ゼラチンメタクリロイル粒状ヒドロゲル足場:ハイスループットミクロゲル製造、凍結乾燥、化学アセンブリ、および3Dバイオプリンティング

細胞外マトリックスまたはECM数値ヒドロゲル微粒子は、足場製造のためのビルディングブロックとして使用され得る。このプロトコルは、ゼラチンメタクリロイルまたはGelMAヒドロゲル微粒子の製造、精製、凍結乾燥、写真アセンブリ、および3Dバイオプリンティングを実証します。GelMAは、細胞接着性および生分解性部分を含む光化学的、架橋性、タンパク質ベースの生体ポリマーであり、細胞応答性および有益な生体材料として広く使用されている。

従来のバルクヒドロゲルと比較して、GelMA粒状ヒドロゲル足場は微孔性であり、ビルディングブロックサイズによって調整できる迅速な細胞浸潤を可能にします。GelMA粒状ヒドロゲル足場は、安価なプラットフォームと再生工学で厚い組織、臓器、および疾患の3Dバイオプリンティングの新しい機会を開く可能性があります。まず、10ミリグラムのLAPを10ミリリットルのDPBSに加えて、0.1%光開始剤溶液を調製します。

溶液をアルミホイルで包んで光から保護し、ラベルを付けます。次に、光開始剤溶液に所望量のGelMAを溶解する。アルミホイルで包んだ溶液を摂氏37度のオーブンに1時間入れて、透明な溶液を作ります。

油相を調製するには、エンジニアリング液に2%生体適合性界面活性剤溶液を作ります。PDMSデバイスの入口と出口にタイゴンチューブを挿入し、インレット用のタイゴンチューブのもう一方の端に25ゲージの鈍い針を挿入します。デバイスを顕微鏡下に置き、ヘアドライヤーまたはスペースヒーターを使用して摂氏約40度で環境を暖かく保ちます。

水溶液と油溶液を、デバイスに接続された別々のシリンジに入れます。毎分160マイクロリットルの流量で油相用のシリンジポンプを始動します。オイルがチャネルを満たした後、毎分80マイクロリットルで水相を開始します。

顕微鏡で液滴形成を確認します。液滴を容器に回収し、光学顕微鏡イメージングによりイメージングチャンバー内で評価します。液滴を光から保護しながら一晩摂氏4度に保ち、GelMAミクロゲルの物理的架橋を開始し、液滴を安定したミクロゲルに変換します。

マイクロエンジニアリングされたエマルジョンから粉末へのMEtoP法を実施するには、熱的に耐久性のあるマイクロ遠心チューブまたはクライオバイアルを使用して、エンジニアリング流体中の物理的に架橋されたミクロゲルを収集します。開いたチューブを実験室用ワイプとテープで密封します。物理的に架橋されたミクロゲルを液体窒素中で10分間急速凍結し、凍結乾燥を進行させます。

凍結乾燥後、固体粉末が得られるであろう。凍結乾燥粉末に摂氏4度で冷却した0.1%光開始剤溶液1ミリリットルを加えて、ミクロゲル懸濁液を作ります。ボルテックス混合物を3, 000gで15秒間遠心分離します。

上清を廃棄した後、充填したミクロゲル懸濁液を容積式ピペットを用いて型に移し、波長400ナノメートルの光に15ミリワット/平方センチメートルの強度で60秒間さらして、粒状のヒドロゲル足場またはGHSを形成する。400マイクロリットルのミクロゲル懸濁液に対して、物理的に架橋されたGelMAミクロゲルに等量の氷冷PFO溶液、20%インエンジニアリング液を加えます。次いで、ボルテックス混合物を300gで15秒間遠心分離し、ピペッティングによってGelMAミクロゲルから油相を除去する。

次に、400マイクロリットルの氷冷、0.1%光開始剤溶液をミクロゲル懸濁液に加えます。ボルテックス溶液を300gで15秒間遠心分離した後、オイルを廃棄します。光開始剤溶液添加と遠心分離の工程を繰り返すが、今回は3, 000gで遠心分離し、充填したGelMAミクロゲルの上清を廃棄する。

充填したGelMAミクロゲルを型に移し、続いて光露光してGHSを形成する。100ミリグラムのナノプレートレット粉末を3ミリリットルの氷冷超純水に加えて、3.33%ナノ粒子分散液を形成します。4°Cの冷蔵庫内で分散液を15分間激しくボルテックスして、凝集したナノ粒子を剥離します。

適切に剥離されたナノ粒子は、透明な分散液を生成する。50ミリグラムのLAPを5ミリリットルの氷冷超純水に溶解し、1%光開始原液を調製します。次に、剥離したナノ粒子分散液に333マイクロリットルの1%光開始剤溶液を加え、周囲光から保護するためにアルミホイルで包みます。

この混合物を1分間ボルテックスし、ナノ粒子分散液と光開始剤とを混合する。氷冷PFO、20%インエンジニアリング液を物理的に架橋されたGelMAミクロゲルに1対1の体積比で加えます。ボルテックス混合液を300gで15秒間遠心分離した後、界面活性剤を含む油相を廃棄する。

氷冷したLAP添加ナノ粒子分散液を洗浄したGelMAミクロゲルに加えます。3, 000gで15秒間遠心分離した後、底部に残った油分と上澄み液分散液を捨てる。懸濁液を摂氏4度で保管し、アルミホイルを使用して光から1日間保護し、製品GelMAナノエンジニアリング粒状バイオインクまたはNGBを生成します。

翌日、NGBを3ミリリットルのシリンジに入れます。装填したシリンジをキャップとパラフィルムで密封し、200gでパルス遠心分離を行って閉じ込められた空気を取り除きます。雌 - 雌ルアーロックコネクタを使用して、バイオインクを3ミリリットルのカートリッジに移します。

カートリッジを再び200gで短時間遠心分離して閉じ込められた空気を取り除き、NGBを摂氏4度に保ってから使用してください。次に、調製したマウス線維芽細胞懸濁液を3ミリリットルのシリンジに入れる。雌-雌ルアーロックコネクタを使用してNGBとセルロードシリンジを結合し、内容物を40回前後に押して穏やかに混合します。

3ミリリットルのプリントヘッドにノズルをロードすることにより、標準の円錐形ノズルを備えた適切なバイオプリンターを使用してNGBまたは細胞を含んだNGBを印刷します。印刷ベッドの温度を摂氏10度未満に保ち、速度や背圧などのパラメータを最適化します。目的のgcodeまたはSTLファイルを選択します。

次に、標準の円錐形ノズルを備えた空気圧式3ミリリットルシリンジの基板とノズルタイプを選択します。デバイスのガイドラインを使用してバイオプリンターを校正し、印刷を開始して3D構造を取得します。MEtoP技術は、ミクロゲルを凝集や激しい変形から保護しながら、低圧凍結乾燥によって再懸濁可能な乾燥ミクロゲル粉末を生成しました。

SEM画像は、この技術を使用して乾燥したGelMA微粒子が、従来の凍結乾燥で観察された凝集と比較して、凍結乾燥後も球形を保持することを示しました。高分子量蛍光色素を用いたGelMA、GHS、およびNGBのマイクロポア特性評価は、相互接続されたマイクロスケールのボイドスペースを示しました。また、カスタム記述されたMATLABスクリプトを使用して評価された蛍光画像は、細孔を検出しました。

ボイド率と中央細孔等価直径の測定値は、NGBを使用して3Dプリントされた足場のマイクロスケール細孔の可用性と相互接続性を証明する有意差を示さなかった。ハンギングフィラメント長測定により、NGB足場が密集および緩充填されたGelMAミクロゲルに対して優れていることが明らかになり、NGBは充填されたミクロゲルよりも長い長さを有することが明らかになりました。緩く充填されたミクロゲルはフィラメントを生じなかった。

中空のシリンダーを3Dプリントし、構造全体を光架橋のために光にさらしました。印刷された構造は、形状、忠実度、および構造の完全性を示すために物理的に保持されました。足場が生物学的評価に使用される場合、例えば、細胞を含んだバイオプリンティングにおいて、生物学的安全キャビネットの下で、特定の条件下ですべてのステップを実行することを忘れないでください。

私たちは、生物医学における新たに出現した生体材料プラットフォームとしての粒状ヒドロゲル足場の使用を非市場化したいと考えています。