Name: Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Leer een methode voor single-particle cryo-EM dataverzameling met stage tilt om de oriëntatieverdeling van deeltjes te verbeteren. Deze aanpak vermindert oriëntatiebias en verhoogt de kwaliteit van EM-maps aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Bill Anderson, Charles Bowman en Jean-Christophe Ducom (TSRI) voor hun hulp bij microscopie, Leginon-installaties en infrastructuur voor gegevensoverdracht. We bedanken ook Gordon Louie (Salk Institute) en Yong Zi Tan (National University of Singapore) voor het kritisch lezen van het manuscript. We danken Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) voor het verstrekken van het plasmide voor expressie van DPS. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Amerikaanse National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 en R01AI136680 aan DL), de National Science Foundation (NSF MCB-2048095 aan DL), de Hearst Foundations (aan DL) en Arthur en Julie Woodrow Chair (aan J. P. N.).

1. Monstervoorbereiding
<ol><li>Gebruik rasters met goudfolie en goudrastersteun16 (zie materiaaltabel) omdat gekantelde gegevensverzameling door bundelgeïnduceerde beweging 17 kan accentueren. OPMERKING: Voor dit onderzoek werden monsters op roosters verglaasd met behulp van de handmatige plof- en blottingtechniek18 in een bevochtigde (meer dan 80%) koelruimte (~4 °C).</li>
	<li>Vermijd het gebruik van roosters met koperen ondersteuning en koolstoffolie of een continue laag amorfe koolstof, tenzij absoluut noodzakelijk, omdat deze roosters kunnen leiden tot een grotere door de bundel geïnduceerde beweging16 wanneer de monsterfase wordt gekanteld. OPMERKING: Alternatieve ondersteuningslagen, zoals grafeen/grafeenoxide, lijken de door de bundel geïnduceerde beweging te verminderen in vergelijking met amorfe koolstof 19,20.</li>
	<li>Vooraf rasters screenen en regio's identificeren die worden gekenmerkt door een acceptabele ijsdikte en deeltjesverdeling. Rasters die te dicht opeengepakte deeltjes bevatten, zullen leiden tot deeltjesoverlapping tijdens gekantelde gegevensverzameling, wat van invloed kan zijn op downstream gegevensverwerkingsstappen. OPMERKING: Deze stappen zijn subjectief omdat het identificeren van goede gebieden van ijs wordt uitgevoerd door het visueel inspecteren van onscherpe beelden voor gebieden waar het deeltjescontrast duidelijk is. Dit is mogelijk niet haalbaar voor alle monsters, omdat sommige monsters zich niet efficiënt verspreiden in gebieden met dun ijs, wat leidt tot uitdagingen tijdens het verzamelen van gegevens (beschreven in de sectie Discussie).</li>
	<li>Verglaas de roosters met uw eiwitmonster. Hier, voor demonstratiedoeleinden, gebruiken we DNA-bescherming tijdens uithongering (DPS) -eiwit (zie tabel met materialen) in een bereik van 0,1-0,5 mg / ml met goudfolie en gouden ondersteuningsroosters. OPMERKING: Het eiwit werd gezuiverd zoals eerder beschreven, behalve dat er geen TEV-proteasesplitsing werd uitgevoerd21. Het eiwitconcentratiebereik voor een monster van belang zal individueel moeten worden geoptimaliseerd, omdat het moeilijk is om een ideaal bereik te meten dat universeel toepasbaar is en vrijwel zeker zal variëren tussen verschillende monsters.</li>
</ol>2. Gekantelde gegevensverzameling instellen
<ol><li>Lijn de microscoop uit om parallelle verlichting van het monster te garanderen en coma-afwijkingen te minimaliseren22. OPMERKING: De microscoop moet goed zijn uitgelijnd voor standaard SPA-gegevensverzameling zonder fasekanteling. Er zijn geen speciale uitlijningen nodig voor gekantelde gegevensverzameling, maar een goede uitlijning zorgt ervoor dat targeting en imaging soepel verlopen. Een algemeen schema waarin gekantelde en niet-gekantelde gegevensverzameling worden vergeleken, wordt gegeven in figuur 2.</li>
	<li>Neem een rasteratlas op zonder fasekanteling om vierkanten te identificeren die geschikt zijn voor gegevensverzameling of inspecteer vierkanten handmatig bij de vergroting die wordt gebruikt in Square Acquisition Node. Zoek naar vierkanten waar de folie intact is, er niet uitgedroogd uitziet en een ideale ijsdikte heeft. OPMERKING: Square Acquisition Node is het knooppunt met lage vergroting dat wordt gebruikt voor beeldvorming op meerdere schalen in Leginon.<ol><li>Voor typische niet-gekantelde geautomatiseerde gegevensverzameling neemt u een rasteratlas op, die een overzicht geeft van de algehele rasterkwaliteit en een eerste indicatie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling.</li>
		<li>Selecteer vervolgens geschikte vakjes door de atlas en dien deze in de wachtrij in. Vervolgens, hetzij door handmatige selectie van gaten of via de geautomatiseerde EM-gatzoeker, wachtrij en dien de gatdoelen in.</li>
		<li>Gebruik ten slotte de geautomatiseerde EM-gatzoeker voor het indienen van blootstellingsdoelen met een hoge vergroting. OPMERKING: Voor het verzamelen van gekantelde gegevens moeten vierkanten mogelijk handmatig in de wachtrij worden geplaatst voor consistente resultaten, vooral als de optimale kantelhoek niet vooraf is bepaald en waarschijnlijk tijdens het verzamelen van gegevens zal worden aangepast. De rasteratlas kon ook worden vastgelegd met behulp van een vooraf gedefinieerde fasekanteling als de kantelhoek die werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens eerder was vastgesteld.</li>
	</ol></li>
	<li>Verplaats het voorbeeldstadium naar een interessant vierkant.</li>
	<li>Bepaal de eucentrische hoogte voor de podiumpositie met behulp van α-wobbler bij ± 15° podiumkanteling. Pas de Z-hoogte aan om het podium op eucentrische hoogte te brengen met behulp van het toetsenbordpaneel voor de microscoop. Zorg ervoor dat de beeldverschuiving minimaal is tijdens de α-wiebelroutine. OPMERKING: Als de eucentrische hoogte niet goed wordt geïdentificeerd, wordt een grote beeldverschuiving waargenomen bij het kantelen van het podium bij de vierkante vergroting. Dit kan ook gebeuren als er lokale vervormingen op het raster zijn, bijvoorbeeld als het raster in de buurt van het afgebeelde gebied is gebroken of ernstig is gebogen. Hoewel het het beste is om dergelijke regio's voor gegevensverzameling te vermijden, is het noodzakelijk om de eucentrische hoogte nauwkeurig te schatten als deze een van de weinige veelbelovende regio's voor gegevensverzameling vertegenwoordigen. Figuur 3 laat zien hoe targeting zonder de eucentrische hoogte goed te identificeren grote beeldverschuivingen in de vierkante vergroting kan veroorzaken.</li>
	<li>Zoek een nauwkeurigere Z-hoogte, gebruik het focuserknooppunt en druk op Simuleren.<ol><li>Schat doorgaans de Z-hoogte in het Focuser-knooppunt bij de vergroting die wordt gebruikt in Square Acquisition Node. OPMERKING: De focusvolgorde van het Focuser-knooppunt kan ook een fijne Z-focusschatting bevatten bij de Hole Acquisition-knoop (een hulpmiddel in Leginon-software) vergroting tijdens het verzamelen van gegevens.</li>
		<li>Pas de instellingen voor het Focuser-knooppunt aan en schakel de fijne Z-focusoptie in of uit tijdens de eerste wachtrij van vierkanten. OPMERKING: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de eucentrische hoogte nauwkeurig wordt geïdentificeerd wanneer geautomatiseerde gegevensverzameling begint, waardoor mogelijk opnieuw fijne Z-focus moet worden ingeschakeld (stap 2.10).</li>
	</ol></li>
	<li>Kantel de monstertrap naar de gewenste kantelhoek voor gegevensverzameling op de ware eucentrische hoogte en centreer het podium indien nodig opnieuw. Voor dit onderzoek werden hellingshoeken van 0°, 30° en 60° gebruikt. Druk op Simuleren in het knooppunt Square Acquisition om te beginnen met het in de rij plaatsen van doelen voor blootstellingen van hole acquisition-knooppunten . OPMERKING: Zoals aangegeven in stap 2.2.1, kan de rasteratlas worden opgenomen met behulp van een vooraf gedefinieerde fasekanteling, waardoor het niet nodig is om het podium bij deze stap opnieuw te kantelen. Dit werkt goed en versnelt het proces als de kantelhoek die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens vooraf is gedefinieerd. Het huidige protocol is geschreven met nieuwe exemplaren in gedachten, waarbij de gebruiker mogelijk verschillende kantelhoeken wil testen voor gegevensverzameling.</li>
	<li>Selecteer een Z-focusdoel en gebieden met gaten die geschikt zijn voor hoge vergrotingsbelichtingen.</li>
	<li>Druk op Doelen indienen om in de wachtrij te staan voor beeldvorming. Druk niet op Doelen in wachtrij verzenden totdat u klaar bent met het in de rij zetten van alle vakjes.</li>
	<li>Breng het stadium van het monster terug naar de niet-gekantelde staat. Ga naar het volgende vierkant en herhaal stap 2.3-2.8 totdat een voldoende aantal gatblootstellingen in de wachtrij is geplaatst.</li>
	<li>Ga naar het knooppunt Hole Targeting en druk op Submit Queued Targets zodra alle vakjes in de wachtrij staan. OPMERKING: Als fijne Z-focus eerder is uitgeschakeld om tijd te besparen (stap 2.5), moet deze opnieuw worden ingeschakeld voordat de wachtrij wordt verzonden.</li>
	<li>Inspecteer handmatig doelen die zijn geselecteerd door het knooppunt Belichting acquisitie met hoge vergroting om te testen of de geautomatiseerde EM-gatzoeker nauwkeurig geschikte gebieden voor beeldacquisitie kan identificeren wanneer de monsterfase wordt gekanteld.<ol><li>Selecteer tijdens deze procedure 'Gebruikersverificatie van geselecteerde doelen toestaan' in de knooppuntinstellingen voor blootstellingsacquisitie . Zodra de gebruiker tevreden is met de nauwkeurigheid van de targeting, schakelt u deze optie uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling. OPMERKING: Doelen in het knooppunt Belichtingsacquisitie met hoge vergroting worden meestal afgebeeld met behulp van een beam-tilt beeldverschuivingsstrategie, die even goed werkt voor zowel gekantelde als niet-gekantelde gegevensverzameling23,24,25,26. Voor een nauwkeurige CTF-schatting in downstream gegevensverwerkingsstappen moet de lens-coma aberratiekalibratie worden uitgevoerd voor de bundel-kantel beeldverschuivingsstrategie voor gegevensverzameling.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Gegevensverwerking
<ol><li>Start on-the-fly gegevensverwerking 10,27,28,29 met bewegingscorrectie van opgenomen films, CTF-schatting, deeltjesselectie en generatie van initiële reconstructies tijdens gegevensverzameling. OPMERKING: Voor deze studie is cryoSPARC Live10 (zie materiaaltabel) gebruikt voor voorbewerking. On-the-fly gegevensverwerking biedt een eerste cryo-EM-reconstructie en een benadering voor de hoekverdeling, die de gebruiker kan informeren over de mate van resolutie-anisotropie. Deze kunnen op hun beurt worden gebruikt om de gebruiker te begeleiden of de kantelhoek die wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens voldoende hoog is.</li>
	<li>Visualiseer de gereconstrueerde kaart en plot de Euler-hoekverdeling om de mate van voorkeursdeeltjesoriëntaties te meten. OPMERKING: De Euler-hoekverdelingen kunnen direct worden omgezet in Fourier-ruimtebemonsteringsverdelingen om de potentiële mate van resolutie-anisotropie te bepalen. Een grafische gebruikersinterface (GUI) is ontwikkeld om de gebruiker te helpen bij het evalueren van de kwaliteit van een Euler-hoekverdeling en het bepalen van een optimale kantelhoek30,31. De tool kan worden verkregen uit de Github-repository, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.</li>
	<li>Pas indien nodig de kantelhoek van het podium aan waarbij gegevens worden verzameld om de effecten van voorkeursoriëntatie te ondervangen. De hoek kan worden vergroot als de voorkeursoriëntatie een probleem blijft, zoals blijkt uit de kaart en de Euler-verdeling in 3.2. Als alternatief kan de gebruiker de gegevensverzameling in groepen splitsen en opnemen met behulp van verschillende kantelhoeken, zoals 20 °, 30 ° en 40 °. OPMERKING: Hoewel de meeste TEM's de mogelijkheid moeten hebben om het podium tot 70 ° te kantelen, variëren de gebruikelijke kantelingen van het monsterstadium (die we hebben gebruikt) van 20 ° -40 °.</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cheaper%3A+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li>
<li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li>
<li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257(2018).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>NYSBC.org Homepage. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li>
<li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoEM+at+100+keV%3A+a+demonstration+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li>
<li>Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerzik%2C+MA+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).</li>
<li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li>
<li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li>
<li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957(1957).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Structura Biotechnology Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li>
<li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li>
<li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiyer%2C+S+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).</li>
<li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocus-dependent+Thon-ring+fading%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De voorkeursoriëntatie van deeltjes veroorzaakt door de hechting van het monster aan de lucht-waterinterface is een van de laatste grote knelpunten voor routinematige structuurbepaling met hoge resolutie met behulp van cryo-EM SPA 4,5,6. Het hier gepresenteerde schema voor gegevensverzameling biedt een eenvoudig te implementeren strategie voor het verbeteren van de oriëntatieverdeling van deeltjes binnen een dataset. We merken o...

De komst van directe elektronendetectoren in het afgelopen decennium 1,2,3 heeft geleid tot een exponentiële toename van het aantal hoge-resolutiestructuren van macromoleculen en macromoleculaire assemblages opgelost met behulp van cryo-EM 4,5,6 met één deeltje. Bijna alle gezuiverde macromoleculaire soorten zijn naar verwachting vatbaar voor structuurbepaling met behulp van cryo-EM, behalve de kleinste eiwitten ~ 10 kDa in grootte of lager dan7. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die nodig is voor rastervoorbereiding en structuurbepaling is ten minste een orde van grootte kleiner dan andere structuurbepalingstechnieken, zoals kernspinresonantiespectroscopie en röntgenkristallografie 4,5,6.
Een belangrijke uitdaging voor structuurbepaling door cryo-EM is echter een geschikte rastervoorbereiding voor beeldvorming. Een uitgebreide studie die diverse monsters evalueerde met behulp van verschillende vitrificatiestrategieën en -roosters suggereerde dat de meeste benaderingen voor het verglazen van monsters op cryo-EM-roosters leiden tot preferentiële hechting van macromoleculen aan de lucht-waterinterface8. Een dergelijke hechting kan mogelijk vier suboptimale uitkomsten veroorzaken: (1) het macromoleculaire monster denatureert volledig, in welk geval geen succesvolle gegevensverzameling en -verwerking mogelijk is; (2) het monster denatureert gedeeltelijk, in welk geval het mogelijk kan zijn om structurele inzichten te verkrijgen uit gebieden van het macromolecuul die niet zijn beschadigd; (3) het monster behoudt de oorspronkelijke structuur, maar slechts één reeks deeltjesoriëntaties ten opzichte van de richting van de elektronenbundel wordt in de afbeeldingen weergegeven; (4) Het monster behoudt de oorspronkelijke structuur en sommige, maar niet alle mogelijke deeltjesoriëntaties ten opzichte van de richting van de elektronenbundel worden weergegeven in de afbeeldingen. Voor gevallen (3) en (4) zal gekantelde gegevensverzameling helpen bij het minimaliseren van directionele resolutie-anisotropie die de gereconstrueerde cryo-EM-kaart beïnvloedt en biedt een generaliseerbare oplossing voor een breed scala aan monsters9. Technisch gezien kan kantelen ook het geval (2) ten goede komen, omdat de denaturatie vermoedelijk plaatsvindt op het lucht-water-grensvlak en op dezelfde manier het aantal verschillende oriëntaties beperkt dat in de gegevens wordt weergegeven. De mate van oriëntatiebias in de dataset kan mogelijk worden gewijzigd door te experimenteren met oplossingsadditieven, maar een gebrek aan brede toepasbaarheid belemmert deze trial-and-error-benaderingen. Het kantelen van de monstertrap onder een enkele geoptimaliseerde kantelhoek is voldoende om de verdeling van oriëntaties te verbeteren door de geometrie van het beeldvormingsexperiment9 te wijzigen (figuur 1). Vanwege de geometrische configuratie van het bij voorkeur georiënteerde monster ten opzichte van de elektronenbundel, genereert het kantelen van het raster voor elk cluster van voorkeursoriëntaties een kegel van verlichtingshoeken ten opzichte van het clustercentroïde. Dit spreidt de weergaven dus en verbetert bijgevolg fourierruimtebemonstering en de isotropie van directionele resolutie.
Er kleven in de praktijk wel wat nadelen aan het kantelen van het podium. Het kantelen van de monsterfase introduceert een focusverloop over het gezichtsveld, wat van invloed kan zijn op de nauwkeurigheid van CTF-schattingen (Contrast Transfer Function). Gekantelde gegevensverzameling kan ook leiden tot een verhoogde door de bundel geïnduceerde deeltjesbeweging veroorzaakt door verhoogde ladingseffecten bij het in beeld brengen van gekantelde monsters. Rasterkanteling leidt ook tot een toename van de schijnbare ijsdikte, wat op zijn beurt leidt tot luidruchtigere micrografieën en uiteindelijk de resolutie van reconstructies kan beïnvloeden 5,9,10. Het is mogelijk om deze problemen op te lossen door geavanceerde computationele gegevensverwerkingsschema's toe te passen die kort worden beschreven in de protocol- en discussiesecties. Ten slotte kan kantelen leiden tot een grotere overlapping van deeltjes, waardoor de daaropvolgende beeldverwerkingspijplijn wordt belemmerd. Hoewel dit tot op zekere hoogte kan worden verzacht door de deeltjesconcentratie op het net te optimaliseren, is het toch een belangrijke overweging. Hier wordt een eenvoudig te implementeren protocol beschreven voor gekantelde gegevensverzameling met behulp van de Leginon-softwaresuite (een geautomatiseerde beeldacquisitiesoftware), beschikbaar open access en compatibel met een breed scala aan microscopen11,12,13,14. De methode vereist ten minste versie 3.0 of hoger, met versies 3.3 en hoger die speciale verbeteringen bevatten om gekantelde gegevensverzameling mogelijk te maken. Voor dit protocol is geen extra software of apparatuur nodig. Uitgebreide instructies over computationele infrastructuur en installatiehandleidingen zijn elders te vinden15.

<table><tbody><tr><td>Cryosparc Live v3.1.0+210216</td><td>Structura Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPS-eiwit</td><td></td><td></td><td>Zuivering aangepast van het protocol beschreven in K. Naydenova et al IUCrJ. 2019 nov 1; 6(Pt 6): 1086&ndash;1098.</td></tr><tr><td>K2 Summit Direct Electron Detector</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leginon software suite</td><td></td><td></td><td>C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.</td></tr><tr><td>Handmatig dompelapparaat</td><td></td><td></td><td>Zelfgemaakte guillotine-achtige inrichting voor vitrificatie van EM-rasters</td></tr><tr><td>Talos Arctica</td><td>FEI/Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh rasters</td><td>Quantifoil</td><td>N1-A14nAu30-01</td><td></td></tr></tbody></table>

single-particle cryo-em data collection met stage tilt met leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-particle analysis (SPA) door cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is nu een mainstream techniek voor hoge resolutie structurele biologie. Structuurbepaling door SPA is gebaseerd op het verkrijgen van meerdere verschillende weergaven van een macromoleculair object dat verglaasd is in een dunne laag ijs. Idealiter zou een verzameling van uniform verdeelde willekeurige projectieoriëntaties neerkomen op alle mogelijke weergaven van het object, wat aanleiding geeft tot reconstructies die worden gekenmerkt door isotrope directionele resolutie. In werkelijkheid hebben veel monsters echter last van bij voorkeur georiënteerde deeltjes die zich hechten aan het lucht-water-grensvlak. Dit leidt tot niet-uniforme hoekoriëntatieverdelingen in de dataset en inhomogene Fourier-ruimtebemonstering in de reconstructie, wat zich vertaalt in kaarten die worden gekenmerkt door anisotrope resolutie. Het kantelen van de monsterfase biedt een generaliseerbare oplossing voor het overwinnen van resolutie-anisotropie door het verbeteren van de uniformiteit van oriëntatieverdelingen, en dus de isotropie van Fourier-ruimtebemonstering. Het huidige protocol beschrijft een gekantelde geautomatiseerde gegevensverzamelingsstrategie met behulp van Leginon, een software voor geautomatiseerde beeldacquisitie. De procedure is eenvoudig te implementeren, vereist geen extra apparatuur of software en is compatibel met de meeste standaard transmissie-elektronenmicroscopen (TEM's) die worden gebruikt voor het afbeelden van biologische macromoleculen.

DPS bij 0,3 mg/ml werd gebruikt om beeldvorming bij 0°, 30° en 60° kanteling te demonstreren. Gegevens van verschillende kantelhoeken werden verzameld op hetzelfde raster in verschillende rastergebieden. CTF-resolutie past bij hogere hoekkantelingen zijn meestal slechter, zoals het geval was bij het vergelijken van de drie datasets in deze studie. Figuur 4 toont vergelijkende representatieve beelden en 2D-classificatiegemiddelden. Hoewel de eiwitconcentratie onveranderd is over de verschille...

Het huidige protocol beschrijft een gegeneraliseerd en eenvoudig te implementeren schema voor het verzamelen van gekantelde gegevens met één deeltje in cryo-EM-experimenten. Een dergelijke procedure is vooral nuttig voor het verkrijgen van een hoogwaardige EM-kaart voor monsters die lijden aan preferentiële oriëntatiebias als gevolg van de naleving van de lucht-waterinterface.

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Het kantelen van het monsterstadium biedt een eenvoudige en generaliseerbare manier om de oriëntatieverdeling van deeltjes tijdens cryo-EM-gegevensverzameling met één deeltje te vergroten. De uniforme verdeling van deeltjes die wordt verkregen als gevolg van het kantelen van het monsterstadium maakt de algehele kaartkwaliteit en interpreteerbaarheid mogelijk. Begin met het uitlijnen van de microscoop om parallelle verlichting van het monster te garanderen en coma-aberraties te minimaliseren.Om de vierkanten te identificeren die geschikt zijn voor gegevensverzameling, neemt u een rasteratlas op zonder podiumkanteling of met podiumkanteling, die een overzicht geeft van de algehele rasterkwaliteit en een eerste indicatie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling. Inspecteer de vierkanten handmatig bij de vergroting die wordt gebruikt in het vierkante acquisitieknooppunt. Zoek naar de vierkanten waar de folie intact is, er niet uitgedroogd uitziet en een ideale ijsdikte heeft, en verplaats het monsterstadium naar een vierkant van belang.Bepaal de eucentrische hoogte voor de podiumpositie met behulp van een alfa-wiebelaar op ongeveer 15 graden podiumkanteling en pas de Z-hoogte aan om het podium op eucentrische hoogte te brengen met behulp van het toetsenbordpaneel voor de microscoop. Zorg ervoor dat de beeldverschuiving minimaal is tijdens de alfa-wiebelroutine. Om een nauwkeurigere Z-hoogte te vinden, schat u deze in de focuserknoop op de vergroting die wordt gebruikt in de vierkante acquisitieknoop.Pas de instellingen voor het focuserknooppunt aan en schakel de fijne Z-focusoptie in of uit tijdens de eerste wachtrij van vierkanten. Druk vervolgens op Simuleren. Kantel de monstertrap naar de gewenste kantelhoek voor gegevensverzameling op de ware eucentrische hoogte en plaats het podium indien nodig opnieuw.Druk op Simuleren in het vierkante acquisitieknooppunt om te beginnen met het in de rij plaatsen van doelen voor blootstellingen aan hele acquisitieknooppunten. Selecteer vervolgens een Z-focusdoel en gebieden met gaten die geschikt zijn voor hoge vergrotingsbelichtingen en dien de doelen in de wachtrij in voor beeldvorming. Breng het monsterstadium terug naar de niet-gekantelde toestand en ga vervolgens naar het volgende vierkant.Herhaal deze stappen totdat een voldoende aantal volledige blootstellingen in de wachtrij is geplaatst. Zodra alle vakjes in de wachtrij staan, gaat u naar het hele targetingknooppunt en drukt u op Doelen in wachtrij verzenden. Selecteer Toestaan voor gebruikersverificatie van geselecteerde doelen in knooppuntinstellingen en inspecteer handmatig de doelen die zijn geselecteerd door het acquisitieknooppunt met hoge vergrotingsbelichting om te testen of de geautomatiseerde EM-gatzoeker nauwkeurig de geschikte gebieden voor beeldacquisitie kan identificeren wanneer de monsterfase wordt gekanteld.Zodra de gebruiker tevreden is met de nauwkeurigheid van de targeting, schakelt u de optie Gebruikersverificatie van geselecteerde doelen toestaan uit voor geautomatiseerde gegevensverzameling. De representatieve beelden van het raster bij vierkante vergroting met verschillende kantelhoeken verzameld dichtbij en ver van de eucentrische Z-hoogte worden hier getoond. Het midden van de balk wordt aangegeven door het midden van de rode concentrische ringen en de groene pijl geeft het vierkant van belang aan.Er is een gebroken rasterfunctie naast het vierkant van belang ter referentie. Hier worden de representatieve gatbelichtingen en 2D-klassegemiddelden verzameld bij 0 graden, 30 graden en 60 graden kantelhoeken. Hoewel de eiwitconcentratie onveranderd is over de verschillende kantelhoeken, zorgt een hogere kantelhoek ervoor dat het afgebeelde gebied drukker lijkt in termen van deeltjesconcentratie.2D-klassegemiddelden die worden beïnvloed door overbevolking worden weergegeven in dit rode vak. De eenvoud van het protocol stelt elke standaardgebruiker van de microscoop in staat om eenvoudig een gekantelde strategie voor gegevensverzameling aan te passen.

single-particle-cryo-em-data-collection-with-stage-tilt-using-leginon

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

Dit protocol demonstreert hoe biologische cryo-geconserveerde monsters kunnen worden afgebeeld met behulp van cryo-gestructureerde verlichtingsmicroscopie. We demonstreren de methodologie door het cytoskelet van U2OS-cellen in beeld te brengen.

Cryo-gestructureerde verlichting Microscopische gegevensverzameling van cryogene geconserveerde cellen

De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.

Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje vereist een geschikt softwarepakket en een gebruiksvriendelijke pijplijn voor automatische data-acquisitie met hoge doorvoer. Hier presenteren we de toepassing van een volledig geautomatiseerd softwarepakket voor beeldacquisitie, Latitude-S, en een praktische pijplijn voor het verzamelen van gegevens van verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.

Gebruiksvriendelijke, high-throughput en volledig geautomatiseerde data-acquisitie software voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje

Cryo-EM-kaarten met hoge resolutie van macromoleculen kunnen ook worden bereikt met behulp van 200 kV TEM-microscopen. Dit protocol toont de best practices voor het instellen van nauwkeurige optische uitlijningen, data-acquisitieschema's en selectie van beeldvormingsgebieden die allemaal essentieel zijn voor het succesvol verzamelen van datasets met hoge resolutie met behulp van een 200 kV TEM.

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.

Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling

Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) multi-grid screening is vaak een vervelend proces dat uren aandacht vraagt. Dit protocol laat zien hoe je een standaard Leginon collectie instelt en Smart Leginon Autoscreen om dit proces te automatiseren. Dit protocol kan worden toegepast op de meeste cryoEM holleyfolieroosters.

Cryo-elektronenmicroscopie screening Automatisering over meerdere netten met behulp van Smart Leginon

Dit protocol standaardiseert cryo-elektrontomografie (cryo-ET) voor dik weefsel door hogedrukbevriezing (HPF) te integreren met de wafelmethode, cryogene focus ion beam (cryo-FIB) lift-out en dosissymmetrische, parallelle acquisitie, waardoor uniform dunne lamellen en gevitrificeerde monsters worden opgeleverd voor reproduceerbare in situ-analyse in de hippocampus van de muis.

Cryo-elektrontomografie workflow voor dik weefsel aangetoond bij de muishippocampus

Leer een methode voor single-particle cryo-EM dataverzameling met stage tilt om de oriëntatieverdeling van deeltjes te verbeteren. Deze aanpak vermindert oriëntatiebias en verhoogt de kwaliteit van EM-maps aanzienlijk.

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Meer video's verkennen