Name: 세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비 방법을 통해 C2C12 근아세포의 증식과 분화를 지원하는 체외 모델을 구축하는 기술을. 선천성 근육병의 발병 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작업은 Association Française contre les Myopathies(AFM-Téléthon, 계약 번호 23049), MATRIHEALTH 프로젝트 및 cE3c 단위 자금 지원 UIDB/00329/2020의 자금 지원을 받았습니다. MATRIHEALTH 프로젝트를 지원하기로 선택한 기부자 Henrique Meirelles에게 감사드립니다. 이 작업은 포르투갈 바이오이미징 플랫폼(PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 참조)의 노드인 과학부 현미경 시설의 인프라를 활용했으며, 이미지 획득 및 처리에 도움을 준 Luís Marques에게 감사드립니다. 마지막으로, 기술 지원에 대해 Marta Palma와 관대 한 기여에 대해 연구팀에 감사드립니다.

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

ECM은 모든 조직에 존재하는 거대분자의 복잡한 네트워크로, 세포 거동과 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다2. ECM은 세포가 부착할 물리적 스캐폴드 역할을 하며 증식, 운동성, 분화 및 세포자멸사와 같은 세포 과정을 능동적으로 조절하는 신호를 제공합니다. 따라서 ECM의 적절한 형성과 유지는 발달과 항상성 모두에 필수적이다1.
2D 세포 배양 모델이 널리 사용되어 왔지만 점점 더 발전된 3D 플랫폼으로 대체되고 있습니다. 이는 2D 배양에는 세포 행동에 영향을 미치는 화학적, 물리적 단서가 부족한 반면, 3D 배양은 천연 조직에서 분자 및 세포 역학을 연구하기 위한 보다 현실적인 대안으로 간주되기 때문입니다11. 조직의 탈세포화는 다양한 조직 또는 기관 시스템에 걸친 다수의 연구에서 입증된 바와 같이 생물학적 조직의 미세 환경을 보다 밀접하게 모...

세포외 기질(ECM)은 조직의 주요 구성 요소로, 비세포 구성 요소를 나타냅니다. 이 3차원(3D) 구조는 세포에 대한 물리적 지지를 제공할 뿐만 아니라 유기체1의 발달과 관련된 생화학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 조직 특이적 ECM의 형성은 다양한 세포 내 및 세포 외 자극의 영향을 받는 세포와 틈새 사이의 복잡한 상호 작용의 결과로 발달 중에 발생합니다. ECM은 시간적-공간적 방식으로 화학적, 기계적 재배열을 거쳐 세포 운명2에 직접적인 영향을 미치는 매우 역동적인 구조입니다. ECM의 가장 주목할만한 특징 중 하나는 기능적 다양성으로, 각 조직 ECM은 ECM이 포함하는 세포에 맞게 조정된 다양한 토폴로지와 특성을 제공하는 고유한 분자 조합을 표시하기 때문입니다1.
ECM 신호전달과 지원은 발달과 항상성에 매우 중요하며, 중단될 경우 여러 병리학적 상태를 유발할 수 있다 3,4. 한 가지 예는 선천성 근이영양증의 가장 흔한 형태인 LAMA2 결핍 선천성 이영양증(LAMA2-CMD)입니다. LAMA2 유전자는 라미닌 211 및 라미닌 221에 존재하는 라미닌 α2 사슬을 암호화하며, 돌연변이되면 LAMA2-CMD 5를 유발할 수 있습니다. 라미닌 211은 골격근 섬유를 둘러싸고 있는 기저막에서 발견되는 주요 동형입니다. 라미닌(211)이 비정상적이거나 부재하는 경우, 기저막과 근육 세포 사이의 연결이 끊어져 질병이 발병하게 된다6. LAMA2-CMD 환자는 LAMA2 유전자의 돌연변이 유형에 따라 경증에서 중증의 표현형을 보입니다.
라미닌 α2 단백질의 기능이 영향을 받으면 환자는 출생 시 심각한 근긴장저하를 경험하고 만성 염증, 섬유증 및 근육 위축이 발생하여 기대 수명이 단축될 수 있습니다. 현재까지 표적 치료법은 개발되지 않았으며 치료적 접근은 질병의 증상을 완화하는 데 국한되어 있다7. 따라서 이 질병의 발병과 관련된 기본 분자 메커니즘을 이해하는 것은 적절한 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다 6,8. LAMA2-CMD의 모델인 dyW 마우스9를 사용한 이전 연구에서는 질병의 발병이 자궁 내에서, 특히 태아 근형성 동안 시작된다는 것을 시사한다10. 태아 근형성 결함이 어떻게 나타나는지에 대한 더 나은 이해는 LAMA2-CMD에 대한 새로운 치료 접근법을 생성하는 게임 체인저가 될 것입니다.
체외 시스템은 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 제어된 환경을 제공하지만, 2D 배양 모델은 천연 조직의 복잡성이 부족합니다. 조직의 탈세포화는 2D 모델 및 엔지니어링/합성 스캐폴드에 비해 자연 세포 미세 환경을 보다 정확하게 모방하는 조직 및 발달 단계별 무세포 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 탈세포화 매트릭스(decellularized matrice, dECM)는 숙주 조직의 분자 및 기계적 신호를 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있어, 생체 내 공정을 이해하기 위한 더 나은 대안 모델이 된다11.
탈세포화(decellularization)를 위해 사용될 수 있는 다양한 기술, 시약 및 조건이 존재한다12,13. 이 연구에서 Silva et al.14,15에 의해 설명된 태아 마우스 심장에 대한 탈세포화 프로토콜은 태아 마우스 골격근에 적용되었으며 테스트된 모든 ECM 구성 요소(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)를 유지하는 것으로 밝혀졌습니다. 프로토콜에는 삼투압 쇼크에 의한 세포 용해(저삼투압 완충액), 원형질막 용해 및 단백질 해리(0.05% 도데실 황산나트륨[SDS]), DNA의 효소 파괴(DNase 처리)의 세 단계가 포함됩니다. 우리가 아는 한, 이것은 마우스 태아 골격근을 탈세포화하기 위해 확립된 최초의 프로토콜입니다.
LAMA2-CMD를 연구하기 위해 이 3D 체외 시스템을 사용하려면 탈세포화 후 라미닌 α2 사슬을 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 다양한 세제(SDS 및 Triton X-100)와 농도(0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% 및 0.5%)를 테스트하는 최적화 프로토콜이 구현되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 라미닌 α2 단백질의 세포 제거 및 보존을 위한 최적의 선택은 0.05% SDS인 것으로 밝혀졌다. 잘 확립된 근원모세포 세포주인 C2C12 세포주16,17을 사용하여 dECM을 시딩했습니다. 이 세포는 dECM을 침범하여 이 스캐폴드 내부에서 증식 및 분화하여 새로운 ECM 단백질을 합성합니다. 이 3D 체외 모델의 성공적인 생산은 태아 근 발생, LAMA2-CMD의 시작과 관련된 분자 및 세포 과정을 이해하는 새로운 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 간의 통신이 중단되는 다른 근육 질환으로 확장될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>12 웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균</td><td>복부 Labware</td><td>P21021</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>Merck</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>48웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균</td><td>복부 실험실</td><td>P21023</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트, 평면, TC, 멸균</td><td>복부 실험실</td><td>P21024</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V</td><td>NZYtech</td><td>MB04601</td><td></td></tr><tr><td>BX60 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM1860 UV</td><td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당 w/ 안정 글루타민 w/ 피루브산 나트륨</td><td>Biowest</td><td>L0103-500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 조직 키트 </td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Biowest</td><td>S1560-500</td><td></td></tr><tr><td>미세 팁 전사 피펫</td><td>ThermoFisher</td><td>15387823</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Biowest</td><td>S2000-100</td><td></td></tr><tr><td>Hera Guard Flow Cabinet</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained Protein Standard</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, New Zealand origin</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- Rabbit IgG</td><td>abcam</td><td>ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- Rat IgG</td><td>abcam</td><td>ab205720</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- 마우스</td><td>IgG abcam</td><td>ab205719</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v. 1.53t</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메틸 그린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67060</td><td></td></tr><tr><td>MM400 Tissue Lyser</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 분광 광도계 </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., 메탄올 프리</td><td>Alfa Aesar</td><td>043368-9M</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(100x) </td><td>GRiSP</td><td>GTC05.0100</td><td></td></tr><tr><td>팔로이딘 Alexa 488 </td><td>Thermo Fisher Sci.</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 페트리 접시 60x15mm 통풍구 (멸균)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 3 형광계</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td></td></tr><tr><td>S6E 줌 실체 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼프로스트&reg; 플러스 접착 슬라이드</td>: <td>Thermo Scientific</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기판</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>15626144</td><td></td></tr>, <tr><td>TCS, SPE 컨포칼 현미경</td>, <td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hidroximetil), aminometano (Tris base) &ge; 99%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28811.295</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)</td><td>GRiSP</td><td>GTC02.0100</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 (50% Solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright PVDF-CL 멤브레인 롤 (0.22&micro; m)</td> <td>Advansta</td><td>L-08024-001</td><td></td></tr> <tr><td>&alpha; - 콜라겐 I</td><td>abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; - 콜라겐 IV</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td></td></tr> <tr><td>&alpha; - 콜라겐 IV</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-398655</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; - Fibronectin</td><td>시그마</td><td>F-3648</td><td></td></tr> <tr><td>&alpha; - 라미닌 &alpha; 2 </td><td>시그마</td><td>L-0663</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MHC</td><td>D.S.H.B.</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-마우스 Alexa 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-마우스 Alexa 568</td><td>분자 프로브</td><td>A11019</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-pan-Laminin</td><td>Sigma</td><td>L-9393</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-phospho-histone 3</td><td>Merk Millipore</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rabbit Alexa 568</td><td>분자 프로브</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rabbit Alexa 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rat Alexa 488</td><td>분자 프로브</td><td>A11006</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3d 탈세포화 매트릭스 준비

Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture

세포외 기질(ECM)은 세포에 대한 구조적 지지를 제공하고 다양한 세포 과정에 중요한 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 합니다. 2차원(2D) 세포 배양 모델은 완전한 3차원(3D) 지지체가 부족하여 세포 거동을 변화시켜 생체 내 공정을 이해하기에 부적절할 수 있기 때문에 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 지나치게 단순화합니다. ECM 구성 및 세포-ECM 상호 작용의 결핍은 다양한 질병의 중요한 원인입니다. 
한 가지 예는 LAMA2-선천성 근이영양증(LAMA2-CMD)이며, 여기서 기능성 라미닌 211 및 221의 부재 또는 감소는 출생 시 또는 출생 직후에 감지할 수 있는 심각한 저조를 유발할 수 있습니다. 이 질환의 마우스 모델을 사용한 이전 연구는 태아 근 발생 중에 발병이 발생한다는 것을 시사합니다. 본 연구는 천연 미세 환경을 모방하여 근육 세포와 태아 근육 ECM 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 3D 시험관 내 모델을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 E18.5 마우스 태아에서 해부된 등 깊은 근육을 사용하여 저삼투압 완충액, 음이온성 세제 및 DNase로 처리합니다. 그 결과 탈세포화 매트릭스(dECM)는 천연 조직과 비교하여 테스트된 모든 ECM 단백질(라미닌 α2, 총 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 콜라겐 IV)을 유지했습니다. 
C2C12 근모세포가 이러한 dECM 위에 시드되었을 때, 그들은 dECM에 침투하여 식민지화하여 증식과 분화를 지원했습니다. 또한, C2C12 세포는 ECM 단백질을 생산하여 dECM 내에서 틈새 시장의 리모델링에 기여했습니다. 이 시험관 내 플랫폼의 구축은 LAMA2-CMD의 발병과 관련된 과정을 밝히기 위한 새로운 유망한 접근 방식을 제공하며 ECM과 골격근 세포 사이의 통신 결함이 질병 진행에 기여하는 다른 골격근 질환에 적응할 가능성이 있습니다.

탈세포화 프로토콜의 목표는 천연 조직의 구성과 매우 유사한 dECM을 생산하는 것입니다. 탈세포화 과정의 효과를 결정하기 위해 조직 형태 검사, DNA 수준 측정, F-액틴 염색, 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅 기술을 사용한 주요 ECM 성분 분석 등 다양한 방법이 사용되었습니다. 구체적으로, 골격근 조직의 5가지 주요 ECM 성분을 분석하였다.
프로토콜 전반에 걸쳐 샘플의 모양이 바뀝니다(그림 1B 1-4). 분리 후 근육 조직은 미오글로빈의 존재로 인해 붉게 나타납니다(그림 1B1). 세포를 용해시키고 대부분의 세포 혈장 단백질을 제거하는 저삼투압 완충액에서 배양한 후 샘플은 흰색으로 변합니다(그림 1B</stro...

이 작업에서, 태아 마우스 골격근의 탈세포화된 매트릭스를 얻기 위해 탈세포화 프로토콜이 최적화되었습니다. C2C12 근모세포는 이러한 매트릭스를 식민지화하고 증식하며 분화할 수 있습니다. 이 시험관 내 모델은 근이영양증과 같은 골격근 질환의 맥락에서 세포 행동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various ...

우리가 아는 한, 이 프로토콜은 태아 골격근에서 탈세포화된 매트릭스를 생성하는 최초의 프로토콜로, 자궁에서 발생하기 시작하는 근병증을 연구하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 통제된 환경에서 근육 세포 행동 및 세포외 기질과의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 발달 및 조직별 메트릭을 생성합니다. LAMA2-CMD는 출생 시 나타나기 시작하는 선천성 근육 이영양증입니다.이 모델은 발병과 관련된 패턴 메커니즘을 밝히고 새로운 표적 요법으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 조직 및 질병 모델에 적용할 수 있습니다. 매트릭스 및 세포 유형에 따라 다양한 복잡성 수준을 달성할 수 있으며, 이는 시스템의 다양성을 보여줍니다.이것은 매우 간단한 프로토콜입니다. 가장 어려운 부분은 샘플의 수집 및 처리입니다. 그러나 연습을 통해 기술을 쉽게 향상시킬 수 있습니다.안락사된 태아를 한 번에 한 마리씩 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮기는 것으로 시작합니다. 피부와 팔다리를 절제 한 후 흉곽의 복부 쪽을 자릅니다. 흉골과 밑에있는 장기를 제거하십시오.태아의 등쪽을 위로 향하게 하고 척추의 경추 부분을 제거합니다. 다음으로, 등쪽 지방 침전물과 깊은 등 근육 결합 조직을 절제하십시오. 이제 수술용 집게를 사용하여 흉곽을 고정합니다.미세 메스로 조심스럽게 긁어 주변 조직에서 깊은 등 근육을 분리합니다. PBS의 조직을 섭씨 4도의 12웰 세포 배양 플레이트에 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다. 더 오랜 기간 동안 섭씨 영하 80도의 빈 미세 원심분리기 튜브에 조직을 보관하십시오.첫날에는 전체 epaxial 근육 덩어리를 사용하십시오. 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 3밀리리터의 저삼투압 완충액을 12웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 근육 조직 단편을 각 웰에 첨가하고 교반하면서 18 시간 동안 밤새 배양한다.둘째 날에는 미세 팁 피펫으로 완충액을 제거합니다. 이제 매번 1 시간 교반하면서 3 밀리리터의 PBS로 샘플을 3 회 세척하십시오. PBS를 버린 후, 교반하면서 24시간 동안 3밀리리터의 0.05% SDS 세제 용액에서 샘플을 배양합니다.셋째 날에는 미세한 팁 피펫을 사용하여 SDS 세제를 제거하고 매번 20분 동안 교반하면서 3밀리리터의 저삼투압 세척 완충액으로 조각을 세 번 세척합니다. 웰의 용액을 2 밀리리터의 DNase 용액으로 교체하고 섭씨 37도에서 교반하면서 3 시간 동안 조직 단편을 배양한다. DNase 용액을 제거한 후, 단편을 매번 20분 동안 교반하면서 3밀리리터의 PBS로 3회 세척하고, 마지막 세척을 밤새 방치한다.subconfluent C2C12 세포로 시드 된 T-25 플라스크에 500 마이크로 리터의 트립신을 첨가하고 1 밀리리터의 완전한 배지에 재현 탁합니다. 현탁액 10 마이크로 리터와 트리판 블루 염료 10 마이크로 리터를 혼합하고 혈구 분석기에로드하여 세포 수를 계산하고 생존력을 추정합니다. 층류 후드에서 탈세포화된 매트릭스 또는 dECM을 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.마이크로 메스와 핀셋을 사용하여 매트릭스를 작은 조각으로 분리하십시오. 파편을 96웰 플레이트의 웰로 옮기고 웰당 3-4개의 조각을 배치합니다. 200 마이크로 리터의 예열 된 완전 배양 배지를 각 웰에 넣고 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양합니다.웰 플레이트에 배지를 버리고 50, 000 개의 생존 가능한 C2C12 세포를 함유하는 완전한 배양 배지 200 마이크로 리터를 각 웰에 첨가한다. 웰 플레이트를 이틀 동안 인큐베이션한다. 세포와 함께 dECM을 400 마이크로리터의 완전한 배양 배지가 들어 있는 48웰 플레이트로 옮깁니다.매트릭스 박리를 방지하기 위해 이틀마다 배지를 조심스럽게 흡인하고 8일째까지 신선한 배지로 보충합니다. 분화를 위해 완전 배양액을 분화 배지로 교체하고 12일까지 4일간 배양한다. 근육 조직은 분리 직후 붉은색을 띠었고 저삼투압 완충액에서 배양한 후 세포 용해로 인해 흰색으로 변했습니다.SDS는 근육을 투명하게 만듭니다. DNase 처리 후, 더 작고 투명한 dECM이 얻어졌다. DNA 정량화는 천연 조직에 비해 dECM이 거의 100% 감소한 것으로 나타났습니다.dECM과 천연 조직은 라미닌 알파 2와 라미닌 단백질에 대해 유사한 관형 염색을 나타냈습니다. 천연 조직의 웨스턴 블롯 분석은 라미닌 알파 2 서브유닛에 대해 2개의 밴드를 표시한 반면, dECM에서 3개의 더 작은 밴드가 검출되었습니다. 총 라미닌의 경우, dECM 샘플은 천연 조직과 비교할 때 단백질 단편화를 보여주었습니다.피브로넥틴과 콜라겐 I은 천연 조직의 세포와 dECM 사이의 간질 공간에 존재했습니다. 유사한 피브로넥틴 밴드가 두 샘플 모두에 존재했으며, 이는 탈세포화의 영향을 받지 않음을 나타냅니다. dECM에서 더 적은 콜라겐 I 밴드가 관찰되었습니다.콜라겐 IV의 경우, 두 샘플 모두 유사한 관형 염색을 나타내었다. 그러나, dECM 밴드의 분자량은 더 낮았다. C2C12 세포는 dECM에서 집락화 및 증식하여 다핵 근관으로 융합되었습니다.이들은 분화 배지에서 4일간의 배양 후에 미오신 중쇄 단백질을 발현시켰다. 세포내 및 세포주위 염색은 라미닌 알파 2쇄, 총 라미닌 및 피브로넥틴에 대해 관찰되었다. 탈세포화된 태아 마우스 골격 스캐폴드는 공동 배양 시스템에서 세포를 성장시키는 데 사용할 수 있으며, 생체 내 상황에 더 가깝게 만들 수 있으므로 근육 질환을 이해하는 데 기여합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 작품은 세부 3D 섬유소의 준비 culturing 및 plutipotent 줄기 세포를 구별을 위해 공사장 공중 발판. 이러한 공사장 공중 발판이 아니라 약물 전달 시스템을 포함하도록 수정으로 줄기 세포의 행동에 대한 다양한 생물 학적 화합물의 효과를 차단하는 데 사용할 수 있습니다.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

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섬유-지방형성 전구세포(FAP)와 근육 줄기세포(MuSC)의 정확한 식별은 생리학적 및 병리학적 조건에서 생물학적 기능을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 근육에서 FAP 및 MuSC의 분리, 정제 및 배양에 대한 지침을 제공합니다.

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확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

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인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

배우세요 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비 방법을 통해 C2C12 근아세포의 증식과 분화를 지원하는 체외 모델을 구축하는 기술을. 선천성 근육병의 발병 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

세포 배양을 위한 태아 마우스 골격근의 3D 탈세포화 매트릭스 준비

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