Визуализация стареющей улитки с помощью флуоресцентной микроскопии со световым листом

Мы разработали световой микроскоп, который может оцифровывать всю улитку. Этот микроскоп оснащен воздушными объективами с большим рабочим расстоянием, которые могут отображать маленькие улитки мыши вплоть до большой височной кости человека. Он последовательно разрезает улитку лазерным лучом, не вызывая никаких механических разрушений.

Наш метод визуализации может быть использован для оценки патологических изменений в улитке, таких как потеря волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов из-за старения. После эвтаназии и обезглавливания мыши сделайте дорсально-вентральный разрез через мозг, чтобы гемисекция черепа. Удалите мозг и определите круглую буллу в базовентральной части черепа.

Откройте буллу ронгерами. Затем визуализируйте и удалите улитку. Под диссекционным микроскопом при пятикратном увеличении проколите овальное окошко и удалите стремечко острым медиатором.

Затем вставьте кирку в круглое окно, чтобы проколоть мембрану. Чтобы выполнить фиксацию, закройте открытое круглое окно срезанным кончиком инфузионного набора, который прикреплен к одномиллилитровому шприцу, наполненному двумя миллилитрами формалина. Медленно вводите формалин через перилимфатические пространства улитки в течение двух минут, следя за тем, чтобы формалин выходил из улитки через открытое овальное окно.

Обрежьте лишнюю ткань с улитки. Погрузите его в бутылку, содержащую 10% формалина, и поместите на ротатор на ночь. Для удаления накипи промывайте улитку в PBS трижды по пять минут каждая.

Погрузите во флакон, содержащий 10% раствор ЭДТА. Инкубируют его в течение четырех дней по очереди, ежедневно меняя раствор. Затем трижды перфузируйте улитку PBS и погрузите на 15 минут между заменами, чтобы удалить всю ЭДТА.

После промывки обезвоживайте улитку с возрастающими концентрациями этанола в течение 30 минут в каждой концентрации. Окрашивают всю улитку, погружая в раствор родамина В на ночь с вращением. Удалите излишки красителя из улитки двумя сменами 100% этанола с инкубацией в течение пяти минут для каждой смены.

Переведите окрашенную улитку в две смены раствора Шпальтехольца на 30 минут в каждую смену. Оставьте на ночь в очищающем растворе с чередованием. Прикрепите улитку к стержню образца на овальном и круглом конце оконной мембраны.

Следите за тем, чтобы очищающий раствор оставался внутри улитки и не образовывались пузырьки. Прикрепите овальный и круглый концы окна влажной улитки к стержню сухого образца с помощью УФ-активирующего клея. Отверждайте УФ-клей в течение 10 секунд, перемещая по улитке ультрафиолетовым светом.

Суспендируйте улитку в камеру визуализации в оптически прозрачной кварцевой флуорометрической ячейке, заполненной раствором Шпальтехольца, со стержнем образца, прикрепленным к вращающемуся держателю, который также прикреплен к ступени трансляции X / Z. Затем используйте специально разработанную программу, чтобы переместить образец через световой лист с шагом X и Z и сделать стопку 2D-изображений по всей улитке. Чтобы обработать изображение, перенесите стек изображений на другой компьютер и загрузите его в программу 3D-рендеринга для 3D-реконструкции и количественной оценки.

Прямая объемная визуализация улитки мыши показала овальные и круглые окна, кортиевый орган с волосковыми клетками, канал Розенталя был сегментирован и объемно визуализирован, а также показал спиральные ганглиозные нейроны, или SGN, по всей его длине. Используя TSLIM, улитка трехмесячной молодой мыши и 23-месячной мыши была изображена и подсчитана на SGN. Количество клеток SGN в зависимости от расстояния до канала Розенталя, изображенного на линейном графике, показало большее количество SGN у молодого животного в середине и апикальных концах улитки по сравнению со старым животным.

Эта очевидная потеря SGN была визуализирована с помощью программного обеспечения для кластерного анализа и 3D-рендеринга. Различия в плотности SGN были изображены на цветовой шкале, где кластеры высокой плотности желтые, а синий представляет области с более низкой плотностью. Кластерный анализ четко изобразил области с более низкой плотностью клеток по всей длине канала Розенталя.

Световая микроскопия предназначена для получения хорошо выровненного стека изображений, из которых можно создавать объемные 3D-визуализации структур. Программы 3D-рендеринга позволяют количественно оценивать структуры и анатомические отношения между различными структурами. Однако, поскольку программы 3D-рендеринга предлагают множество различных пользовательских параметров, для эффективного использования этих программ требуется значительное обучение.