Name: Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez un protocole rapide d'isolement de plastoglobules à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries. Cette méthode utilise l'ultracentrifugation et les gradients de saccharose pour des analyses biochimiques précises.

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La recherche dans le groupe de laboratoire Lundquist est soutenue par des subventions de la NSF (MCB-2034631) et de l’USDA (MICL08607) à P.K.L. Les auteurs remercient la Dre Carrie Hiser (MSU) pour son soutien dans le développement de la méthode d’isolement des plastoglobules cyanobactériens.

1. Isolement brut de plastoglobules
<ol><li>Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires de maïs non stressés<ol><li>Acquérir six plants de maïs sains âgés d’environ 3 semaines et presque au stade de croissance V5, pesant environ 120 g.</li>
		<li>Coupez toutes les feuilles à la base de la tige, plongez-les rapidement dans un bain de glace et transportez-les dans la chambre froide.</li>
		<li>En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.</li>
		<li>Broyer délicatement mais soigneusement la moitié du tissu foliaire coupé dans un mélangeur commercial dans 350 ml de tampon de broyage (tableau 1). Démarrez-arrêtez le mélangeur 5x-6x pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. N’utilisez pas de niveau supérieur au niveau 7 sur le mélangeur.</li>
		<li>Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu de nylon de 25 μm sur un grand entonnoir dans quatre bouteilles centrifugeuses de 250 mL. Ensuite, répétez l’étape 1.1.4 avec la seconde moitié du tissu foliaire coupé.</li>
		<li>Répartir uniformément le filtrat entre les quatre flacons et centrifuger pendant 6 min à 1 840 x g à 4 °C. Prélever une partie aliquote du filtrat de feuilles et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille.</li>
		<li>Verser le surnageant résultant et remettre doucement en suspension la pastille dans 12 mL de milieu R 0,2 contenant 0,2 M de saccharose (tableau 1) en remuant et en remettant en suspension avec de doux mouvements de la brosse. Après avoir remis chaque pastille en suspension, portez la suspension sur le flacon suivant et répétez la remise en suspension. Regroupez les suspensions dans une seule bouteille.</li>
		<li>Répartir la suspension groupée entre six tubes à ultracentrifugeuses de 3 mL, en atteignant un volume maximal de 2,5 mL dans chaque tube.</li>
		<li>Soniquer chaque tube 4x, pendant 10 s à chaque fois, en utilisant un sonicateur à pointe à une amplitude de 100%. Veillez à garder la corne du sonicateur immergée et éloignée de la surface du liquide pour éviter la mousse.</li>
		<li>Déplacez lentement la corne du sonicateur de haut en bas dans la suspension pendant chaque tour. Alternez entre les quatre tubes, en retournant chaque tube dans un seau à glace après chaque sonication pour permettre à l’échantillon de refroidir.</li>
		<li>Centrifuger la suspension de thylakoïdes bruts soniqués à 150 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Récolter le tampon flottant résultant de plastoglobules bruts à la surface du coussin de saccharose (facilement considéré comme un tampon jaune huileux) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G en écumant la surface du coussin avec l’ouverture de l’aiguille, récupérant environ 500 μL de chaque tube. Déposer dans un tube de 2,0 mL.</li>
		<li>Recueillir des aliquotes du thylakoïde brut avant et après la sonication et la libération de plastoglobules. Passez à l’étape 2.1. Vous pouvez également conserver les plastoglobules bruts à −80 °C et les purifier ultérieurement.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraction brute de plastoglobule à partir de tissus foliaires d’E. nindensis desséchés<ol><li>Acquérir un pot (composé de trois plantes individuelles par pot) d’E. nindensis , âgé de 8 à 9 semaines (près de 40 g de tissu) entièrement desséché.</li>
		<li>Coupez tout le tissu foliaire de la base de la plante, juste au-dessus du sol, à l’aide de ciseaux et trempez immédiatement le tissu dans un bain de glace. Transportez le mouchoir en papier dans la chambre froide.</li>
		<li>En travaillant sous une lampe de sécurité verte, coupez le E. Les feuilles de Nindensis sont en morceaux plus petits (environ 5 cm x 5 cm) à l’aide de ciseaux.</li>
		<li>Broyer doucement mais soigneusement les feuilles avec 100 ml de tampon de broyage (tableau 1) dans un mélangeur commercial. Démarrez-arrêtez le mélangeur plusieurs fois pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. N’utilisez pas de niveau supérieur au niveau 7 sur le mélangeur.</li>
		<li>Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu de nylon de 25 μm sur un grand entonnoir dans une fiole conique de 250 mL. Prélever une partie aliquote du filtrat de feuilles et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille.</li>
		<li>Ajouter la quantité appropriée de saccharose pour porter à une concentration finale de 0,5 M et répartir la solution dans des tubes à centrifuger de 250 mL. NOTE: Une concentration plus élevée de saccharose par rapport à la préparation de Z. mays est utilisée pour assurer la flottation des gouttelettes lipidiques cytosoliques avant la sonication / libération ultérieure des plastoglobules liés aux thylakoïdes.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 45 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Un mélange de plastoglobules et de gouttelettes lipidiques cytosoliques sera facilement vu comme un tampon jaune huileux sur ou près de la surface du coussin de saccharose (Figure 1B). Recueillir le matériau flottant à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22 G en écumant la surface du coussin avec l’ouverture de l’aiguille, et déposer dans un tube.</li>
		<li>Jeter le surnageant restant après avoir recueilli le mélange de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant librement.</li>
		<li>Pour isoler les plastoglobules reliés au thylakoïde résiduel, remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu R 0,2 en remuant et en la remettant en suspension avec de doux mouvements de la brosse. Regroupez les suspensions dans une seule bouteille. Passez à l’étape 1.1.8.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraction brute de plastoglobules à partir de cyanobactéries<ol><li>Cultiver une culture de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 jusqu’à la phase stationnaire (environ 7-10 jours) et ajuster la densité cellulaire à une DO750 de 2,0 à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour les conditions de culture, utiliser un milieu BG-11 et cultiver dans un incubateur à une intensité lumineuse de 150 μmol photons/m 2/s, 2% de CO2, 32 °C et avec agitation continue à 150 tr/min.</li>
		<li>Pour éliminer les polysaccharides, laver les cellules en centrifugeant la culture de 50 mL à 6 000 x g pendant 45 minutes à 4 °C, puis en retirant le surnageant. Continuez en lavant les cellules deux fois dans 50 mL de tampon A (tableau 1). Retirer une partie aliquote de l’homogénat cellulaire et la mettre de côté avant la centrifugation pour qu’elle soit stockée en tant qu’échantillon cellulaire total représentatif</li>
		<li>Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 ml de tampon A et cassez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française à 1 100 psi, en répétant le processus 3x (mettez l’échantillon sur de la glace entre chaque cycle pour éviter la dénaturation des protéines) jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge-bleu-vert sous lumière blanche. Utilisez une cellule pré-refroidie et effectuez cette étape dans la chambre froide.</li>
		<li>Répartir l’homogénat résultant entre huit tubes à ultracentrifugeuses de 3 mL remplis jusqu’à un maximum de 2,5 mL dans chaque tube, puis recouvrir soigneusement de 400 μL de milieu R, produisant un gradient progressif. NOTA : Voir Yang, et al. et Kelekar, et al. pour des descriptions détaillées de la préparation du gradient de saccharose25,26.</li>
		<li>Équilibrer soigneusement les tubes en ajoutant un milieu R supplémentaire, si nécessaire, et centrifuger pendant 30 min à 150 000 x g à 4 °C. Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds (y compris les corps polyhydroxyalcanoates) granulent, tandis que les plastoglobules seront facilement vus comme un tampon jaune huileux sur ou près du sommet du gradient de saccharose (Figure 1C).</li>
		<li>Récolter le tampon flottant résultant de plastoglobules bruts avec une seringue et une aiguille 22G et déposer dans un tube de 2 mL. Grattez les plastoglobules du côté de la paroi du tube ultracentrifuge avec l’extrémité de l’aiguille si nécessaire.</li>
		<li>Passez à l’étape 2.2. Vous pouvez également conserver les plastoglobules bruts à -80 °C et les purifier plus tard.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Récolte de plastoglobules purs
<ol><li>Traitement des tissus végétaux<ol><li>Produire des gradients de saccharose dans des tubes à ultracentrifugeuses de 2,5 mL en superposant d’abord 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1.1 ou 1.2 mélangés à 500 μL de milieu R 0,7, pour porter à un volume total de 1 mL, puis superposer avec 400 μL de milieu R 0,2, puis superposer avec 400 μL de milieu R. NOTA : Voir Yang et coll. et Kelekar et coll. pour une description détaillée de la préparation du gradient de saccharose25,26.</li>
		<li>Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant l’excès de milieu R à la couche supérieure, si nécessaire. Puis centrifuger à 150 000 x g pendant 1,5 h à 4 °C.</li>
		<li>Prélever le tampon flottant de plastoglobules purs (figure 1A) obtenu à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 22G et le déposer dans un tube de 2 mL. Grattez les plastoglobules du haut de la paroi du tube de centrifugation avec l’extrémité de l’aiguille si nécessaire.</li>
		<li>Aliquote les plastoglobules purs et la congélation flash dans l’azote liquide. Conserver directement à -80 °C ou lyophiliser en poudre sèche.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement des cyanobactéries<ol><li>Produire un gradient de saccharose dans quatre tubes ultracentrifuges de 2,5 mL superposés d’abord avec 500 μL de plastoglobules bruts de l’étape 1,3 mélangés à 750 μL de milieu R 0,7, puis superposés avec 750 μL de milieu R 0,2. NOTA : Voir Yang et coll. et Kelekar et coll. pour une description détaillée de la préparation du gradient de saccharose25,26.</li>
		<li>Centrifuger le gradient de saccharose à 150 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Prélever les plastoglobules purs (figure 1C) à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 22 G dans la phase supérieure du gradient de saccharose et transférer dans un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Aliquote les plastoglobules purs et surgélation instantanée dans de l’azote liquide. Conserver directement à −80 °C ou lyophiliser en poudre sèche.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Pour minimiser les changements physiologiques / biochimiques du matériau et protéger certains pigments prényl-lipidiques photo- et thermo-labiles qui sont un composant riche des plastoglobules, il est essentiel d’effectuer l’isolement à 4 ° C et à l’abri de la lumière. Comme indiqué ci-dessus, les étapes initiales sont effectuées en chambre froide sous une lampe de sécurité à l’aide d’une ampoule à émission verte. Les étapes suivantes effectuées en laboratoire sont sous des lumières tamisées et utilisent de la glace ou u...

La compréhension actuelle de la composition et de la fonction des plastoglobules a émergé grâce à des études protéomiques et lipidomiques détaillées 1,2,3,4,5. De telles études ont été grandement facilitées par une méthode d’isolement rapide et efficace qui repose sur leur très faible densité pour une séparation efficace à l’aide de gradients de saccharose. Les méthodes initiales d’isolement des plastoglobules ont été réalisées à partir d’espèces telles que le hêtre (Fagus sylvatica), le genêt à balais (Sarothamnus scoparius), l’oignon (Allium cepa), les épinards (Spinacia oleracea), la pensée (Viola tricolor), le poivre (Capsicum annuum) et le pois (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Une méthode mise à jour pour isoler les plastoglobules chloroplastiques d’une manière plus efficace et plus efficace a été présentée plus tard par Ytterberg et coll.3,14. Alors qu’initialement utilisé pour l’étude des plastoglobules des chloroplastes des feuilles d’Arabidopsis thaliana, nous avons utilisé avec succès cette méthode mise à jour pour les tissus foliaires sains d’autres espèces végétales, à la fois monocotylédones et dicotylédones, y compris le maïs (Zea mays), la tomate (Solanum lycopersicum), l’herbe d’amour (Eragrostis nindensis), le faux brome pourpre (Brachypodium distachyon) et le tabac sauvage (Nicotiana benthamiana ; résultats non publiés). De plus, la méthode d’isolement a été adaptée avec succès aux plastoglobules des cyanobactéries, y compris Synechocystis sp. PCC 6803 et Anabaena sp. PCC 712015, et au tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, E. nindensis.
Les plastoglobules chloroplastiques du tissu foliaire sain sont physiquement connectés aux membranes thylakoïdes16. Malgré cette continuité physique, les deux sous-compartiments chloroplastiques conservent des compositions lipidiques et protéiques distinctes, bien que l’échange régulé de lipides et de protéines entre les deux compartiments ait été proposé 2,4,17,18,19. En fait, un modèle d’hémifusion intéressant a récemment été proposé pour le trafic de lipides neutres entre les chloroplastes et le cytosol19. En raison de la continuité physique des plastoglobules et des thylakoïdes, la méthode d’isolement avec du tissu foliaire sain commence par la collecte d’une préparation de thylakoïdes bruts en granulés, qui est ensuite soniquée pour séparer les plastoglobules des thylakoïdes, contrairement aux méthodes utilisées pour isoler les gouttelettes lipidiques cytosoliques20 . L’ultracentrifugation sur un coussin de saccharose fait ensuite flotter les plastoglobules de faible densité à travers le saccharose, les séparant efficacement des thylakoïdes, des noyaux et d’autres matériaux à haute densité. En revanche, les plastoglobules dans les cyanobactéries, ainsi que ceux des tissus foliaires desséchés, existent évidemment in vivo sous une forme flottante librement. Par conséquent, leur isolement implique de flotter directement sur un gradient de saccharose. Cet article démontre la méthode d’isolement à partir de tissus foliaires sains et démontre en outre deux variantes qui peuvent être utilisées pour isoler des plastoglobules à partir de tissus foliaires desséchés ou de cultures de cyanobactéries, élargissant considérablement l’étendue physiologique et le contexte évolutif dans lequel les plastoglobules peuvent être étudiés.
Les plastoglobules isolés peuvent ensuite être utilisés pour un certain nombre d’analyses en aval afin d’étudier les caractéristiques moléculaires. Nous avons utilisé les plastoglobules isolés du tissu foliaire d’A. thaliana pour une analyse protéomique et lipidomique approfondie dans différentes conditions environnementales ou génotypes, démontrant la modification sélective de la composition protéique et lipidique en adaptation au stress 2,4,21,22. En outre, des essais in vitro kinases démontrant une activité de transphosphorylation associée à des plastoglobules isolés ont été effectués22, les états oligomères des composants protéiques ont été étudiés à l’aide de l’électrophorèse sur gel natif 21 et des tests de rasage de protéase ont été effectués23.
Le principal avantage de cette méthode est la vitesse relative de la procédure. D’après notre expérience, les protocoles décrits ci-dessous peuvent être entièrement complétés en environ 4 heures. Une autre méthode pour isoler les plastoglobules du tissu foliaire a été décrite, ce qui permet l’isolement simultané d’autres sous-compartiments chloroplastiques24. Cette méthode alternative offre des avantages évidents lorsque la comparaison quantitative avec les autres sous-compartiments chloroplastiques est nécessaire ou souhaitée. Cependant, cette méthode alternative est également plus fastidieuse et fournira un rendement significativement plus faible de plastoglobules isolés à partir de quantités comparables de tissu foliaire. Lorsqu’une étude ciblée des plastoglobules est l’objectif, la méthodologie décrite ici est le choix optimal. Néanmoins, des aliquotes totales de feuilles et de thylakoïdes bruts peuvent être recueillies pendant la préparation de l’échantillon, et il est fortement recommandé de le faire, afin de disposer d’échantillons de référence pour une comparaison ultérieure.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-Glycérophosphate. 2Na5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin</td><td>Albumine proliante biologique</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de pression française (modèle FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à secousses Multitron</td><td>Infors HT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ramidon.2 Na</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>Réduit Cysteine</td><td>MP Biochemicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-vanadate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td> Pyrophosphate de sodium &middot<td></td></tr><tr><td> ; 10H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W Ampoule fluorescente à tube Gro-Lux, 18"</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Waring (1,2 L)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>Mélangeur professionnel</td></tr><tr><td>Zea mays</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Les gouttelettes lipidiques de Plastoglobule sont un sous-compartiment dynamique des chloroplastes et des cyanobactéries des plantes. Présents partout parmi les espèces photosynthétiques, on pense qu’ils jouent un rôle central dans l’adaptation et le remodelage de la membrane thylakoïde dans des conditions environnementales en évolution rapide. La capacité d’isoler des plastoglobules de haute pureté a grandement facilité leur étude grâce à des méthodologies protéomiques, lipidomiques et autres. Avec des plastoglobules de grande pureté et de rendement, il est possible d’étudier leur composition lipidique et protéique, leur activité enzymatique et leur topologie protéique, entre autres caractéristiques moléculaires possibles. Cet article présente un protocole rapide et efficace pour l’isolement des plastoglobules à partir de chloroplastes de tissus foliaires végétaux et présente des variations méthodologiques pour l’isolement des plastoglobules et des structures de gouttelettes lipidiques apparentées à partir de feuilles de maïs, du tissu foliaire desséché de la plante de résurrection, Eragrostis nindensis, et de la cyanobactérie, Synechocystis . sp. PCC 6803. L’isolement repose sur la faible densité de ces particules riches en lipides, ce qui facilite leur purification par flottation de densité saccharose. Cette méthodologie s’avérera utile dans l’étude des plastoglobules de diverses espèces.

À la fin de l’étape 1 du protocole, on devrait être en mesure de voir facilement une quantité considérable de plastoglobules/gouttelettes lipidiques flottant sur (ou à proximité) de la couche supérieure du coussin de saccharose (figure 1B-C). D’autres fractions pourraient également être collectées à ce stade. Par exemple, les thylakoïdes seront granulés et pourront être remis en suspension avec un milieu R 0,2 pour des analyses ultérieures. Après centrifugat...

Un protocole rapide et efficace est présenté pour l’isolement des gouttelettes lipidiques plastoglobules associées à divers organismes photosynthétiques. La préparation réussie de plastoglobules isolés est une première étape cruciale qui précède les investigations moléculaires détaillées telles que les analyses protéomiques et lipidomiques.

Isolement de gouttelettes lipidiques de plastoglobule à partir de tissus foliaires végétaux et de cyanobactéries

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

L’isolement de plastoglobules très purs est essentiel à leur étude. Un protocole rapide et efficace pour leur isolement qui facilite leur étude biochimique en aval est présenté ici. Le principal avantage de cette méthode est la rapidité relative de la procédure et son adaptabilité à de nombreuses espèces végétales et conditions environnementales.Des précautions particulières doivent être prises lors de la sonication des resuspensions de thylakoïdes pour assurer une force suffisante pour enlever les plastoglobules des thylakoïdes et avec l’extraction ultérieure des plastoglobules du gradient de saccharose. Le Dr Elsinraju Devadasu, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, et Febri Susanto, doctorant dans mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Commencez par acquérir des plants de six maïs sains, âgés de trois semaines, ayant un stade de croissance V5 et pesant environ 120 grammes.Coupez toutes les feuilles à la base de la tige et plongez-les rapidement dans un bain de glace avant de les transporter dans la chambre froide. En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en petits morceaux de cinq centimètres sur cinq à l’aide de ciseaux. Broyer doucement et soigneusement la moitié du tissu foliaire coupé dans 350 millilitres du tampon de broyage à un niveau inférieur à sept sur un mélangeur commercial.Démarrez et arrêtez le mélangeur cinq à six fois pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu en nylon de 25 microns sur un grand entonnoir jusqu’à quatre bouteilles centrifugeuses de 250 millilitres. Après avoir répété l’étape de mélange avec le reste du tissu foliaire coupé, répartir uniformément le filtrat entre les quatre bouteilles.Retirer une partie aliquote du filtrat foliaire et la mettre de côté pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille. Ensuite, centrifugez le filtrat pendant six minutes à 1 840 G et quatre degrés Celsius. Versez le surnageant résultant et, avec de doux mouvements tourbillonnants de la brosse, remettez en suspension la pastille dans 12 millilitres de milieu R 0,2, contenant 0,2 molaire de saccharose.Après avoir remis en suspension la pastille dans une bouteille, ajoutez la suspension à la bouteille suivante et répétez la remise en suspension pour regrouper les suspensions dans une bouteille. Répartir la suspension groupée entre six tubes ultracentrifuges de trois millilitres, atteignant un volume maximal de 2,5 millilitres dans chaque tube. Utilisez ensuite le sonicateur de pointe à une amplitude de 100% pour sonifier chaque tube quatre fois pendant 10 secondes chacun.Assurez-vous de garder la corne du sonicateur immergée et éloignée de la surface du liquide pour éviter la mousse. Déplacez lentement la corne du sonicateur de haut en bas dans la suspension pendant chaque tour. Tout en alternant les quatre tubes, remettre chaque tube dans un seau à glace après chaque sonication pour permettre à l’échantillon de refroidir.Une fois cela fait, centrifuger la suspension de thylakoïdes bruts soniqués à 150 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Écumer la surface du coussin à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de calibre 22 et récolter le tampon flottant jaune et huileux résultant de plastoglobules bruts du coussin de saccharose. Récupérez environ 500 microlitres de chaque tube et déposez-les dans un tube de 2,0 millilitres.Recueillir les aliquotes thylakoïdes brutes avant et après la sonication et la libération de plastoglobules. Une fois cela fait, continuez le traitement des tissus végétaux ou stockez les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et purifiez-les plus tard. Cultiver 50 millilitres de culture de l’espèce PCC 6802 de synechocystis dans un milieu BG11 pendant 7 à 10 jours pour atteindre la phase stationnaire.À l’aide d’un spectrophotomètre, ajustez la densité cellulaire à une densité optique de 2,0 à 750 nanomètres. Pour éliminer les polysaccharides, centrifuger 50 millilitres de culture et retirer le surnageant. Répétez le lavage des cellules dans 50 millilitres de tampon A deux fois.Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 millilitres de tampon A et brisez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française à 1 100 livres de pouces carrés. Répétez le processus trois fois par temps froid jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge, bleu, vert sous lumière blanche. Retirer la partie aliquote de l’homogénat cellulaire et la mettre de côté pour la conserver en tant qu’échantillon cellulaire total représentatif.Répartir l’homogénat obtenu dans huit tubes ultracentrifugés de trois millilitres remplis à un maximum de 2,5 millilitres dans chaque tube. Superposez cet homogénat avec 400 microlitres de milieu R, produisant un gradient progressif. Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant un milieu R supplémentaire si nécessaire avant de centrifuger les tubes.Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds, y compris les corps polyhydroxyalcanoates, montrent la formation de granulés, tandis que les plastoglobules forment un tampon huileux jaune sur ou près du sommet du gradient de saccharose. Récoltez la plaquette flottante résultante de plastoglobules bruts avec une seringue, comme démontré précédemment, et déposez la récolte dans un tube de deux millilitres. Grattez les plastoglobules du côté de la paroi du tube ultracentrifuge avec une pointe d’aiguille si nécessaire.Continuez le traitement des cyanobactéries ou stockez les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et purifiez plus tard. Pour récolter les plastoglobules purs en utilisant la méthode de traitement des tissus végétaux, préparez le gradient de saccharose décrit précédemment en utilisant 500 microlitres de plastoglobules bruts, 400 microlitres de milieu R 0,2 et 400 microlitres de milieu R.Après centrifugation, récoltez le tampon flottant résultant de plastoglobules purs dans un tube de deux millilitres. Après avoir aliquote les plastoglobules purs et congelé les aliquotes dans de l’azote liquide, stockez-les à moins 80 degrés Celsius ou lyophilisez-les en une poudre sèche.Pour récolter des plastoglobules purs de cyanobactéries, créez un gradient de saccharose, comme mentionné précédemment, en utilisant 500 microlitres de plastoglobules bruts, 750 microlitres de milieu R 0,7 et 750 microlitres de milieu R 0,2. Après centrifugation, recueillir les plastoglobules purs dans un tube de 1,5 millilitre et aliquoter les plastoglobules purs. Une fois cela fait, congelez les aliquotes de plastoglobules purs dans de l’azote liquide et stockez-les directement à moins 80 degrés Celsius ou lyophilisez en une poudre sèche.Dans cette méthode, une quantité importante de plastoglobule ou de gouttelettes lipidiques a été observée flottant sur la couche supérieure du coussin de saccharose. Après centrifugation ultérieure, des plastoglobules purifiés ont été obtenus à la surface ou près de la surface du gradient de saccharose. Après l’isolement réussi des plastoglobules, les immunoblots développés pour l’évaluation de la pureté en utilisant des anticorps élevés contre arabidopsis thaliana fibrillin 1a et arabidopsis thaliana photosystem II sous-unité D1 ont montré que les homologues de la fibrilline étaient principalement associés aux thylakoïdes que les plastoglobules.Pour assurer l’extraction efficace et concentrée du tampon flottant, placez l’orifice de l’aiguille de la seringue juste en dessous de la surface liquide du tampon tout en étant complètement immergé, puis tirez doucement vers le haut. Des échantillons isolés de plastoglobules se prêtent à des études protéomiques ou lipidomiques ultérieures et ont été utilisés pour démontrer les changements dans la composition protéine-lipidique ciblée dans différentes conditions environnementales. Cette technique a facilité de nouvelles études sur les plastoglobules, y compris la découverte de l’activité protéique kinase associée et la présence de complexes protéiques oligomères grâce à des études biochimiques ultérieures.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC)

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