Name: Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de Colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a medir la fotofisiología de algas epizoicas en tiempo real utilizando fluorometría de tasa de repetición rápida con Colacium sp. adherido a Scapholeberis mucronata. Este método permite evaluar la eficiencia fotoquímica del PSII en condiciones naturales.

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La labor contó con el apoyo del Fondo de Investigación Colaborativa de la Prefectura de Shiga titulado "Estudio sobre la calidad del agua y el medio ambiente del fondo de los lagos para la protección de la solidez del medio ambiente acuático" en el marco de la Subvención Japonesa para la Revitalización Regional y el Fondo de Investigación y Desarrollo Tecnológico del Medio Ambiente (Nº 5-1607) del Ministerio de Medio Ambiente del Japón. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Los autores desean agradecer a Enago (www.enago.jp) por la revisión en inglés.

1. Muestreo
<ol><li>Recoge el agua del lago de la superficie con un cubo. Para apuntar a Colacium sp. unido a S. mucronata (Figura 1A-C) filtra 0.5-10 L de agua de lago utilizando una red de malla de nylon de 100 μm52. NOTA: S. mucronata a menudo se agrega densamente en aguas poco profundas, eutróficas y fangosas, como entre las áreas de juncos (fragmitas).</li>
	<li>Almacene las muestras concentradas en botellas de plástico de 500 ml con 350 ml de agua de lago. Mantener en condiciones de oscuridad.</li>
	<li>En el laboratorio, vierta el agua de la muestra en un vaso de precipitados de 500 ml y deje que se asiente durante unos minutos.</li>
	<li>Filtre el agua del lago a través de un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm.</li>
	<li>Recoger S. individuos mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x. Realizar la identificación de especies según Błędzki y Rybak53.</li>
	<li>Transfiéralos a una gota de agua de lago filtrada (FLW) de 0,2 μm colocada en un portaobjetos de vidrio. NOTA: S. mucronata puede nadar a la superficie o adherirse a la pared del vaso de precipitados.</li>
	<li>Compruebe S. mucronata bajo microscopía de luz.</li>
	<li>Lavar S. individuos mucronata que usan PDA (3 gotas o más) para prevenir la contaminación de otros organismos (Figura 2).</li>
	<li>Mantener S. mucronata a temperatura in situ en una cámara de crecimiento inferior a 40 μmol de fotón·m−2·s−1.</li>
</ol>2. Efectos de S . mucronata en la fluorescencia basal
<ol><li>
S. cultivo de mucronata<ol>
<li>Recoja a los individuos de S. mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x y lávese con FLW, como en el paso 1.8.</li>
		<li>Airear el agua del grifo usando una bomba de aire eléctrica a través de una piedra de aire durante al menos 1 semana. Vierta 300 ml de agua del grifo aireada en un frasco de vidrio de 350 ml.</li>
		<li>Alimentar Chlorella (1 mg C·L−1) y mantener a 20 °C por debajo de 40 μmol de fotón·m−2·s−1 en una cámara de crecimiento.</li>
		<li>Después de aproximadamente 14 días, recoja a 5-30 individuos usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x e inocularlos en 300 ml de agua del grifo limpia y aireada para mantener el medio fresco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuración de FRRf<ol>
<li>Inicie el software Act2Run.</li>
		<li>Haga clic en la pestaña Opciones y seleccione Act2 FLC (LED blancos) en Modo de operación para establecer el color de los LED actínicos.</li>
		<li>Haga clic en el valor de Oscuro en el paso 1 de la configuración de la curva de luz fluorescente en la ventana principal y escriba 30 para establecer la duración del período oscuro (Figura 3A).</li>
		<li>Haga clic en la combinación de LED B, C y D para desactivar los LED verdes y naranjas (Figura 3C).</li>
		<li>Haga clic en el valor de Fets y Pitch en Sat, y escriba 100 y 2, respectivamente, para establecer el número y el tono del flashlet en la fase de saturación (Figura 3D).</li>
		<li>Haga clic en el valor de Fets y Pitch debajo de Rel, y escriba 40 y 60, respectivamente, para establecer el número y el tono del flashlet en la fase de relajación (Figura 3E).</li>
		<li>Active la bomba de la camisa de agua haciendo clic en Durante FLC (Figura 3F) para controlar la temperatura de la muestra durante la medición.</li>
		<li>Actívelo haciendo clic en Auto-LED y Auto-PMT (Figura 3F).</li>
		<li>Haga clic en Sincronizar para conectar FRRf-Act2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mediciones de FRRf<ol>
<li>Para examinar los efectos de los individuos con zooplancton sobre la fluorescencia basal, prepare S adulto. mucronata (tamaño corporal 400-650 μm) del cultivo en los pasos 2.1.1-2.1.4 sin ningún organismo adherido.</li>
		<li>Para evitar la fluorescencia del contenido intestinal, muera de hambre a los individuos en LA PDA a 20 ° C durante al menos 90 minutos.</li>
		<li>Vierta 1,5 ml de PDA en una cubeta. Recoja individuos de 0, 1, 5 y 10 S. mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x.</li>
		<li>Transferencia S. mucronata individuos en la cubeta y añadir FLW para llevar la muestra hasta 2 mL.</li>
		<li>Aclimatarse con poca luz (1-10 μmol de fotón·m−2·s−1) a 20 °C durante 15 min antes de la medición de FRRf.</li>
		<li>Haga clic en Act2 Run para iniciar la medición. Repita las mediciones >3 veces por muestra.</li>
		<li>Lea el valor Fo de la gráfica de resultados (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Efectos del organismo sustrato sobre la fluorescencia Chl- a
<ol><li>
Cultivo de Colacium sp.<ol>
<li>Preparar el medio FLW y AF-654 para el cultivo (Tabla 2).</li>
		<li>Recoger Colacium sp. unido a S. mucronata como en los pasos 1.1 y 1.2 y, mantener a temperatura in situ en una cámara de crecimiento.</li>
		<li>Recoja Colacium sp. con un caparazón mudado (Figura 1D) usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100x. Lávelos con FLW, como en el paso 1.8.</li>
		<li>Inocular asépticamente Colacium sp. y AF-6 medio en un tubo de vidrio de 10 ml en un banco limpio.</li>
		<li>Mantener el cultivo a temperatura in situ por debajo de 200 μmol de fotón·m−2·s−1 en una cámara de crecimiento. Agite el tubo de vidrio suavemente con la mano al menos una vez al día para evitar el asentamiento celular. NOTA: Para mantener el efecto de atenuación de las colonias agregadas lo más bajo posible, verifique las colonias bajo un microscopio antes de la medición de FRRf. La agregación celular puede causar colonias densas y afectar a la fotofisiología de algas55.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mediciones de FRRf<ol>
<li>Para examinar los efectos de los individuos de zooplancton en la fluorescencia de Chl-a de Colacium sp., prepare S adulto. mucronata (tamaño corporal 400-650 μm) sin ningún organismo adherido.</li>
		<li>Para evitar la fluorescencia del contenido intestinal, muera de hambre a las personas en LA PDA durante al menos 90 minutos.</li>
		<li>Configure un fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) tipo cubeta.</li>
		<li>Vierta una submuestra de 1,5 ml de Colacium sp. precultivado en una cubeta. Transferencia 0, 5, 10 y 15 S. mucronata individuos en estas cubetas y añadir 2 μm de medio filtrado para llevar la muestra hasta 2 mL.</li>
		<li>Aclimatarse con poca luz (1-10 μmol de fotón·m−2·s−1) a 20 °C durante 15 min antes de tomar la medición de FRRf. NOTA: Mantenga las muestras a temperatura de incubación durante las mediciones</li>
		<li>Haga clic en Act2 Run para iniciar la medición. Repita las mediciones >3 veces por muestra.</li>
		<li>Lea los valores FO y Fm de la gráfica de resultados (Figura 4). NOTA: Compruebe el valor RσPSII (Tabla 1), que muestra si la potencia del LED está dentro del rango óptimo para estimar correctamente los parámetros PSII. Cuando se activa el Auto-LED, el sistema Act2run controla la potencia del LED para lograr un rango RσPSII óptimo (0.042-0.064). El valor de corte experimental de RσPSII se definió en 0,03 y 0,08 en un estudio previo48.</li>
		<li>Para corregir la fluorescencia basal22, filtre el medio de cultivo utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,2 μm y mida la fluorescencia. Reste FO de la muestra de referencia de FO y Fm de Colacium sp., o modifique el valor de corrección en blanco en la configuración de la ficha Opciones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Fotofisiología de Colacium sp. (etapa adjunta)
<ol><li>Aislar individuos de S. mucronata con Colacium sp. usando una pipeta bajo un microscopio óptico.</li>
	<li>Lavar S. mucronata usando FLW, como en el paso 1.8.</li>
	<li>Transferencia S. mucronata en 100 mL de PDA. Para la inanición, mantener en condiciones de oscuridad a temperatura in situ durante 90 min.</li>
	<li>Vierta 1,5 ml de PDA en una cubeta.</li>
	<li>Transferencia ~10 S. individuos mucronata con Colacium sp. en una cubeta. Para las mediciones, se necesitan más de 100 células de Colacium por 2 ml. Agregue FLW para llevar la muestra hasta 2 ml.</li>
	<li>Aclimatarse a baja luz (1-10 μmol de foton·m−2·s−1) a temperatura in situ durante 15 min. Mida la fluorescencia de Chl-a como en los pasos 3.2.6-3.2.8.</li>
	<li>Para enumerar el número de células adheridas, fije la muestra con glutaraldehído (volumen final del 2%) después de tomar la medición de FRRf. Tome fotografías a varias profundidades focales y posiciones de S. mucronata bajo un microscopio de luz.</li>
</ol>5. Fotofisiología de Colacium sp. (etapa planctónica)
<ol><li>Cultivar Colacium sp. muestreado en medio AF-6 a temperatura in situ como en los pasos 3.1.1-3.1.5.</li>
	<li>Para la fase estacionaria, tome 2 ml de Colacium sp. cultivado y vierta en una cubeta.</li>
	<li>Aclimatarse a baja luz (1-10 μmol de foton·m−2·s−1) a temperatura in situ durante 15 min. Mida la fluorescencia de Chl-a como en los pasos 3.2.6-3.2.8.</li>
</ol>6. Efectos de la adición de Ca y Mn en la fotofisiología de Colacium sp.
<ol><li>Efectos en el escenario adjunto<ol>
<li>Aislar individuos de S. mucronata con Colacium sp. usando una pipeta bajo un microscopio óptico. Lavar con PDA, como en el paso 1.8.</li>
		<li>Transfiera seis individuos cada uno en 12 vasos de vidrio con 30 ml de PDA. Asegúrese de que cada vaso de precipitados contenga >100 células de Colacium sp.</li>
		<li>Añadir 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamiento con Ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (tratamiento Mn), o agua ultrapura (control) a cada vaso de precipitados. Incubar las muestras bajo 200 μmol de fotón·m−2 ·s−1 a temperatura in situ en una cámara de crecimiento.</li>
		<li>A las 3 h y 21 h, transfiera todos los individuos y pieles mudas a una cubeta con 2 ml del medio.</li>
		<li>Para examinar la respuesta rápida al aumento de la luz, haga clic en Arriba de los períodos de 8 pasos de luz actínica y escriba 20 (Figura 3A) para establecer la duración de cada paso en 20 s. Para establecer la luz actínica paso a paso como 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 y 200 μmol foton·m−2·s−1, haga clic en High E y Step Up y cambie los valores a 200 y 34, respectivamente (Figura 3B).</li>
		<li>Después de 15 min de aclimatación oscura, mida la fluorescencia Chl-a de cada muestra similar a los pasos 3.2.6-3.2.8. NOTA: Verifique que los valores de RσPSII y RσPSII' estén dentro del rango óptimo (0.03-0.08)48.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Efectos sobre la etapa planctónica<ol>
<li>Cultivar Colacium sp. muestreado en medio AF-6 a temperatura in situ como en los pasos 3.1.1-3.1.5.</li>
		<li>Transfiera el Colacium sp. cultivado a FLW y aclimata a una temperatura in situ inferior a 200 μmol de foton·m−2·s−1 durante 3 días.</li>
		<li>Transfiera 1 ml de las muestras aclimatadas a tres viales de vidrio con 10 ml de PDA.</li>
		<li>Añadir 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamiento con Ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (tratamiento Mn), o agua ultrapura (control) a viales. Incubar las muestras bajo 200 μmol de fotón·m−2·s−1 a temperatura in situ en una cámara de crecimiento.</li>
		<li>A las 3 h y 21 h, mida la fluorescencia Chl-a de cada muestra como en los pasos 3.2.6-3.2.8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen divulgaciones que declarar.

Este protocolo demostró por primera vez que la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta en un entorno natural es comparable a su etapa planctónica en medio AF-6. Además, el contenido intestinal de S. mucronata hambrienta no afectó la fluorescencia basal y Chl-a cuando la densidad fue ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 y Figura 6). Estos resultados sugieren que este protocolo puede medir la fotofisiología de Colacium</...

La fluorescencia variable de clorofila es una herramienta útil para medir la fotofisiología del fotosistema de algas II (PSII). Las algas responden a diversas tensiones ambientales, como el exceso de luz y la deficiencia de nutrientes, alterando su fotofisiología PSII. El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método común para medir la fotofisiología psiI1,2 y estimar la productividad primaria1,3,4, que permite monitorear la fotofisiología psiI del fitoplancton, así como la productividad primaria en amplias escalas espaciales y temporales5,6,7. FRRf puede medir simultáneamente la sección transversal de absorción de PSII (σ PSII), la concentración del centro de reacción ([RCII]), la eficiencia fotoquímica máxima (Fv / Fm), la eficiencia fotoquímica efectiva (Fq ′ / Fm ′) y el enfriamiento no fotoquímico (NPQNSV) (Tabla 1). En general, Fv/Fm y Fq′/Fm′ se definen como actividad PSII8, mientras que NPQNSV se define como energía relativa disipada por calor9.
Es importante destacar que los destellos de rotación única (ST) de FRRf reducen completamente el aceptor primario de electrones de quinona, QA, pero no el grupo de plastoquinona. Por el contrario, los destellos de rotación múltiple (MT) de un fluorómetro de modulación de amplitud de pulso (PAM) pueden reducir ambos. El método ST tiene una clara ventaja sobre el método MT al identificar los posibles orígenes de NPQNSV al medir simultáneamente la cinética de recuperación de Fv / Fm, Fq ′ / Fm ′, NPQNSV y σ PSII10. Hasta la fecha, varios tipos de instrumentos FRRf, como el tipo sumergible, el tipo cuvette y el tipo de flujo a través, están disponibles comercialmente. El FRRf de tipo sumergible permite mediciones in situ en océanos y lagos, mientras que el FRRf de tipo cubeta es adecuado para medir pequeños volúmenes de muestra. El tipo de flujo a través se usa comúnmente para medir continuamente la fotofisiología del fitoplancton en aguas superficiales.
Dado el desarrollo de fluorómetros PAM, incluido el tipo cubeta, para una amplia gama de sujetos11, los fluorómetros PAM siguen siendo más comunes que los FRRf en la investigación de fotofisiología de algas12. Por ejemplo, aunque la estructura de la cámara de muestreo y la capacidad de la cubeta entre estas herramientas solo difieren ligeramente, el PAM tipo cubeta se ha aplicado a fitoplancton13,14,15, microalgas bentónicas16,17,18, algas de hielo19 y algas epizoicas20, mientras que el FRRf de tipo cubeta se ha aplicado principalmente a fitoplancton21,22,23 y un número limitado de comunidades de algas de hielo24,25. Dada su eficacia, el FRRf de tipo cubeta es igualmente aplicable a las algas bentónicas y epizoicas. Por lo tanto, la expansión de su aplicación proporcionará una visión considerable de la fotofisiología PSII, particularmente para la fotofisiología de algas epizoicas menos conocida.
Las algas epizoicas han recibido poca atención, con pocos estudios que examinen su fotofisiología PSII20,26, muy probablemente debido a sus funciones menores en las redes tróficas acuáticas27,28. Sin embargo, los epibiontes, incluidas las algas epizoicas, pueden influir positivamente en la dinámica de la comunidad de zooplancton, como el aumento de las tasas de reproducción y supervivencia29,30, así como impactar negativamente en procesos, como el aumento de la tasa de hundimiento29,31 y la vulnerabilidad a los depredadores visuales32,33,34,35,36 . Por lo tanto, explorar los factores ambientales y biológicos que controlan la dinámica de los epibiontes en las comunidades de zooplancton es crucial.
Entre las algas epizoicas, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) es un grupo de algas comunes, de agua dulce32,37,38,39 con varias etapas de vida, incluyendo etapas planctónicas adjuntas (Figura 1A-D), planctónicas no móviles (Figura 1E, F) y planctónicas móviles40,41 . Durante la etapa planctónica no móvil, las células viven como plancton unicelular, colonias agregadas o colonias de láminas de una capa, cubiertas por mucílago42. En la etapa de unión, Colacium sp. utiliza mucílago excretado desde el extremo anterior de la célula37,39,41 para adherirse a organismos sustratos (basibionts), particularmente microcrustáceos41,43. Su ciclo de vida también implica desprenderse del exoesqueleto muda o basibionte muerto y nadar con sus flagelos para encontrar otro organismo sustrato39. Tanto la etapa planctónica como la unida pueden aumentar el tamaño de su población en mitosis40. Aunque se presume que su etapa adjunta es un rasgo evolutivo para la recolección de recursos, como la luz44 y los oligoelementos41,45,46, o como una estrategia de dispersión27, se dispone de poca evidencia experimental sobre estos aspectos37,41,44 y los mecanismos clave de unión son en gran parte desconocidos. Por ejemplo, Rosowski y Kugrens esperaban que Colacium obtuviera manganeso (Mn) a partir de copépodos de sustrato41, concentrados en el exoesqueleto47.
Aquí, describimos cómo medir la fotofisiología PSII de algas planctónicas y el método de aplicación relacionado para apuntar a algas adheridas (uniéndose al zooplancton) con células de Colacium sp. utilizando el FRRf de tipo cubeta. Utilizamos el sistema Act2 equipado con tres diodos emisores de luz (LED) que proporcionan energía de excitación de flash centrada en 444 nm, 512 nm y 633 nm48. Aquí, 444 nm (azul) corresponde al pico de absorción de la cromalina a (Chl-a), mientras que 512 nm (verde) y 633 nm (naranja) corresponden a los picos de absorción de ficoeritrina y ficocianina, respectivamente. El pico de detección de señal fluorescente es de 682 nm con medio ancho de banda de 30 nm. Dado que es difícil encontrar la etapa planctónica de Colacium sp. en ambientes naturales, su etapa adjunta se recolectó para los experimentos. Entre los numerosos organismos sustratos, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figura 1A, B, G) es una de las más simples de manejar debido a su lenta velocidad de natación, gran tamaño corporal (400-650 μm) y comportamiento único (colgando boca abajo en la superficie del agua). Por lo tanto, este protocolo utiliza Colacium sp. unido en S. mucronata como un estudio de caso del sistema Colacium-basibiont. Para evitar la fluorescencia derivada del contenido intestinal, S. mucronata se murió de hambre. Como un estudio anterior informó que la señal de fluorescencia del contenido intestinal (algas ingeridas) muestra una disminución de cinco veces después de 40 min49, esperábamos que la inanición de 90 min fuera suficiente para minimizar la posibilidad de que la fluorescencia del contenido intestinal afectara la medición de FRRf con efectos mínimos de estrés experimental para Colacium sp., como la deficiencia de nutrientes. Además, este protocolo se aplicó para aclarar el mecanismo de unión de Colacium sp. y determinar cómo dos metales, el calcio (Ca) y el manganeso (Mn) afectan la fotofisiología de las etapas planctónica y adjunta. El calcio juega un papel clave en las vías fotosintéticas50 de múltiples maneras, y ambos metales son necesarios para construir los complejos de evolución de oxígeno de la PSII51. Como el calcio y el manganeso están altamente concentrados en el caparazón del zooplancton de crustáceos47, planteamos la hipótesis de que la fotofisiología de Colacium sp. podría responder más prominentemente al enriquecimiento de Ca y Mn durante la etapa planctónica si esta etapa de la vida obtiene estos elementos de S. mucronata durante la etapa adjunta.

<table><tbody><tr><td>Filtro de jeringa Acrodisc</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, EE. UU</td><td></td><td>. 0.2 &mu; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>Act2Run</td><td>CTG Ltd., West Molesey, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Wako</td><td>023-08711</td><td>AF-6</td></tr><tr><td>medio CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-25031</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Wako</td><td>036-00382</td><td>AF-6</td></tr><tr><td>medio Ácido cítrico</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>036-03682</td><td>AF-6</td></tr><tr><td>medio Concentrado Chlorella</td><td>Recenttec, Tokio, Japón</td><td></td><td>20 mg C&middot; mL&menos; 1 ; tienda a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>FastOcean Act2</td><td>CTG Ltd., West Molesey, Reino Unido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fe-citrato</td><td>Wako</td><td>093-00952</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>091-00872</td><td>medio AF-6</td></tr><tr><td>HCLP-880PF</td><td>Nippon Medical and Chemical Instruments &nbsp;Co., Ltd., Osaka, Japón</td><td></td><td>Con bombillas LED</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>160-04292</td><td>AF-6</td></tr><tr><td>medio KH2PO4</td><td>Wako</td><td>167-04241</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Wako</td><td>137-00402</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>MnCl3&middot; 4H2O</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Wako</td><td>343-01861</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Na2MoO4</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>Wako</td><td>015-03231</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Contador de plancton</td><td>Matsunami Glass, Osaka, Japón</td><td>S6300</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ensayo Pylex</td><td>CTG Ltd., West Molesey, Reino Unido</td><td></td><td>Con borde, 16 x 100 mm</td></tr><tr><td>Vit. B1</td><td>Wako</td><td>203-00851</td><td>AF-6</td></tr><tr><td>medio Vit. B12</td><td>Wako</td><td>226-00343</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>Vit. B6</td><td>Wako</td><td>165-05401</td><td>AF-6 medio</td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Wako</td><td>264-00402</td><td>AF-6 medio</td></tr></tbody></table>

medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo cuvette

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método beneficioso para medir la fotofisiología del fotosistema II (PSII) y la productividad primaria. Aunque FRRf puede medir la sección transversal de absorción de PSII (σ PSII), la máxima eficiencia fotoquímica (Fv / Fm), la eficiencia fotoquímica efectiva (Fq ′ / Fm ′) y el enfriamiento no fotoquímico (NPQNSV) para varias algas eucariotas y cianobacterias, casi todos los estudios de FRRf hasta la fecha se han centrado en el fitoplancton. Aquí, el protocolo describe cómo medir la fotofisiología PSII de un alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), en su etapa adjunta (unida al zooplancton), utilizando FRRf de tipo cubeta. En primer lugar, estimamos los efectos del zooplancton de sustrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sobre la fluorescencia basal y la σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′, y NPQNSV del planctónico Colacium sp. Para validar esta metodología, se registraron las mediciones fotofisiología de Colacium sp. adherido en S. mucronata y se compararon estos resultados con su etapa planctónica. Los resultados representativos mostraron cómo el protocolo podría determinar los efectos del calcio (Ca) y el manganeso (Mn) en la fotofisiología de Colacium sp. e identificar los diversos efectos del enriquecimiento de Mangan entre las etapas adjuntas y planctónicas. Finalmente, discutimos la adaptabilidad de este protocolo a otras algas perifíticas.

No hubo efecto significativo de la fluorescencia basal (Figura 5) o de la fluorescencia Chl-a (Figura 6) por S. mucronata hasta 5 individuos (inds.) mL−1. Sin embargo, Fv/Fm y NPQNSV se vieron significativamente afectados cuando S. mucronata fue de 7,5 inds·mL−1. Por lo tanto, para medir la fotofisiología de Colacium sp. durante la etapa adjunta,...

El fluorómetro de tasa de repetición rápida (FRRf) es un método beneficioso para medir la fotofisiología del fotosistema II y la productividad primaria. Aquí describimos un protocolo para medir la fotofisiología PSII del alga epizoica, Colacium sp. sobre sustrato zooplancton utilizando FRRf tipo cubeta.

Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de Colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Este protocolo mide la actividad fotosintética de las algas adheridas, mientras que todavía se adhieren al plancton, al igual que en la naturaleza. La principal ventaja de esta técnica es que la medición de la fotofisiología se puede hacer en tiempo real sin distracción de la muestra. Para examinar los efectos de los individuos de zooplancton sobre la fluorescencia basal, prepare scapholeberis mucronata adulto del cultivo sin ningún organismo adherido.Ahora priva a los individuos en FLW a 20 grados Celsius durante al menos 90 minutos para evitar la fluorescencia del contenido intestinal. Vierta 1.5 mililitros de FWL en una cubeta. Recoja el número deseado de s.individuos mucronata usando una pipeta bajo un microscopio óptico a un aumento de 100 veces y los transfieren a la cubeta. Agregue FLW para llevar el volumen de la muestra hasta 2 mililitros y permita que se aclimate con poca luz a 20 grados Celsius durante 15 minutos antes de la medición del fluorómetro de tasa de repetición rápida. Luego haga clic en actuar para ejecutar"para iniciar la medición y repetir las mediciones más de tres veces por muestra.Lea el valor F0 de la gráfica resultante. Recoja las especies de colacium c

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Investigación

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Biology

Biología

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Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

Este video demuestra la técnica de espectroscopia de fluctuación de fluorescencia (FFS) para estudiar la homo-oligomerización de proteínas. Las proteínas marcadas con fluorescencia en una muestra se dimerizan con un agente cuando se estudia la oligomerización de proteínas con FFS. Utilizando un microscopio confocal, a medida que las proteínas entran y salen del pequeño volumen de observación, se realiza el análisis de las fluctuaciones en el brillo de las moléculas fluorescentes para determinar...

Espectroscopía de fluctuación de fluorescencia para estudiar la homooligomerización de proteínas

Fuente: Kulkarni, M. et al. Imágenes de la dinámica de Ca2+ en los terminales de los axones fotorreceptores de cono de la retina del ratón. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para monitorear la dinámica del calcio en los fotorreceptores de cono de la retina de un ratón transgénico. Describe los pasos para preparar cortes de retina, obtener imágenes de biosensores de calcio basados en FRET y analizar los cambios de fluorescencia para cuantificar los...

Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.

El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos

Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Este artículo presenta un método para el análisis espaciotemporal de sondas móviles basadas en la transferencia de energía de resonancia de Förster (smFRET) de una sola molécula utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. El kit de herramientas de software recientemente desarrollado permite la determinación de trazas de tiempo smFRET de sondas en movimiento, incluida la eficiencia FRET correcta y las posiciones moleculares, como funciones del tiempo.

Análisis espaciotemporal bidimensional automatizado de sondas MÓVILES FRET de una sola molécula

El presente protocolo describe imágenes de autofluorescencia paso a paso y la evaluación de los cambios de ficobiliproteína en algas rojas basadas en análisis espectral. Este es un método no destructivo y sin etiquetas para evaluar la adaptación celular a hábitats extremos, cuando solo hay material escaso disponible y las células crecen lentamente, o no crecen en absoluto, en condiciones de laboratorio.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar la fisiología de las algas rojas

Aprende a medir la fotofisiología de algas epizoicas en tiempo real utilizando fluorometría de tasa de repetición rápida con Colacium sp. adherido a Scapholeberis mucronata. Este método permite evaluar la eficiencia fotoquímica del PSII en condiciones naturales.

Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de Colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette

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