초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

초고속 포스 클램프 분광법은 레이저 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 기술로, 가장 높은 시간 분해능으로 부하가 걸린 미오신 모터의 화학 역학을 조사할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 힘 방향성을 완전히 제어하면서 모터 상호 작용의 모든 단계에서 힘을 일정하게 유지함으로써 힘 생산에서 매우 빠른 이벤트를 프로빙할 수 있습니다. 적절한 조정을 통해 이 프로토콜을 키네신 및 다인을 포함한 다른 종류의 프로세스 모터에 쉽게 적용하여 강제로 조절을 밝힐 수 있습니다.

한 세트의 음향 광학 디플렉터를 선형 변환기에 장착한 후 조리개를 사용하여 대물 렌즈 후면 조리개 크기에 맞게 조리개를 조정합니다. 대물렌즈를 나사산 대물렌즈 하우징 중앙에 있는 조리개로 교체합니다. 압전 크리스탈에 의해 차단된 빔 부분이 아이리스 뒤에 보일 때까지 변환기를 레이저 빔 쪽으로 이동하고 빔이 아이리스 조리개를 완전히 채울 때까지 변환기를 약간 뒤로 돌립니다.

펜틸 아세테이트에 실리카 비드를 준비하려면 먼저 1.2 미크론 10 % 고체 실리카 비드 20 마이크로 리터를 1-1.5 밀리리터의 아세톤에 와류 및 30 초의 초음파 처리로 희석하십시오. 초음파 처리 후, 원심 분리에 의해 비드를 수집하고 두 번째 세척을 위해 비드 펠릿을 신선한 아세톤 1ml에 재현탁시킨다. 두 번째 아세톤 세척 후, 동일한 원심 분리 조건에서 세척 당 1 밀리리터의 신선한 펜틸 아세테이트로 비드를 3 번 세척하고, 1 % 니트로 셀룰로오스 및 900 마이크로 리터의 펜틸 아세테이트 100 마이크로 리터에 펠릿을 재현탁한다.

다음으로, 순수한 에탄올에 적신 실험실 티슈 조각을 사용하여 24 x 24mm 유리 커버슬립을 조심스럽게 닦은 다음 깨끗한 핀셋을 사용하여 에탄올에서 직접 유리를 헹구고 커버슬립을 부드러운 질소 흐름으로 건조시킵니다. 준비된 실리카 비드 스톡을 30초 동안 와동시키고 초음파 처리하고 에탄올 세척된 24 x 60mm 커버슬립을 사용하여 2마이크로리터의 실리카 비드 용액을 더 작은 커버슬립의 표면에 도말합니다. 구슬이 건조되는 동안 시연된 대로 26 x 76mm 슬라이드를 청소하고 슬라이드의 긴 가장자리에 테이프로 붙인 3mm 양면의 60-100미크론 두께 선 두 개를 놓습니다.

깨끗한 핀셋을 사용하여 비드가 슬라이드 챔버 내부를 향하도록 비드 코팅 커버 슬립을 테이프에 놓고 15 밀리몰 인산염 완충액과 플로팅 폴리스티렌 비드 용액으로 챔버를 채 웁니다. 그런 다음 실리콘 그리스로 챔버를 밀봉하십시오. 명시야 카메라의 픽셀 대 나노미터 비율을 보정하려면 시야 중심에서 약 5미크론의 커버슬립 표면에 있는 실리카 비드의 첫 번째 이미지를 획득합니다.

스테이지를 이동하여 비드를 시야의 중심으로 10미크론으로 옮기고 두 번째 이미지를 촬영합니다. 비드의 두 위치 사이의 픽셀 거리를 측정하여 카메라 보정 상수를 계산합니다. 트랩 위치를 보정하려면 하나의 트랩에 단일 플로팅 입자를 트래핑하고 음향 광학 디플렉터를 0.2메가헤르츠 단계로 이동하여 입자의 이미지와 각 단계에 대한 디플렉터의 해당 주파수를 획득합니다.

그런 다음 동일한 방식으로 두 번째 트랩에 대한 보정을 반복합니다. 트랩 파워와 강성을 보정하려면 각 트랩에 단일 입자를 트래핑하고 음향 광학 디플렉터를 사용하여 두 트랩을 0.2메가헤르츠 단위로 변위하고 사분면 포토다이오드 감지기를 사용하여 두 트랩에서 입자의 브라운 운동과 음향 광학 디플렉터의 해당 주파수를 기록합니다. 로렌치안 함수를 기록된 브라운 운동의 거듭제곱 스펙트럼에 피팅하여 교정 상수를 얻습니다.

측정을 위해 샘플을 조립하려면 커버슬립 표면에 실리카 비드가 있는 새 챔버에 비오틴화 BSA 밀리리터당 1mg을 추가합니다. 5 분 후, AB 완충액으로 챔버를 세척하고 스트렙타 비딘 밀리리터 당 1 밀리그램을 챔버에 첨가한다. 5분 후, 입증된 바와 같이 챔버를 세척하고, 2 마이크로몰 칼모듈린이 보충된 M5B 완충액에 3 나노몰 비오닐화 미오신-5B 헤비 메로미오신을 첨가한다.

5분 후, AB 완충액에 2마이크로몰 칼모듈린이 보충된 비오티닐화 BSA 밀리리터당 1밀리그램으로 챔버를 3회 세척하고 최종 세척 후 3분 동안 기다립니다. 반응 혼합물을 흐르게 하고 실리콘 그리스로 챔버를 밀봉합니다. 샘플을 측정하려면 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 떠다니는 알파-액티닌 비드에 초점이 맞춰질 때까지 대물렌즈를 움직입니다.

하나의 트랩을 켜고 하나의 비드를 트랩하십시오. 첫 번째 트랩이 점유되면 변환기를 움직여 트랩된 비드를 커버슬립 표면 가까이에 배치하여 여러 비드가 트랩되지 않도록 하고 두 번째 트랩에 비드를 트랩합니다. 장거리 번역기를 통해 샘플을 대체하여 용액 내에서 최소 5미크론 길이의 액틴 필라멘트를 찾습니다.

필라멘트가 발견되면 샘플을 움직여 갇힌 비드가 필라멘트의 한쪽 끝에 접근하도록합니다. 필라멘트가 부착되면 비드의 거리를 대략적인 필라멘트 길이로 조정하고 스테이지를 이동하여 바인딩되지 않은 비드 방향으로 흐름을 만듭니다. 필라멘트는 흐름에 의해 늘어나고 결국 두 번째 비드에 결합합니다.

결과 복합체를 덤벨이라고합니다"액틴-미오신 접촉을 설정하려면 두 트랩을 부드럽게 분리하고 필라멘트를 최대 약 3 피코 네우톤의 프리텐션 레벨로 설정하십시오. 덤벨의 강성을 조사하려면 하나의 음향 광학 디플렉터의 주파수를 변경하고 위치 신호를 통해 후행 비드로의 모션의 후속 전송을 확인하여 하나의 트랩을 삼각형파로 진동시킵니다. 스테이지를 이동하여 덤벨을 받침대 실리카 비드 근처에 배치하고 액틴 필라멘트가 실리카 비드 표면에 닿도록 덤벨의 높이를 조정합니다.

이 대표적인 위치 기록에서 관찰된 바와 같이, 미오신 모터가 액틴 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때, 갇힌 비드는 용액의 점성 항력에 대해 일정한 속도로 움직입니다. 미오신 모터가 필라멘트와 상호 작용하기 시작하면 움직이는 필라멘트가 전달하는 힘이 단백질로 매우 빠르게 전달되고 시스템 속도는 0으로 떨어지며 스테핑 이벤트는 실행이 끝날 때까지 일정한 힘으로 발생합니다. 피드백 시스템에 의해 힘이 양의 방향에서 음의 방향으로 전환되며, 비드가 사용자가 설정한 진동 범위의 가장자리에 도달하면 힘 방향을 전환합니다.

미오신이 필라멘트를 양의 방향으로 결합하고 변위시키면 비드를 진동 범위의 위쪽 가장자리로 밀어냅니다. 이것이 보조 힘 하에서 발생하면 진동 가장자리에서 힘 방향 반전에 의해 미오신의 실행이 중단되어 실행 길이가 덤벨 진동의 진폭으로 제한됩니다. 최적의 공간 및 시간 분해능을 얻으려면 광학 시스템의 정확한 정렬이 필요하며, 적용된 힘의 값을 정확하게 결정하려면 정확한 보정이 필요합니다.

이 기술은 DNA의 전사 인자에 대한 슬라이딩 및 표적 검색뿐만 아니라 미세 소관 필라멘트를 통해 유도되는 기계 전달 단백질 간의 동적 상호 작용을 연구하는 데 적용되었습니다.