilatés jusqu’à 15 jours. En utilisant ce protocole, les lymphocytes T INK sont enrichis à partir de la rate de souris transgéniques par un processus de séparation immunomagnétique. Après enrichissement, les cellules peuvent être élargies avec des billes anti-CD3 et CD28, ce qui entraîne une expansion de 30 fois en moyenne au jour 14 de la culture.La forte activation avec des billes anti-CD3 et anti-CD a induit la régulation négative de l’expression TCR des lymphocytes T IMK à la surface de la cellule et une double population négative est apparue. La majorité des lymphocytes T INK expansés sont négatifs cd4. La caractérisation des facteurs de transcription spécifiques à la lignée PLZF et ROR gamma T a permis d’identifier les phénotypes NKT1, NKT2 et NKT17 sur des lymphocytes T INK enrichis au jour zéro et 14.Les lymphocytes T INK enrichis présentent un phénotype effecteur de type T80, qui est conservé après 14 jours d’expansion, comme le confirme la sécrétion d’interféron gamma et d’IL-4 après stimulation par la PMA et l’ionomycine. Pendant les étapes de purification, n’oubliez pas de travailler rapidement avec des solutions pré-refroidies et de vous débarrasser de tout résidu de graisse pouvant être vu lors du pipetage. Les lymphocytes T INK expansés peuvent être exploités pour des essais in vitro et des transferts in vivo chez la souris, même après des modifications fonctionnelles via le transfert ou l’édition de gènes.L’expansion in vitro des lymphocytes T INK surmonte la limitation donnée par la rareté, les rendant exploitables dans des études précliniques dans les domaines de la surveillance immunitaire tumorale, des maladies infectieuses et de l’auto-immunité.

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JoVE Journal

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Immunologie et infection

Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d'évaluer leur fonction.

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