Name: 細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ 細胞追跡を用いたStentor coeruleusの口腔装置再生中の運動性解析法。タイムラプス顕微鏡と自動追跡で、再生過程における機能回復と行動変化を定量的に評価する手法を習得できます。

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この研究は、海洋生物学研究所ホイットマン・アーリーキャリア・フェローシップ(JYS)によって部分的に支援されました。Evan Burns、Mit Patel、Melanie Melo、Skylar Widmanが予備的な分析とコードテストの一部を支援してくれたことに感謝します。マーク・スラボドニックの議論と提案に感謝します。WFMは、NIH助成金R35 GM130327からの支援を認めています。

注:約100の S. coeruleus 細胞の集団を、以前に公開されたJoVEプロトコル8に従って培養した。
1. サンプル調製
<ol><li>厚さ250μmのシリコーンスペーサーシート(材料表)を顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さく切ります。5/16インチの穴を開けて、円形の井戸を作ります。良好なシールを確保するために、隣接する井戸の間に十分なスペースを残すように注意してください。 注:隣接する井戸間の3mmのスペースで十分であることが判明しました。練習すると、1つのサンプルスライドに10個のウェルを置くことができます。</li>
	<li>細胞を10%スクロースまたは2%尿素中で2分間インキュベートすることによって、OAの再生を開始する(図1A)。その後、新鮮な培地8で3回洗浄する。各ウェルに約10 個のステンター を静かにピペットで入れる。サンプル量とウェル量をできるだけ近づけるように注意してください。 注:ここで使用したウェル寸法については、12.5 μLのサンプルを各ウェルにピペットで固定しました。</li>
	<li>片方の端からウェルの上にカバーガラス( 材料表を参照)を静かに下げて、ウェルを閉じます。10 μL のピペットチップなど、狭くてやや柔軟なものを使用して、カバーグラスを押し下げてシリコーンシートに接触させ、良好なシールを確保します。</li>
</ol>2. 可視光顕微鏡タイムラプス
<ol><li>サンプルを顕微鏡ステージに置き、1つがフレーム全体に収まるように倍率を可能な限り低く設定します。 注:このプロトコルでは、顕微鏡では1.6倍のカメラアダプターと対物レンズの倍率1倍が使用されました。</li>
	<li>タイムラプスを開始します。各時点で各ウェルの毎秒30フレームで10秒のビデオを取得します。電動X-Yステージで顕微鏡セットアップを使用する場合は、タイムラプス全体を自動化します。それ以外の場合は、各時点にユーザーがいることを確認し、サンプルを手動で翻訳して各ウェルを記録します。 メモ:イメージングを行わないときは、加熱や蒸発を避けるためにサンプルを点灯させたままにしないでください。サンプル量は少なく、蒸発は気泡につながります。</li>
	<li>映画を TIFF、MOV、または AVI として保存します。 注:これらは最も一般的な非独占的なビデオファイルタイプです。特定の顕微鏡ソフトウェアに応じて、ビデオはデフォルトで独自のファイルタイプに保存されますが、前述のファイルタイプのいずれかにエクスポートできます。</li>
	<li>物理的なスケールにはピクセルからミリメートルへの変換係数を使用し、キャリブレーションを実行するか、使用するカメラから既知のピクセルサイズを使用します。キャリブレーションするには、キャリブレーションスライドまたはクリアルーラーの鮮明な画像をビデオと同じ倍率設定で取得します。任意の画像表示プログラムを使用して、既知の物理的距離のマーク間のピクセル数を数えます。 メモ: たとえば、定規の画像に 1 mm マークと 2 mm マークが 100 ピクセルずつ区切られている場合、変換係数は 100 ピクセルあたり 1 mm です。または、カメラのピクセルサイズからこの係数を導き出すには、単にカメラのピクセルサイズに倍率を掛けます。たとえば、使用するカメラのピクセル数が 3.45 μm で、使用倍率が 1.6 倍の場合、変換は 1 ピクセルあたり 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm になります。</li>
</ol>3. 細胞追跡
<ol><li>TrackCells.m と CleanTraces.m の 2 つのスクリプトを、コンピューター上の覚えやすい場所にダウンロードします。データビデオがこのコンピュータにまだない場合は、このコンピュータに転送します。 注: データ ビデオとスクリプトは、同じフォルダーにある必要はありません。</li>
	<li>データビデオを、各時点に1つずつフォルダに整理します。最初にスクリプト TrackCells.m を使用して、データ ビデオで自動セル追跡を実行します。 TrackCells.m を開き、スクリプトを実行します。</li>
	<li>ポップアップウィンドウのプロンプトが表示されたら 、[パスに追加 ]を選択します。これは通常、スクリプトが特定のフォルダから初めて実行されるときにのみ発生します。プロンプトが表示されたら、[ 1つ以上のデータビデオ]を選択して追跡を開始し、データビデオに移動します(セクション2)。複数のビデオファイルを選択するには 、Shift キーを押しながらクリックするか、Ctrl キーを押しながらクリックするか、 マウスの左ボタンを押し ながらファイル上を移動してハイライト表示します。</li>
	<li>プロンプトウィンドウの下部にある[ ファイル名: ]ボックスのファイルのリストに満足したら、[ 開く]をクリックします。最初に1つのビデオでテスト実行を行い、すべてのパラメータが正しく設定されていることを確認します(以下の説明を参照)。 注:このスクリプトは、選択した各ビデオファイルのフォルダを作成します。次に、ビデオの各フレームが.jpgファイルとしてこのフォルダに書き込まれ、 position_estimates.matという名前のファイル(ビデオで見つかったすべてのトレースが含まれます)が書き込まれます。ビデオのサイズ、ビデオの数、およびコンピューターの速度によっては、このスクリプトの実行に数時間かかることがあります。</li>
</ol>4. トレース検証
<ol><li>先に進む前に、エラー・メッセージがないことを確認して、セクション 3 で説明されているステップが正しく実行されたことを確認します。CleanTraces.m スクリプトを使用して、異常または偽のトレースを手動で拒否します。ファイルをダブルクリックして、MATLABエディタウィンドウでCleanTraces.mを開きます。</li>
	<li>プロンプトで TrackCells.mによって出力されたデータフォルダを選択します。ビデオファイルと同じ名前になり、セクション3の説明に従って作成されたフォルダの1つに移動します。フォルダを 1 つだけ選択します。 注: このスクリプトは、ポップアップ ウィンドウにトレースを 1 つずつ表示するようになりました。これらは、トレースが開始されるビデオのフレームに緑色で、トレースが終了するビデオのフレームにマゼンタでオーバーレイされます。したがって、有効なトレースは、緑色のセルとマゼンタのセルをリンクする必要があります。</li>
	<li>プロンプトが出されたら、トレースを保持するには 1 を入力し、トレースをリジェクトするには 0 を入力します。 Enter キーを押して、次のトレースに進みます。 メモ: 新しいトレースは、トレースがなくなるか、最初の 60 個が表示されるまで表示され続けます。このプロセスが完了すると、スクリプトは出力を保存するための CLEAN TRACESという名前の フォルダを自動的に作成し、残りのすべてのトレースをビデオの最初のフレームの上に表示します(図1B)。このイメージは、後で参照できるように .png LabeledTraces として自動的に保存されます。ユーザーが保持することを選択したすべてのトレースは、 clean_traces.mat ファイルに保存されます。</li>
	<li>続行する前に、すべてのビデオについてこの手順を1つの時点で完了します。 注:本稿のデータでは、各時点において各井戸について1つのビデオが取得され、各時点ごとに合計10本のビデオが取得されました。</li>
</ol>5. データの可視化
注: 異なる時点にわたる細胞集団全体の運動性を視覚的に比較するために、セクション 4 からのすべてのトレースを原点から開始し、各時点に対して 1 つの放射状変位対時間プロットを作成します (図 1C-F、すべての時点について補足図 S1 を参照)。
<ol><li>まず、 SpaghettiPlots.mというタイトルのスクリプトをダウンロードします。スクリプトを開いて実行します。ウィンドウファイルブラウザウィンドウがポップアップし、 グラフ化する井戸データ(clean_traces.mat)を含む時間フォルダの選択プロンプトが表示されたら、いずれかのタイムポイントのフォルダに移動します。このフォルダには、分析された各ビデオのフォルダが含まれている必要があります。</li>
	<li>キャリブレーションのプロンプトが表示されたら、 ミリメートルあたりのピクセル数はいくつですか?ステップ2.4で見つけたキャリブレーション値を入力し、 Enter キーを押します。 注: スクリプトは、この時点で分析されたすべてのビデオのトレースを 1 つのプロットに結合します (図 1C-F)。プロット内のかすかな点線の円は、1、2、3、および 4 mm の半径方向の変位を示します。</li>
	<li>必要に応じてプロットの軸を調整するには、スクリプトの 55 行目 (デフォルトでは、最大 4 mm の半径を含める場合は rr = 4 に設定されています) を変更します。プロットを保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration%3B+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li>
<li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861(2014).</li>
<li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167(2020).</li>
<li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759(2018).</li>
<li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell%2C+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788(2017).</li>
<li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li>
</ol>

著者らには開示するものは何もありません。

現在、多くの粒子および細胞追跡アルゴリズムが存在し、一部は完全に無料です。コストと使いやすさは、多くの場合、妥協を必要とするトレードオフです。さらに、既存の細胞追跡プログラムの多くは、水泳中に回転し、突然の方向転換を受ける可能性がある Stentorの高速水泳運動ではなく、組織培養細胞のゆっくりとした這う動きを追跡するように設計されています。これらのオプションの多くをテストした後、ここで紹介するプロトコルは、低コストの機器と単一の科学ソフトウェアパッケージ(材料表)のみを使用して、データ収集からデータ視覚化までをワンストップソリューションにすることを目的としています。これは、学生が自分の質問をし、短期間で定量的な結果に到達する障壁を下げるため、必要な機器のほとんどがすでに利用可能な教育機関や生物物理学教育ラボの研究室にとって特に興味深いものです。
この原稿で提示された方法は、百ミクロンからミリメートルサイズのスケールの生物集団の運動性を定量的に特徴付けるように適応させることができる。より小さな生物またはより大きな生物への適用は、ビ...

Stentor coeruleus(Stentor)は、その大きなサイズ、いくつかの顕微外科的技術に耐える能力、および実験室環境での培養の容易さのために単細胞再生を研究するために使用されているよく知られているモデル生物である1,2,3。初期の再生研究は、Stentorの最大かつ最も形態学的に異なる特徴であるOAに焦点を当てており、これは化学ショック4,5,6で完全に放出される。失われたOAのDe novo置換は、新しい膜帯(8つの形態学的段階にわたって機能的なOAを形成する前に細胞の前部に向かって徐々にシフトする繊毛の配列)の出現から始まる3。これらの段階は、温度に関係なく順次観察されており、ほぼすべての研究に普遍的な基準点を提供しています5。
ステンター再生の機構的分析には、再生のタイミングを測定するためのツールが必要であり、化学的または分子的スクリーンの一部として複数のサンプルに適用するのに十分堅牢で簡単です。細胞ベースのアッセイを行うための標準的な方法は、イメージングであり、この場合、再生中の新しいOAの形成をイメージングする。しかし、このようなイメージングベースのアッセイは、再生構造がマーカーとして使用できる別個の分子成分を含む場合に最も効果的であり、蛍光画像で容易に検出される。ステンターOAの場合、既知の成分(繊毛、基底体)も細胞表面の残りの部分に存在する。したがって、OA の復元を認識することは、コンポーネントの有無を探すだけでは達成できません。
むしろ、OAを検出するには何らかの形の形状認識が必要であり、 ステンター 細胞がしばしば急速な収縮プロセスを介して形状を変化させるという事実を考えると、これは潜在的に非常に困難である。この論文は、身体およびOA繊毛の運動活性に依存する再生のための代替アッセイを提示する。OAが再生するにつれて、新たに形成された繊毛は位置および活動において再現可能な変化を受け、これは次に、細胞の遊泳運動性に影響を及ぼす。運動性を解析することにより、再生構造の機能を定量化して再生を定量化する「機能再生」のアッセイを行うことができる。再生中の ステンター 毛様体機能の以前の解析では、粒子画像速度測定を外部媒体に添加したトレーサービーズと組み合わせて、再生のさまざまな段階での流れパターンの変化を観察しました7。しかし、このアプローチでは、個々の細胞とそれに関連する流れ場を一度に1つずつ手間のかかるイメージングが必要です。
細胞自体の動きを繊毛生成フローのプロキシとして使用することで、ハイスループットスクリーニングプラットフォームと互換性のある低解像度イメージングシステムを使用して、より多くの細胞を並行して解析することが可能になります。このアッセイは、原理的には、数百ミクロンからミリメートルのサイズのスケールで他の遊泳生物の発達および機能的再生を研究するために使用することができる。プロトコルのセクション1は、マルチウェルサンプルスライドの構築について説明しており、これにより、最大1日にわたる細胞集団のハイスループットイメージングが可能になります。他の細胞型で使用するために調整する方法の詳細が提供されています。プロトコルのセクション2は、このアッセイのためのビデオデータの取得をカバーしており、これはデジタル一眼レフカメラを備えた解剖顕微鏡上で達成することができる。プロトコルのセクション 3 では、MATLAB コード (補足情報) を使用したセル追跡とセル速度計算のチュートリアルを提供します。プロトコルのセクション4では、結果を簡単に解釈できるように、図1C-Fおよび図2Cに示すように、数値結果をプロットに変換する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>厚さ0.25mmのシリコンシート</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CWS-S-0.25</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm, #1.5 coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1034527</td><td>ディスカッションで述べたように、1枚のスライドにセットするサンプルウェルの数が少ない場合は、より小さなカバーグラスを使用することができます。</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td></td><td></td><td>使用しました Nikon D750</td></tr><tr><td>Chlamydomonas 137c WT株</td><td>Chlamydomonas Resource Center</td><td>CC-125</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Image Processing Toolbox</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td>needed for TrackCells.m and CleanTraces.m</td></tr></tbody></table>

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後の ステント の運動性パターンの解析

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus は、単細胞再生の研究のためのよく知られているモデル生物である。個々の細胞のトランスクリプトーム解析により、再生プロセス全体を通して段階的に差次的に調節される何百もの遺伝子(多くは口腔装置(OA)と関連していない)が明らかになった。新しいOAの成長に向けた細胞資源のこの全身的な再編成と動員は、異なる遺伝子発現の段階に対応する動きと行動の観察可能な変化をもたらすという仮説が立てられた。しかし、 S. coeruleus の形態学的複雑さは、統計と時間スケールを捉えるためのアッセイの開発を必要とした。カスタムスクリプトを使用して短いビデオのセルを追跡し、統計は大規模な人口(N〜100)にわたってコンパイルされました。OAが失われると、 S. coeruleus は最初に指向性運動の能力を失う。その後、〜4時間から始まり、〜8時間まで速度の大幅な低下を示す。このアッセイは、運動性表現型のスクリーニングに有用なツールを提供し、他の生物の調査に適合させることができる。

このアッセイの目的は、大きな(N〜100)再生ステンター集団内の細胞からの移動パターンの漸進的な変化および移動速度の段階的増加を定量化することである。結果の解釈を支援するために、このプロトコルに含まれるカスタムコードは、ビデオデータのセット内のすべての細胞移動トレースのオーバーレイ(図1C-Fおよび図S1)と、再生開始からの時間ごとの水泳速度のプロット(図2C)の2種類のプロットを生成します。正常に再生しているStentorの集団は、無方向水泳から有向遊泳への着実な移行を示すはずです(図1G)。各細胞は、約8時間にわたるOA再生プロセス中にこの遷移を完全に受けますが、傾向を明確にするためには、個人間のばらつきを集計して大きな集団の動きを見る必要があります。
<stron...

我々は、明視野顕微鏡法および細胞追跡を用いて、百ミクロンからミリメートルサイズの細胞集団の運動性および挙動の特性評価のためのプロトコルを提示する。このアッセイは、 ステンター・コエルルスが 失われた口腔装置を再生する際に、4つの行動的に異なる段階を経て遷移することを明らかにする。

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

ステンター・コエルルスは、単細胞再生を理解するためのモデル生物として長い間用いられてきた。視覚形態学的再生のタイムラインは知られているが、機能的再生のタイムラインは不明のままである。このアッセイは、損失機能の回復を定量化できるように、同期再生を受けている中心集団の運動性を追跡する。これは、他の細胞型との使用に適合させることができる。イメージングチャンバの安全なシールの欠如は、ウェルが互いに漏れたり、ウェルの内部に気泡が形成されたりする結果となる。シリコーンスペーサーの使用に慣れていない研究者のために、PSWまたは他のクリーン培地を各ウェルにピペットで固定して、使用前に漏れをテストすることを強くお勧めします。サンプルチャンバーの構造は、口頭で説明するよりも簡単に示されます。取得した映像データから運動パターンを抽出する処理も同様です。まず、顕微鏡スライドよりも高さと幅の両方でわずかに小さい厚さ250マイクロメートルのシリコーンスペーサーシートをカットします。パンチ全体を使用して円形の井戸を作成し、隣接する井戸の間に十分なスペースを残して、良好なシールを確保します。ステンターコエルラス細胞を10%スクロースまたは2%尿症で2分間インキュベートすることによって、経口装置の再生を開始する。その後、新鮮な培地で3回洗う。各ウェルに約10個のステンターを静かにピペットで入れる。サンプル量をできるだけウェル量に近づけるように注意してください。片方の端からウェルの上にカバーガラスを静かに下げて、ウェルを閉じます。10マイクロリットルのピペットチップなど、狭くてわずかに柔軟なものを使用して、カバーガラスを押し下げてシリコーンシートに接触させ、良好なシールを確保します。サンプルを顕微鏡ステージに置き、顕微鏡を利用可能な最低倍率に設定して、フレームに収まるようにします。タイムラプスを開始し、各時点で各ウェルの毎秒30フレームで10秒のビデオを取得します。キャリブレーションするには、キャリブレーションスライドまたはクリアルーラーの鮮明な画像をビデオと同じ倍率設定で取得します。任意の画像表示プログラムを使用して、既知の物理的距離のマーク間のピクセル数を数えます。2つのスクリプトをダウンロードし、セルを追跡し、トレースをコンピュータ上の覚えやすい場所にきれいにし、データビデオをこのコンピュータに転送します。データビデオをフォルダに整理します。各タイム ポイントに 1 つずつ。スクリプトトラックセルを使用して、トラックセルを開き、スクリプトを実行することによって、データビデオの自動セルトラッキングを実行します パスに追加を選択します ポップアップウィンドウでプロンプトが表示された場合、通常はスクリプトが特定のフォルダから初めて実行されるときにのみ発生します。プロンプトが表示されたら、1つ以上のデータビデオを選択して追跡を開始します。データビデオに移動し、ファイルのリストに満足したら、開くをクリックします異常または偽のトレースを手動で拒否するには、ファイルをダブルクリックしてMATLABエディタウィンドウでクリーントレースを開きます。プロンプトで、トラックセル別に出力されるデータフォルダを選択します。作成したフォルダの1つに移動して選択します。プロンプトが出されたら、トレースを保持するには 1 を入力し、トレースを拒否するにはゼロを入力します。次に、Enter キーを押して次のトレースに進みます。まず、スパゲッティプロットというタイトルのスクリプトをダウンロードします。スクリプトを開いて実行します。ファイルブラウザウィンドウがプロンプトとともにポップアップしたら、開くフォルダを選択します。いずれかの時点のフォルダーに移動します。キャリブレーションのプロンプトが表示されたら、ミリメートルあたりのピクセル数は何ですか?キャリブレーション値を入力し、Enter キーを押します。スクリプトの55行目(デフォルトではRRが4に等しい)を変更して、必要に応じてプロットの軸を調整します。最大4ミリメートルの半径を含むため。プロットを保存します。結果は、口腔装置再生プロセスの2時間、3時間、7時間、および8時間におけるステンター細胞集団の集団運動性を示す。これらのプロットは、運動性個体数の予想される増加と、集団内の最も運動性細胞の範囲における4倍の増加の両方を示す。最速の遊泳セルは、端の近くで開始された場合、完全に直線で泳ぐことが制限され、その移動範囲は小さく見えます。管細胞は、目に見えるホールドファストを有する非運動性、可視ホールドファストを有する非運動性、および可動性を有する3つの異なるカテゴリーに分類された。その結果、これらのカテゴリにわたる相対的なセル数を、再生への関数として要約した積み重ねられたヒストグラムが示されました。後に、目に見えるホールド断食を持つコロニーでかなりの数の細胞が発見され、彼らが環境を探索し、その種の他のものの近くに優先的に付着したことを強く示唆した。約1ミリメートルのサイズであるステンターコエルルスによく働くサンプルウェル寸法を選択することが重要です。これには、直径5/16インチのシリコーンスペーサーの厚さ、およびウェルあたり10セルが含まれます。これらの数値は、このプロトコルを他の細胞型に適応させるときに調整する必要があります。このアッセイは、RNA-Iと組み合わせて実施して、異なるステンター表現型の再生を調査および比較することができる。

analysis-motility-patterns-stentor-during-after-oral-apparatus

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。...

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

消化管運動のモニター（GIMM）によるモルモット遠位結腸の大腸運動の評価は、定量的に消化管での推進運動を評価するためのアプローチを学ぶことは簡単でシンプルです。...

消化管運動のモニター（GIMM）

3D組織培養のタイムラプスイメージングは​​、大脳皮質から分画されたタンパク質抽出物に反応して、神経節隆起に由来する個々の細胞の遊走挙動を調べることができます。...

神経節隆起を培養で生成された細胞の遊走挙動

electromotility、遅い運動性と曲げを含む外有毛細胞（OHC）運動性応答を、調査するために信頼性の高い方法が記載されている。...

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

Stentor coeruleusにおける単一細胞創傷治癒中の細胞質の流れの可視化

私たちの目標は、内皮細胞の捕捉のための強磁性体のステントを設計、製造、テストしました。十ステントは、骨折のために試験し、10以上のステント保持磁力を試験しました。最後に、10のステントは、 インビトロで試験したところ、8複数のステントは、細胞捕獲および保持を示すために、4匹のブタに移 ​​植しました。...

内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント

最近利用可能なビデオ録画と時空間マッピング(STmap)技術により、腸の運動性の伝播パターンと混合パターンの両方を視覚化し、定量化することが可能になりました。このプロトコルの目的は、GastroIntestinal Motility...

運動の時空間マッピングで<em&gt;エクスビボ</em腸の&gt;準備

最近の発見は、細菌のべん毛モーターがさまざまな環境信号を感知し、それに応じて改造することを示唆しています。ここで議論されているビーズアッセイは、環境ストレス要因に対する細胞適応におけるリモデリングの役割を説明するのに役立つと期待されています。...

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

巨大な繊毛虫ラッパムシは、創傷治癒と再生を研究する優れたシステムです。単一細胞または細胞断片からラッパムシ細胞培養の確立、切断細胞による再生を誘導する、化学的に membranellar...

ラッパムシの再生の研究のための方法

多くの細菌は、彼らの環境をナビゲートし、個々と集団の両方として有利な環境を植民地化するために、フラゲラ駆動の運動性を使用しています。ここでは、水泳や群れの運動に寄与する成分/経路を特定するための選択ツールとして運動性を利用する3つの確立された方法の使用を実証しています。...

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。...

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

学ぶ 細胞追跡を用いたStentor coeruleusの口腔装置再生中の運動性解析法。タイムラプス顕微鏡と自動追跡で、再生過程における機能回復と行動変化を定量的に評価する手法を習得できます。

細胞追跡を用いた口腔装置再生中および再生後のステントの運動性パターンの解析

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