Microdisseção e Dissociação do Ovídeo Murine: Identificação do Segmento Individual e Isolamento de Célula Única

Diferentes segmentos de oviduto possuem funções fisiológicas distintas e são diferencialmente suscetíveis a mudanças patológicas. A identificação dos diferentes segmentos em um oviduto de camundongos muito pequeno é desafiadora, assim como a produção de um bom rendimento de células bem diferenciadas por dissociação tecidual. Neste vídeo, vamos demonstrar como desenrolar o oviduto do mouse, reconhecer os diferentes segmentos para que eles possam ser analisados individualmente e, finalmente, como produzir um rendimento relativamente alto de células dissociadas diferenciadas.

Uma melhor compreensão do ambiente específico da ampola pode melhorar as técnicas de fertilização in vitro. Além disso, ao contrastar o infundibulum com outros segmentos, podemos entender melhor a propensão do infundibulum para a transformação maligna. O procedimento de dissociação unicelular libera estromal, bem como células epiteliais do oviduto.

Nosso método também oferece oportunidades para analisar separadamente contribuições imunológicas, musculares lisas e células epiteliais para a fisiologia e patologia do oviduto. Trabalhar sob um microscópio de dissecção pode ser difícil no início. Eu aconselharia praticar com um tubo maior, como o útero, para garantir que suas ferramentas sejam adequadas para a microdisseção oviduct.

Comece afixando um pedaço de cera dentária em uma placa de Petri com adesivo e deixando-o secar. Em seguida, higienize o prato com 70% de etanol. A superfície está pronta para dissecção.

Imobilize a placa de Petri contendo a cera dentária na plataforma fria sob um microscópio de dissecção quando estiver pronto para dissecção. Desinfete a superfície ventral do animal com 70% de etanol. Em seguida, abra a cavidade abdominal e pélvica com uma tesoura de dissecção estéril.

Mova o trato gastrointestinal para um lado para localizar o útero bihornal dorsal. Siga cada chifre uterino rostrally para localizar cada oviduto e ovário que estão envoltos na almofada de gordura uterina logo abaixo do rim. Em seguida, extirpa os dois ovidutos laterais com os ovários e uma parte do chifre uterino distal ainda preso usando uma tesoura de dissecção.

Corte cada chifre uterino lateral com aproximadamente um a dois centímetros da buzina ainda presa ao ovídeo enrolado e ovário. Submergir o tecido imediatamente em dois mililitros de meio de dissecção fria, em seguida, afixar o tecido uterino à cera dentária com uma agulha de calibre 25 estéril para fixar tecido para dissecção. Limpe e disseca o bloco de gordura ovariana e o tecido conjuntivo para visualizar o oviduto claramente.

Use uma seringa de um mililitro para distribuir uma a duas gotas de solução de corante azul toluidina de 1% toluidina e incubar por 30 segundos a um minuto. Enxágüe com DPBS frio e, em seguida, remova todo o líquido. Puxe levemente o ovário do oviduto enrolado.

Corte na membrana bursal no ligamento largo para remover o ovário do ovídeo sem comprometer o tecido tubal. Localize a extremidade de fimbrial distal do oviduto encontrado lateralmente na junção tubal uterina. Puxe suavemente o tubo e corte no mesosalpinx com micro-tesoura springform para desenrolar o oviduto.

Corte o tubo para produzir a região infundibular. Em seguida, extirlie a região amprária cortando entre as curvas dois e três. Por fim, corte a porção restante para a junção tubal uterina que é a região ítmica.

Imediatamente congele os segmentos de tecido dissecado em nitrogênio líquido e, em seguida, adicione 200 microliters de reagente de extração de RNA frio e mistura de contas de homogeneização um-para-um ao tecido para isolamento de RNA. Começando na região fimbrial, corte o tubo longitudinalmente com uma tesoura de mola e use fórceps como alavanca para expor o epitélio luminal. Pique as porções abertas e o restante em aproximadamente um a dois milímetros.

Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de dissociação não enzimática quente ao tecido e incubar a 37 graus Celsius. Imagens fluorescentes e de contraste de fase de um aglomerado celular positivo para occludin, núcleos e tubulina acetilada são mostradas aqui. O vermelho denota occludin, azul denota núcleos, e o verde denota tubulina acetilada.

A borda apical ciliada permanece intacta em todo o protocolo e suporta mais digestão para células únicas. Nessas imagens representativas, são mostrados canais vermelhos, azuis, de fase e verdes. Após uma breve incubação de pronase, a maioria das células são solteiras.

A coloração de iodeto de propidium mostra aproximadamente 93% de viabilidade em Brightfield, canal vermelho PI positivo, e fusão. O início da fusão mostra uma borda ciliada intacta em uma única célula dissociada. Tais células têm ativamente batido cilia.

O RNA inteiro foi avaliado para rendimento e qualidade por espectrofotômetro microvolume e bioanalítulo. Os resultados mostram que este método produz 800 a 1.200 nanogramas de RNA por segmento, exceto para amostras infundibulares onde a junção de dois animais pode ser necessária para o rendimento adequado para ensaios a jusante. Os resultados apresentados para o infundibulum são agrupados de dois animais, totalizando quatro regiões infundibulares.

Este protocolo consegue com sucesso o RNA puro analisado com um espectrofotômetro microvolume e um bioanalítulo. As amostras têm uma relação de absorção de 260 por 280 nanômetros entre 1,8 e 2, típicas de espécies puras de nucleotídeos de RNA. A bioanálise das amostras mostrou alta integridade do RNA com número de integridade de RNA avaliado acima de sete, apropriado para a expressão a jusante e análise de sequenciamento.

Lembre-se de reter de um a dois centímetros do chifre uterino para fixar o sistema tubal à plataforma de dissecção. Além disso, o uso do corante azul toluidina ajuda na rápida descoilação do oviduto. Quanto mais rápido o desenrolar, melhor a preservação e menor quantidade de degradação do RNA.

Este método é suficiente para obter RNA de qualidade adequada para sequenciamento de RNA permitindo sequenciamento individual do segmento. A dissociação celular é apropriada para sequenciamento unicelular ou citometria de fluxo permitindo um segmento e análise celular mais precisas. O método ajudará a mover o campo para além de toda a análise do tubo que mascara diferenças no segmento ou nível de célula única.