Name: Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Découvrez une méthode complète pour diagnostiquer les cardiopathies congénitales chez la souris fœtale par échocardiographie non invasive, nécropsie et microscopie confocale épiscopique avec reconstruction 3D.

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L’utilisation de souris pour ces études est nécessaire car les souris ont des cœurs à quatre chambres qui peuvent imiter les cardiopathies congénitales humaines. Les souris ont reçu des soins vétérinaires et ont été hébergées dans l’établissement de soins aux animaux accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) de l’établissement. Des protocoles stricts ont été suivis pour minimiser l’inconfort, le stress, la douleur et les blessures des souris. Des souris ont été euthanasiées à l’aide de gaz CO2 , ce qui est acceptable pour les petits rongeurs selon les directives de l’American Veterinary Medical Association sur l’euthanasie. Les études sur les souris de ce manuscrit ont été réalisées avec un protocole IACUC approuvé à l’Université de Pittsburgh.
1. Échocardiogramme fœtal
REMARQUE: Un échocardiogramme est un outil puissant pour identifier les malformations cardiovasculaires et les anomalies extracardiaques chez la souris. En raison de la petite taille des embryons de souris (environ 1-2 mm à mi-gestation, 3,5 mm à la naissance), un équipement échocardiographique à ultra-haute fréquence avec biomicroscopie par ultrasons (UBM) est nécessaire. UBM fournit différentes sondes haute fréquence (30-50 MHz) avec une petite fenêtre d’imagerie (15 mm x 14 mm) qui fournit la résolution (30 μm axiale x 68 μm latéral) pour visualiser un fœtus de souris à la fois. Un transducteur de 40 MHz fournit des images haute résolution pour identifier les phénotypes cardiovasculaires7.
<ol><li>Allumez l’appareil d’échocardiogramme et sélectionnez le programme Cardiologie. REMARQUE: Le protocole suivant peut être utilisé pour n’importe quel fond de souris du jour embryonnaire (E) 14.5 à 19.5.</li>
	<li>Anesthésiez la souris désirée dans une chambre d’induction anesthésique. Induire l’anesthésie en utilisant une concentration de 4% d’isoflurane et d’oxygène médical à un débit de 1 L / min et la réduire à 2%-3% pour l’entretien.</li>
	<li>Placez rapidement la souris sur la plate-forme d’imagerie. La plate-forme d’imagerie a chauffé de l’acier pour garder la souris au chaud pendant la procédure. Mettez la bouche et le nez de la souris dans le cône nasal anesthésique. Fixez les membres avec du ruban adhésif pour éviter les mouvements. Surveillez la fréquence cardiaque pour vous assurer qu’elle reste entre 400 et 450 bpm.</li>
	<li>Surveillez la température à l’aide d’une sonde de thermomètre rectal et assurez-vous qu’elle repose à 37 °C ± 0,5 °C. Surveillez la respiration pour éviter l’hypoxie. Gardez une légère force sur la sonde pour éviter les dommages. REMARQUE: Une lampe chauffante peut être placée au-dessus de la souris pour prévenir l’hypothermie et pour récupérer de l’anesthésie. La pommade ophtalmique Petrolatum peut être utilisée comme lubrifiant pour éviter les yeux secs.</li>
	<li>Retirez la fourrure du thorax et de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire. Appliquez la crème et attendez 3 min avant de la retirer. Nettoyez la zone avec de l’éthanol à 70%. L’éthanol fonctionne mieux que l’eau comme lubrifiant de rasage.</li>
	<li>Réchauffez le gel à ultrasons à une température corporelle normale. Appliquez généreusement le gel à ultrasons et placez le transducteur sur l’abdomen pour l’orienter dans un plan horizontal et identifier la vessie sur l’écran. Une fois la vessie identifiée, balayez crânienne de la vessie et recherchez le fœtus. Mesurer la longueur de la couronne à la croupe pour déterminer l’âge gestationnel10 (figure 1 et tableau 1). REMARQUE : Modifiez la position du transducteur pour visualiser différents plans, y compris les plans d’imagerie transversaux à quatre chambres, sagittal et frontal/coronal7 (Figure 1).</li>
	<li>Utilisez la couleur Doppler pour analyser le flux sanguin du cœur.</li>
	<li>Remettez la souris dans la cage si les embryons n’ont pas atteint le stade prévu. Sinon, préparez la souris pour la récolte. REMARQUE: Assurez-vous que la souris est déjà éveillée et se remet bien de l’anesthésie avant de la remettre dans la cage.</li>
	<li>Éteignez l’isoflurane et l’oxygène, nettoyez la zone de travail et éteignez la machine. REMARQUE: Il est important de retirer le gel du transducteur.</li>
</ol>2. Nécropsie
REMARQUE: Une fois que des phénotypes cardiaques anormaux sont suspectés par échocardiographie fœtale, les fœtus sont recueillis et fixés par immersion du corps entier dans la solution fixatrice: soit 10% de phosphate de formol tamponné ou 4% de paraformaldéhyde (PFA). Inspecter la morphologie externe et interne de l’échantillon, à la recherche d’anomalies anatomiques macroscopiques ou de malformations.
<ol><li>Préparez la souris.<ol><li>Si la souris est adulte, euthanasiez-la à l’aide d’un protocole standard de CO2 . Utilisez des pinces ou des ciseaux à dissection pour faire des incisions (environ 3 cm) dans le thorax latéral et l’abdomen afin de permettre la pénétration du fixateur dans les organes internes. REMARQUE : L’échantillon doit être fixé pendant au moins 24 heures avant l’autopsie si l’embryon est plus âgé que E14.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysez l’extérieur du corps.<ol><li>Configurez le logiciel pour enregistrer les images avec un nom, y compris l’identification de l’échantillon, l’agrandissement du microscope et le contenu de l’image. REMARQUE: Un grossissement de 1,0x à 3,2x devrait être suffisant pour l’imagerie de la plupart des structures chez les souris E14.5 ou plus anciennes.</li>
		<li>Placez la souris sur la plaque sous la lentille du stéréomicroscope. Remplissez la plaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour couvrir complètement l’échantillon afin d’éviter la déshydratation et la réflexion sur les images. Ajustez le grossissement de sorte que l’écran comprenne l’embryon entier, puis prenez une photo des côtés gauche et droit de l’embryon. REMARQUE: Le fond de la plaque doit être recouvert de paraffine, de silicium ou d’un autre substrat pour faciliter l’épinglage.</li>
		<li>Épinglez l’échantillon dans sa gorge, face vers le haut, et prenez une autre photo. REMARQUE: Orientez la broche légèrement vers le haut pour vous assurer qu’aucune structure importante de la cavité thoracique n’est percée.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysez la poitrine.<ol><li>Tout en soulevant la peau au milieu du cou avec une pince, coupez la peau vers les deux aisselles avec les ciseaux avant de couper la peau le long de l’axe médian vers la queue. Ensuite, coupez la peau de l’ombilic aux jambes. Épinglez l’échantillon à travers ses poignets et ses chevilles. REMARQUE: Veillez à ne couper que la peau. Il est recommandé de tenir les lames des ciseaux horizontalement ou inclinées vers le haut.</li>
		<li>Pour détacher le tissu conjonctif, soulevez la peau avec une paire de forceps tout en maintenant le tissu sous-jacent en place avec l’autre paire. Épinglez l’échantillon à travers la peau pour aider à exposer la poitrine et l’abdomen (Figure 2). REMARQUE: Trop d’étirement lors de l’épinglage, de la coupe ou du grattage peut entraîner des lésions tissulaires.</li>
		<li>Prenez une photo des muscles exposés, puis grattez doucement les muscles pour exposer les côtes.</li>
		<li>Prenez une photo des côtes exposées. Séparez les côtes du diaphragme et coupez les côtes des deux côtés aussi loin que possible sur l’axe latéral vers le cou.</li>
		<li>Exposez le cœur en enlevant les côtes coupées. Prenez une photo du cœur.</li>
		<li>Retirez le thymus en le pelant avec une paire de pinces. Utilisez l’autre paire de pinces pour stabiliser la base du thymus afin d’éviter de déchirer les vaisseaux sous-jacents. Prenez des photos du cœur et des grands vaisseaux. REMARQUE: L’utilisation de broches pour étirer certaines structures adjacentes peut aider à obtenir de meilleures vues d’imagerie. De plus, prenez des photos séparées axées sur les grandes artères, le cœur et d’autres structures d’intérêt, car elles peuvent ne pas être nettes ensemble.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysez l’abdomen.<ol><li>Tirez sur le diaphragme pour l’enlever et exposer le foie. Prenez une photo.</li>
		<li>Épinglez le foie pour exposer l’estomac et le pancréas. Prenez une photo.</li>
		<li>Coupez l’œsophage. Enlevez le côlon et les intestins en les tirant avec une pince. Coupez juste au-dessus du foie et retirez-le pour révéler les reins et les glandes surrénales. Prenez une photo. NOTE: Les organes prélevés doivent être conservés dans la solution fixatrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolez le thorax pour l’analyse ECM.<ol><li>Coupez le thorax inférieur le long d’une ligne droite entre le foie et les poumons. Coupez la tête assez haut pour ne pas couper les ramifications des artères carotides.</li>
		<li>Retirez délicatement les côtes latérales tout en maintenant les côtes dorsales et la colonne vertébrale. Pelez et grattez la graisse dorsale.</li>
		<li>Détachez le thorax du reste du corps et placez-le dans une solution tamponnée au formol à 10%.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Intégration
<ol><li>Décanter le fixateur dans une bouteille de déchets dangereux appropriée. Lavez les échantillons avec 1x PBS pendant 15 min trois fois.</li>
	<li>Utilisez des concentrations croissantes d’éthanol et de xylène pour déshydrater les échantillons. La durée de toutes les étapes suivantes dépend du stade des embryons. Veuillez consulter le tableau 2 pour plus de détails. NOTE: Des précautions doivent être prises lors du changement de solutions pour éviter d’endommager les échantillons. Les paramètres optimaux pour le traitement des échantillons peuvent être ajustés empiriquement. Le xylène dissout certains plastiques; Des instruments et des récipients en verre doivent être utilisés.</li>
	<li>Remplacer le xylène par de la paraffine pendant la durée souhaitée. Laisser les bouteilles dans un incubateur à 65 °C pendant la durée appropriée (tableau 2).</li>
	<li>Utilisez de la paraffine fraîche pour incorporer les échantillons dans la position souhaitée. NOTE: Il est recommandé d’orienter l’échantillon au milieu du bloc de paraffine, avec sa face dorsale vers le haut et la face postérieure vers l’avant du bloc. Lorsque vous orientez l’échantillon, n’oubliez pas que l’échantillon est incorporé avec le bloc à l’envers.</li>
</ol>4. Microscopie confocale épiscopique (ECM)
REMARQUE: Après une intégration appropriée, les embryons subissent une collecte d’images en série via ECM pour l’analyse histopathologique. Des lames individuelles peuvent être récupérées à partir du microtome pour des études plus approfondies.
<ol><li>Sortez le bloc de paraffine du congélateur à -20 °C et retirez les moules métalliques.</li>
	<li>Utilisez une lame de rasoir pour couper la cire sur les bords et à l’arrière de la cassette. Couper la cire entourant l’échantillon jusqu’à ce qu’elle soit enfermée dans un petit carré de cire attaché à la cassette. REMARQUE: Faites preuve d’une extrême prudence lorsque vous manipulez des lames.</li>
	<li>Utilisez le levier métallique pour serrer le bloc de paraffine contre l’étape de tranchage du microtome. Sélectionnez la fonction MAN (manuelle) en mode Exécution, relevez la surface de la paraffine près de la lame et exécutez quelques diapositives pour vous assurer que la lame entre en contact avec le bloc de paraffine.</li>
	<li>Ouvrez l’application LAS AF et sélectionnez MatrixScreener. Sélectionnez Single Regular Matrix et chargez le modèle approprié précédemment enregistré. Cliquez sur le bouton Quick LUT pour passer à l’ombre blanche et orange.</li>
	<li>Sélectionnez Configurer les tâches et faites glisser le laser visible de 405 nm au maximum. Faites correspondre le bord gauche du bloc de spectre à la ligne de 405 nm et faites glisser le bord droit vers la ligne de 800 nm. Cochez l’option Sténopé et démarrez la vue En direct .</li>
	<li>Ajustez la position de la projection laser pour centrer l’échantillon sur l’écran et réglez le bouton de zoom à ~20x. Pour optimiser la résolution, réglez le gain sur 1 250 V et maximisez la zone bleue à l’aide du bouton de mise au point ; Ensuite, réinitialisez le gain à environ 750 V pour l’imagerie. REMARQUE: Les valeurs spécifiques peuvent varier en fonction de l’état de l’embryon.</li>
	<li>Basculez la méthode de coupe sur Auto, définissez l’épaisseur à environ 50 μm et exécutez les glissières. Arrêtez de couper lorsque les poumons et les voies respiratoires sont en vue.</li>
	<li>Choisissez une épaisseur de coupe comprise entre 8 et 10 μm et arrêtez la vue En direct . Ouvrez Microtome Communicator pour démarrer l’imagerie. Assurez-vous que le dossier de stockage temporaire est vide avant de collecter des images.</li>
	<li>Arrêtez de couper lorsqu’aucune structure cardiaque supplémentaire n’est visualisée. Fermez l’application Microtome Communicator et exportez le fichier temporaire dans une série d’images .tiff via le logiciel de traitement d’image pour des reconstructions 3D ultérieures.</li>
</ol>5. Reconstruction tridimensionnelle (3D)
REMARQUE: Le but de la reconstruction 3D est de traiter une pile d’images 2D de l’imagerie ECM en vidéos 3D dans les orientations coronale, sagittale et transversale et d’utiliser les vidéos 3D pour le diagnostic des anomalies structurelles et anatomiques dans les échantillons.
<ol><li>Ouvrez la pile d’images ECM dans le logiciel de traitement d’image.<ol><li>Faites glisser et déposez l’image des fichiers dans le logiciel de traitement d’image. Retournez les images ECM horizontalement en sélectionnant Image > Transformer > Retourner horizontalement dans la barre de menus.</li>
		<li>Enregistrez l’image retournée et fermez le logiciel de traitement d’image.</li>
	</ol></li>
	<li>Importez la pile d’images ECM dans le logiciel de visualisation DICOM.<ol><li>Faites glisser et déposez les images ECM retournées horizontalement dans le logiciel de visualisation DICOM. Assurez-vous qu’il y a une bordure bleu clair autour de la liste d’exemples, sinon des images peuvent être ajoutées à un dossier d’exemple existant.</li>
		<li>Sélectionnez les liens ou les fichiers à copier dans la base de données lorsque la fenêtre contextuelle apparaît. Un nouvel exemple apparaîtra dans la liste d’exemples avec le même nom que le fichier copié dans le logiciel de visualisation DICOM.</li>
		<li>Cliquez sur le fichier nouvellement ajouté pour l’ouvrir.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuez une reconstruction 3D.<ol><li>Une fois le fichier ouvert, cliquez sur le menu Outils de reconstruction 2D/ 3D de la barre d’outils et sélectionnez 3D MPR.</li>
		<li>Pour la résolution Pixel X et la résolution Pixel Y, entrez la résolution de l’image en donnant le zoom utilisé lors de l’imagerie ECM. Pour l’intervalle de tranche, entrez l’épaisseur de tranche utilisée pour couper pendant l’imagerie ECM. REMARQUE: La résolution de la caméra change en fonction du zoom de l’appareil photo et peut différer d’un appareil photo à l’autre.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez les différents outils de l’onglet Outils sur le côté gauche pour ajuster les piles d’images comme vous le souhaitez.<ol><li>Utilisez l’outil WW/WL pour ajuster la largeur et le niveau de la fenêtre. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers le haut pour diminuer la luminosité de l’image et vers le bas pour l’augmenter. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers la droite pour réduire le contraste de l’image et vers la gauche pour l’augmenter. Remarque : Les paramètres WW/WL optimaux pour une structure peuvent être sous-optimaux pour une autre. Pour cette raison, il est recommandé de créer des vidéos séparées pour afficher différentes structures.</li>
		<li>Utilisez l’outil Panoramique pour faire glisser les images dans les positions souhaitées. Utilisez l’outil Zoom pour agrandir ou réduire l’image comme vous le souhaitez et l’outil Faire pivoter pour faire pivoter l’image comme vous le souhaitez. REMARQUE: L’agrandissement des images peut entraîner une diminution de la qualité de l’image. Soyez prudent lorsque vous faites pivoter des images, car cela pourrait faire basculer les axes.</li>
	</ol></li>
	<li>Cliquez sur l’axe coloré du premier panneau et faites-le glisser. Remarquez comment la rotation de cet axe modifie l’orientation des deux autres panneaux. Faites pivoter les axes des trois panneaux jusqu’à ce que les trois panneaux représentent des vues coronales, sagittales et transversales de l’échantillon. REMARQUE: Lors de la réorientation des échantillons, maintenez une orientation antérieure / postérieure correcte.</li>
	<li>Générez des vidéos.<ol><li>Une fois que les trois panneaux sont correctement positionnés, orientés et éclairés, cliquez sur le panneau représentant la vue coronale.</li>
		<li>Cliquez sur Exportation de film sur le côté droit de la barre de menus. Cliquez sur Batch et faites glisser les curseurs From et To pour englober toute la région d’intérêt. Pour Intervalle, sélectionnez l’option Identique à Épaisseur . Enregistrez la vidéo en indiquant l’orientation de la vue.</li>
		<li>Regardez la vidéo pour voir si les structures d’intérêt peuvent être identifiées adéquatement. Si ce n’est pas le cas, utilisez les outils (étape 5.4) pour réajuster les vidéos si nécessaire et réenregistrer la vidéo.</li>
	</ol></li>
	<li>Répétez l’étape 5.6 pour les vues transversales et sagittales. Diagnostiquez les échantillons à l’aide de vidéos reconstruites. REMARQUE : Regardez attentivement les vidéos dans chaque orientation pour évaluer complètement si l’échantillon présente des anomalies anatomiques ou des phénotypes de maladie (Figure 3).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts dans ce manuscrit.

Des souris génétiquement modifiées ont été utilisées pour comprendre les mécanismes pathologiques des malformations cardiaques congénitales. Les protocoles que nous fournissons dans cette étude tentent de rationaliser et de normaliser le processus d’évaluation des malformations cardiaques fœtales murines. Cependant, il y a des étapes critiques à noter pendant le protocole. Les embryons de souris se développent de manière significative au cours de chaque jour de gestation, et le moment correct pour récolter une souris peu...

Les cardiopathies congénitales (cardiopathies) sont l’anomalie congénitale néonatale la plus courante 1,2, touchant environ 0,8 % à 1,7 % des nouveau-nés et entraînant une mortalité et une morbidité néonatales importantes3. Une étiologie génétique est fortement indiquée avec les cardiopathies congénitales 4,5. Les modèles murins génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent en raison du fait que les souris ont des cœurs à quatre chambres et des séquences d’ADN de développement cardiaque comparables chez les fœtus de souris et humains6. L’identification du phénotype des mutants de souris est la première étape fondamentale dans la caractérisation de la fonction du gène ciblé. Les modèles murins exprimant les effets de dosage des gènes, dans lesquels une seule mutation génétique peut entraîner un spectre de malformations cardiaques qui imitent les maladies coronariennes humaines, sont importants pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent.
Cet article décrit un pipeline pour caractériser les phénotypes cardiaques dans des modèles murins. Les méthodes appliquées utilisent l’échocardiogramme fœtal 7, suivi de la nécropsie et de l’histopathologie ECM 7,8, qui peut afficher l’anatomie détaillée des phénotypes cardiaques murins en développement. Un échocardiogramme fœtal est une modalité non invasive qui permet la visualisation directe de plusieurs embryons avec une résolution d’imagerie raisonnable. En outre, un échocardiogramme fœtal permet de déterminer rapidement le nombre total d’embryons dans une portée, leurs stades de développement, ainsi que l’orientation et l’emplacement relatifs dans la corne utérine. À l’aide d’un Doppler spectral / flux de couleur, les embryons anormaux peuvent être identifiés en fonction de la structure, de la perturbation hémodynamique, du restriction de croissance ou du développement de l’hydrops. Étant donné qu’une étude d’échocardiogramme fœtal est une technique non invasive, elle peut être utilisée pour scanner sur plusieurs jours et pour observer les changements dans l’hémodynamique ou la morphologie cardiaque. L’obtention d’une imagerie de haute qualité des échocardiogrammes fœtaux nécessite de la pratique et des compétences, car des malformations cardiaques spécifiques peuvent être manquées en raison d’un manque d’expérience et de connaissances. Pour cette raison, une analyse plus définitive de la morphologie cardiaque peut être obtenue par une combinaison de nécropsie et d’histopathologie ECM. L’autopsie permet de visualiser directement la structure de l’arcade, les relations relatives de l’aorte et de l’artère pulmonaire, la taille des ventricules et des oreillettes, la position du cœur par rapport à la poitrine et les structures bronchopulmonaires. Cependant, les caractéristiques intérieures telles que les valves cardiaques et l’épaisseur de la paroi peuvent être difficiles à évaluer par nécropsie seule. Ainsi, l’histopathologie ECM est recommandée pour un diagnostic concluant. L’histopathologie ECM est une technique de visualisation haute résolution qui permet à la fois la reconstruction 2D et 3D de la pile d’images9. Ces images sont obtenues par imagerie fluorescente épiscopique en série d’un échantillon incorporé dans de la paraffine lorsqu’il est sectionné finement à intervalle constant par un microtome automatique. Contrairement à l’histologie classique, les images sont capturées sous forme de section avant d’être découpées du bloc de sorte que toutes les images sont capturées dans le même cadre de référence. Pour cette raison, la pile d’images 2D produite par l’histopathologie ECM peut être facilement et de manière fiable reconstruite en trois dimensions. Cela se fait à l’aide d’une visionneuse DICOM, qui permet la visualisation 3D des images dans les trois plans anatomiques: coronal, sagittal et transversal. À partir de ces reconstructions 3D haute résolution, un diagnostic cardiaque définitif peut être posé. L’application de ces trois différentes modalités de visualisation, individuellement ou en combinaison, peut fournir des caractérisations précises des malformations cardiaques structurelles chez les embryons de souris.

<table><tbody><tr><td>1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), PH7.4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes Eppendorf (ou flacon préféré pour le stockage des tissus)</td><td>SealRite</td><td>1615-5599</td><td></td></tr><tr><td>Solution de phosphate de formol tamponnée à 10 %</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>100</td> % <td>éthanol Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>16 % paraformaldéhyde (PFA) fixateur&nbsp ;</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>4 % de concentration de travail fraîchement préparé dans 1x PBS à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6&ndash ; Plaque à 12 puits ou flacon de 20 mL pour stockage d’embryons</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>microscope de dissection.</td>Goupilles de dissection <td>Leica</td><td>MDG36</td><td></td></tr><tr><td>(grade A1 ou A2)</td><td>F.S.T</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de dissectionnement&nbsp ;</td><td>F.S.T</td><td>FB0875713</td><td>Boîte de Pétri avec base de paraffine</td></tr><tr><td>Moules d’enrobage</td><td>Sakura</td><td>4133</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux extra étroits (10,5 cm)</td><td>F.S.T</td><td>14088-10</td><td>1&ndash ; 2 paires&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fidji application/Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Fiji.sc</td></tr><tr><td>Pointe fine (0,05 mm x 0,01 mm) Pince à dissection (11 cm)</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td>2 paires</td></tr><tr><td>Pinces chaudes&nbsp ;</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td>Pour l’orientation des embryons</td></tr><tr><td>Marqueur industriel pour blocs de cire&nbsp ;</td><td>Sharpie</td><td>2003898</td><td>Formaté pour une utilisation en laboratoire</td></tr><tr><td>Caméra microscope Jenoptik ProgRes C14plus&nbsp ;</td><td>Jenoptik</td><td>017953-650-26</td><td></td></tr><tr><td>Jenoptik ProgRess CapturePro logiciel d’acquisition</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>jenoptik.com</td></tr><tr><td>Grand bécher en verre&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111053</td><td>Pour la paroftine de fusion</td></tr><tr><td>Microscope binoculaire Leica M165 FC (optique zoom 16,5:1)</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>OsiriX MD Version 12.0</td><td>OsiriX</td><td></td><td>osirix-viewer.com&nbsp ;</td></tr><tr><td>Paraplast encastrable cire de paraffine</td><td>Millipore Sigma</td><td>1003230215</td><td></td></tr><tr><td>Petit bécher en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>S111045</td><td></td></tr><tr><td>Petite cuillère perforée (14,5 cm)</td><td>F.S.T</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas droits (4&ndash ; 8 mm)</td><td>F.S.T</td><td>15018-10</td><td>Une paire</td></tr> de <tr><td>biomicroscopes à ultrasons ultra-haute fréquence Vevo2100</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc.</td><td>Vevo2100</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Fisher Chemical</td><td>UN1307</td><td></td></tr></tbody></table>

un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale

A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse

Les cardiopathies congénitales (CHD) sont les principales causes de mortalité infantile aux États-Unis. Dans les années 1980 et plus tôt, la plupart des patients atteints de coronaropathie modérée ou sévère mouraient avant l’âge adulte, avec la mortalité maximale au cours de la première semaine de vie. Des progrès remarquables dans les techniques chirurgicales, les approches diagnostiques et la prise en charge médicale ont conduit à des améliorations marquées des résultats. Pour répondre aux besoins de recherche critiques de la compréhension des malformations cardiaques congénitales, les modèles murins ont fourni une plate-forme de recherche idéale, car ils ont une anatomie cardiaque très similaire à celle des humains et des taux de gestation courts. La combinaison du génie génétique avec des outils de phénotypage à haut débit a permis la réplication et le diagnostic des malformations cardiaques structurelles afin d’élucider davantage les voies moléculaires derrière les maladies coronariennes. L’utilisation de l’échocardiographie fœtale non invasive pour dépister les phénotypes cardiaques dans des modèles murins, associée à la haute fidélité de la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de l’histopathologie de microscopie confocale épiscopique (ECM) avec reconstructions tridimensionnelles (3D) permet une vue détaillée de l’anatomie de diverses malformations cardiaques congénitales. Ce protocole décrit un flux de travail complet de ces méthodes pour obtenir un diagnostic précis des malformations cardiaques congénitales murines. L’application de ce protocole de phénotypage à des organismes modèles permettra un diagnostic précis de coronaropathie, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes de la coronaropathie. L’identification des mécanismes sous-jacents de la coronaropathie offre des possibilités de thérapies et d’interventions potentielles.

Les embryons de souris présentant des défauts hémodynamiques importants ont été notés comme étant létaux embryonnaire. Une grande variété de maladies coronariennes peut être identifiée grâce à l’échocardiogramme fœtal non invasif à haut rendement en utilisant différentes vues (Figure 1).
Anomalies septales : Les cardiopathies congénitales les plus courantes sont les anomalies septales telles qu’une communication interventriculaire (VSD), une commu...

Cet article détaille les méthodes de diagnostic des cardiopathies congénitales (CHD) murines utilisant l’échocardiographie fœtale, la nécropsie et la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de la microscopie confocale épiscopique (ECM) suivie d’une reconstruction tridimensionnelle (3D).

Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale

Congenital heart diseases (CHDs) are major causes of infant death in the United States. In the 1980s and earlier, most patients with moderate or severe ...

Ce protocole décrit des méthodes de pointe pour générer des données d’imagerie à haute résolution pour le diagnostic des malformations cardiaques congénitales. Nous effectuons des évaluations fonctionnelles avec échocardiographie fœtale non invasive combinée à une nécropsie suivie d’une histopathologie de microscopie confocale épiscopale pour générer des piles d’images 2D en série et des reconstructions 3D pour un diagnostic complet des maladies coronariennes. Cette méthode peut élucider les changements anatomiques détaillés non seulement dans les cardiopathies congénitales, mais peut également être utilisée pour étudier les malformations congénitales structurelles dans d’autres organes, y compris les anomalies faciales crâniennes, les anomalies des membres et du squelette, ainsi que les anomalies du cerveau et d’autres organes viscéraux.Meghan Holbrook, Carla Guzman, Peizhao Zhang et Benjamin Glennon, tous chercheurs de notre laboratoire, feront la démonstration de ces procédures. Après avoir préparé la souris pour la procédure, réchauffez le gel à ultrasons à une température corporelle et appliquez-le généreusement sur la zone d’imagerie. Placez ensuite le transducteur sur l’abdomen orienté dans un plan horizontal et identifiez la vessie sur l’écran.Une fois la vessie identifiée, balayez crânienne de la vessie, recherchez le fœtus et déterminez l’âge gestationnel en mesurant la longueur de la couronne à la croupe. Ensuite, utilisez le Doppler couleur pour analyser le flux sanguin du cœur. Pour permettre la pénétration fixatrice dans les organes internes, faites des incisions dans le thorax latéral et l’abdomen à l’aide de forceps ou de ciseaux disséquants et laissez l’échantillon se fixer pendant au moins 24 heures dans une chambre froide.Ensuite, configurez le logiciel pour enregistrer les images avec un nom, y compris l’identification de l’échantillon, le grossissement du microscope et le contenu de l’image. Épinglez l’échantillon à travers ses poignets et ses chevilles. Avant de couper la peau le long de l’axe médian vers la queue, soulevez la peau au milieu du cou à l’aide d’une pince et coupez la peau vers les deux aisselles avec les ciseaux.Ensuite, coupez la peau de l’ombilic aux jambes. Après avoir incorporé les échantillons, réglez la position de projection laser au centre de l’échantillon sur l’écran et réglez le bouton de zoom sur 20x. Pour optimiser la résolution, réglez le gain sur 1, 250V.Agrandissez la zone bleue à l’aide du bouton de mise au point, puis réinitialisez le gain à environ 750 V pour l’imagerie. Ensuite, basculez la méthode de coupe sur auto. Réglez l’épaisseur à environ 50 micromètres et exécutez les diapositives.Arrêtez de couper lorsque les poumons et les voies respiratoires sont en vue. Choisissez une épaisseur de coupe comprise entre huit et 10 micromètres et arrêtez la vue en direct ouverte. Ouvrez Microtome Communicator pour démarrer l’imagerie.Assurez-vous que le dossier de stockage temporaire est vide avant de collecter des images. Arrêtez la collection d’images lorsqu’aucune structure physique n’est visible. Extrayez les fichiers stockés temporaires dans une série d’images TIFF.Pour la reconstruction d’images 3D, faites glisser et déposez les fichiers image dans le logiciel de traitement d’image. Une fois la fenêtre contextuelle affichée, sélectionnez les liens ou les fichiers à copier dans la base de données. Une fois le fichier ouvert, cliquez sur le menu Outils de reconstruction 3D 2D de la barre d’outils et sélectionnez MPR 3D.Pour la résolution pixel X et la résolution pixel Y, entrez la résolution de l’image en donnant le zoom utilisé lors de l’imagerie ECM. Pour l’intervalle de tranche, entrez l’épaisseur de tranche utilisée pour couper pendant l’imagerie ECM. Ensuite, utilisez l’outil WWWL pour ajuster la largeur et le niveau de la fenêtre.Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers le haut pour diminuer la luminosité de l’image et vers le bas pour l’augmenter. Cliquez et faites glisser l’outil sur l’image vers la droite pour réduire le contraste de l’image et le mot gauche pour l’augmenter. Faites glisser les images dans les positions souhaitées à l’aide de l’outil panoramique.Utilisez l’outil de zoom pour agrandir ou réduire l’image et l’outil de rotation pour faire pivoter l’image comme vous le souhaitez. Maintenant, cliquez et faites glisser l’axe coloré du premier panneau. Remarquez comment la rotation de cet axe modifie l’orientation des deux autres panneaux.Faites pivoter les trois axes des panneaux jusqu’à ce qu’ils représentent des vues coronales, sagittales et transversales de l’échantillon. Une fois que les trois panneaux sont correctement positionnés, orientés et éclairés, cliquez sur le panneau représentant la vue coronale. Cliquez ensuite sur Exportation de film sur le côté droit de la barre de menus.Cliquez sur batch et faites glisser les curseurs de et vers pour englober toute la région d’intérêt. Pour l’intervalle, sélectionnez l’option identique à l’épaisseur et enregistrez la vidéo en indiquant l’orientation des vues. L’écho montre un septum ventriculaire intact sans shunt intraventriculaire et de grandes artères normales dans le contrôle normal, ce qui a été confirmé par ECM.La vue frontale montre la communication entre LA, RA, LV et RV à la fois dans l’écho et l’ECM, suggérant une communication interau-ventriculaire. Le flux de couleur démontre le flux à travers le BT et le RV indiquant un défaut septal ventriculaire. L’écho et l’ECM ont démontré une double sortie du ventricule droit avec un défaut septal ventriculaire entre le VG et le RV avec de grandes artères côte à côte.Le diagnostic échographique du tronc artériel persistant démontre une communication entre le VG et le RV avec un seul appareil de sortie dominant les deux ventricules, également confirmé par ECM au stade E14.5. Les sections collectées à partir de l’histologie ECM peuvent être traitées ultérieurement pour l’immunomarquage, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et même l’extraction d’acides nucléiques pour le génotypage et le profilage transcriptionnel ou l’extraction de protéines pour l’analyse protéomique. Les images de la reconstruction tridimensionnelle peuvent être traitées ultérieurement pour des évaluations de périmètres quantitatifs tels que la surface ou le volume.Un phénotypage précis pour identifier les défauts de l’anatomie cardiovasculaire est essentiel pour établir des modèles de cardiopathie congénitale génétiquement modifiés et mutants afin d’élucider les mécanismes pathologiques de la cardiopathie congénitale. Cela peut mener à des opportunités potentielles qui développent des thérapies et des interventions pour améliorer les résultats cliniques chez les patients atteints de cardiopathie congénitale.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Mort foetale et périnatale est une caractéristique commune lors de l'étude des altérations génétiques qui affectent le développement cardiaque. L'imagerie ultrasonore haute fréquence a permis d'améliorer la résolution 2-D et peut fournir d'excellents renseignements sur le développement cardiaque précoce et est une méthode idéale pour détecter l'impact sur la structure et la fonction cardiaques avant son décès.

Murin échocardiographie fœtale

Ultra-haute ultrasons de fréquence est un outil d'imagerie en temps réel puissant pour examiner les anomalies cardiaques chez les petits animaux. Son caractère non invasif permet de maintenir l'état physiologique de l'embryon. Ici, nous montrons l'utilisation du mode M ultrasons pour mesurer les taux d'embryons de coeur à -18,5 in utero.

In utero mesure de la fréquence cardiaque chez la souris par M mode non invasive échocardiographie

Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.

Cellule étiquetage et l&#39;injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Les mutations qui conduisent à des malformations cardiaques congénitales bénéficient de l’investigation in vivo de la structure cardiaque au cours du développement, mais les études structurelles à haute résolution dans le cœur embryonnaire de souris sont techniquement difficiles. Nous présentons ici une méthode robuste d’immunofluorescence et d’analyse d’images pour évaluer les structures spécifiques aux cardiomyocytes dans le cœur de souris en développement.

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

Échographie haute fréquence de la souris fœtale s’est améliorée d’imagerie de résolution et peut fournir une caractérisation non invasive précise du développement cardiaque et vices de construction. Le protocole décrit dans les présentes est conçu pour effectuer en temps réel de souris foetales échocardiographie in vivo.

Souris foetale Cardiovascular Imaging à l’aide d’un système à ultrasons de haute fréquence (30 / 45MHZ)

Cette étude utilise une technique de microscopie (LSFM) de fluorescence lumière-feuille recto-verso illumination combinée avec compensation optique pour étudier le coeur murin.

Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour l’étude du coeur murin

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

Dans ce protocole, nous décrivons des procédures pour analyser qualitativement et quantitativement des phénotypes développementaux chez les souris associées aux défauts congénitaux de coeur.

Analyse des malformations cardiaques congénitales chez les embryons de souris à l’aide de méthodes histologiques qualitatives et quantitatives

Ici, nous décrivons un flux de travail corrélatif pour l’excision, la pressurisation, la fixation et l’imagerie de la valve pulmonaire murine afin de déterminer la conformation grossière et les structures de la matrice extracellulaire locale.

Chirurgie et traitement des échantillons pour l’imagerie corrélative de la valve pulmonaire murine

Le présent protocole décrit l’évaluation échocardiographique de la morphologie, de la fonction et du débit sanguin coronaire du ventriculaire gauche chez des souris nouveau-nées âgées de 7 jours.

Caractérisation échocardiographique de la structure, de la fonction et du flux coronaire ventriculaire gauche chez les souris nouveau-nées

Découvrez une méthode complète pour diagnostiquer les cardiopathies congénitales chez la souris fœtale par échocardiographie non invasive, nécropsie et microscopie confocale épiscopique avec reconstruction 3D.

Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale

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