研究线粒体功能障碍的 体外 方法:一种Cybrid模型

网络生成仍然是了解任何新型线粒体DNA突变的致病作用并将三质体的百分比与疾病严重程度相关联的最新协议。该技术允许在均匀的核系统中进行生化研究，其中不存在患者核背景的贡献。该技术可以验证线粒体DNA突变的致病性。

并使得有可能在生化水平上研究其影响 使用两毫升1X PBS（不含钙和镁）将含有成纤维细胞的35毫米培养皿清洗两次。用70%乙醇清洁盘子的外表面，等到酒精蒸发。从盘子上取下盖子，从瓶子上取下螺旋盖。

将每个不带盖子的培养皿倒置在每个250毫升离心机瓶的底部。在每个瓶子中缓慢加入32毫升成核培养基，使培养基进入培养皿并与细胞接触。使用长玻璃牧场移液器去除盘子上的任何气泡，在本生火中弯曲尖端。

用螺旋盖关闭每个瓶子，然后将其转移到离心机中。在37摄氏度和8， 000 x G下离心20分钟，从瓶子中吸出培养基并丢弃。通过将瓶子倒置在先前喷有70%乙醇的无菌纱布上来去除培养皿。

用70%乙醇清洁培养皿的外表面及其盖子，并在乙醇蒸发后关闭培养皿。在继续之前，使用倒置显微镜检查活细胞的细胞形成。寻找极细长的成纤维细胞，因为它们的细胞核被细胞查拉辛诱导挤出。

向每个35毫米培养皿中加入1， 000， 143行零细胞。重新悬浮在两毫升补充了5%FBS的培养基中。将培养皿在加湿的二氧化碳培养箱中放置三个小时，以将143排零细胞沉降在鬼魂上。

孵育三小时后，吸出并丢弃培养基。用两毫升不含血清或MEM的DMEM高糖培养基洗涤粘附细胞两次，然后吸出并丢弃培养基。向细胞中加入500微升聚乙二醇溶液，孵育一分钟。

吸出并丢弃聚乙二醇溶液。用两毫升DMEM高糖洗涤细胞三次，不含血清或MEM。加入两毫升熔融培养基，在37摄氏度的培养箱中用5%二氧化碳孵育过夜。

胰蛋白酶消化剩余培养皿中的细胞计数并将它们接种到一个或多个培养皿中，在补充培养物中每个培养皿中加入50至100个细胞，直到出现克隆。然后让它们生长几天。使用体视显微镜，用克隆圆柱体或移液器尖端从培养皿中取出克隆。

尽量避免池化不同的克隆并将其转移到96孔板中，每个孔含有200微升补充培养基。Cybrids是从来自携带异质M2343A2G的患者的成纤维细胞开始产生的，这是与线粒体肌病，脑病乳酸性酸中毒和中风样发作相关的最常见的线粒体DNA突变之一。对可变数量的串联重复的分析表明，网络DNA与行零细胞相同，证实了用143 B基因组替换了患者的网络DNA。

限制性片段长度多态性或测序分析可用于评估线粒体DNA突变的存在和异质体百分比。当尝试此方案时，重要的是要验证核子和线粒体DNA的正确遗传资产，以及再填充的cybrids中的线粒体DNA量。