Name: Identification du type de fibre du muscle squelettique humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez la technique MyDoBID pour isoler des fibres musculaires squelettiques humaines lyophilisées et classifier leurs types par isoformes de chaîne lourde de myosine. Cette méthode permet d'analyser les différences d'expression protéique spécifiques à chaque type de fibre.

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Les anticorps contre le CMH I (A4.840) et le MHCIIa (A4.74) utilisés dans cette étude ont été développés par le Dr H. M. Blau et l’anticorps contre MHCIIx (6H1) a été développé par le Dr C. A. Lucas et obtenu auprès de la Banque d’études sur les hybridomes du développement (DSHB), grâce aux auspices de l’Institut national de la santé de l’enfant et du développement humain et maintenu par l’Université de l’Iowa. Département des sciences biologiques (Iowa City, IA). Nous remercions Victoria L. Wyckelsma d’avoir fourni les échantillons de muscles humains pour cette étude. La majorité des images de la figure 1 proviennent de BioRender.com.
Financement: Cette étude n’a reçu aucun financement externe.

MyDoBID - Une nouvelle technique pour identifier efficacement les types de fibres musculaires

<ol><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), e35273(2012).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+specific+differences+in+the+protein+abundances+of+GAPDH+and+Na%28%2B%29%2CK%28%2B%29-ATPase+in+skeletal+muscle+from+aged+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals.</a> Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).</li>
<li>Morales-Scholz, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-specific+autophagy+responses+following+an+overnight+fast+and+mixed+meal+ingestion+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).</li>
<li>Tripp, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+fibre+type-dependent+nature+of+calcium-handling+protein+responses+to+sprint+interval+exercise+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle.</a> The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).</li>
<li>Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+cell-specific+differences+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).</li>
<li>Murphy, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+skeletal+muscle+calpain-3+by+eccentric+exercise+in+humans+does+not+result+in+its+translocation+to+the+nucleus+or+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).</li>
<li>Murphy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+technique+to+measure+proteins+in+single+segments+of+human+skeletal+muscle+fibers%3A+fiber-type+dependence+of+AMPK-alpha1+and+-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1.</a> Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).</li>
<li>Christiansen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+reliable+and+sample-sparing+method+to+identify+fibre+types+of+single+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).</li>
<li>Skelly, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type-specific+responses+to+sprint+interval+and+moderate-intensity+continuous+exercise%3A+acute+and+training-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes.</a> Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).</li>
<li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).</li>
<li>Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suction+applied+to+a+muscle+biopsy+maximizes+sample+size%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).</li>
<li>Wyckelsma, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+skeletal+muscle+mitochondrial+content+in+older+adults%3A+relationship+between+mitochondria%2C+fibre+type+and+high-intensity+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training.</a> The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).</li>
<li>Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+type+populations+and+Ca2%2B-activation+properties+of+single+fibers+in+soleus+muscles+from+SHR+and+WKY+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).</li>
<li>Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+considerations+for+protein+analyses+using+antibody+based+techniques%3A+down-sizing+Western+blotting+up-sizes+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes.</a> The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Collecte de fibres Sur la base de plusieurs années d’expérience, la plupart des chercheurs peuvent maîtriser cette technique ; Cependant, la pratique permet une collecte plus rapide et plus efficace des fibres pour les analyses en aval. Pour pouvoir isoler 30 segments de fibres simples d’une qualité pour la mise en commun, il est recommandé de prélever 50 segments de fibres par échantillon. Il est recommandé d’étudier attentivement la vidéo de collecte de fibres et après avoir effectué deux séances d’...

Le muscle squelettique est un tissu hétérogène, avec des propriétés métaboliques et contractiles cellulaires distinctes qui dépendent du fait que la cellule (fibre) soit à contraction lente (type I) ou à contraction rapide (type II). Le type de fibre peut être identifié en examinant les isoformes de la chaîne lourde de myosine (CMH), qui diffèrent les unes des autres de plusieurs façons, notamment par le temps de contraction, la vitesse de raccourcissement et la résistance à la fatigue1. Les principales isoformes du CMH comprennent le type I, le type IIa, le type IIb et le type IIx et leurs profils métaboliques sont soit oxydatifs (type I et IIa), soit glycolytiques (IIx, IIb)1. La proportion de ces types de fibres varie selon le type de muscle et d’une espèce à l’autre. Le type IIb est largement présent dans les muscles des rongeurs. Les muscles humains ne contiennent pas de fibres de type IIb et sont principalement constitués de fibres isoformes du CMH de type I et IIa, avec une faible proportion de fibres IIx2. Les profils d’expression des protéines varient selon les différents types de fibres et peuvent être modifiés avec l’âge3, l’exercice 4,5 et la maladie6.
La mesure des réponses cellulaires dans différents types de fibres musculaires squelettiques est souvent négligée ou impossible en raison de l’examen des homogénats musculaires (un mélange de tous les types de fibres). Le western blot à fibre unique permet d’étudier plusieurs protéines dans les fibres musculaires individuelles7. Cette méthodologie a déjà été utilisée pour produire des caractéristiques nouvelles et informatives d’une seule fibre qu’il n’était pas possible d’obtenir en utilisant des préparations homogénatées. Cependant, la méthodologie originale de transfert Western à fibre unique présente certaines limites, notamment la nature chronophage, l’incapacité de générer des répétitions d’échantillons et l’utilisation de réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) coûteux et sensibles. Si des tissus frais sont utilisés, cette méthode est encore plus limitée en raison des contraintes de temps liées à la nécessité d’isoler les fibres individuelles dans un délai limité (c’est-à-dire 1 à 2 h). Heureusement, cette contrainte est atténuée en isolant les segments de fibres simples des tissus lyophilisés8. Cependant, la collecte de fibres à partir d’échantillons lyophilisés est limitée par la taille et la qualité du tissu biopsié.
L’identification du type de fibre à l’aide de la méthode de transfert de points9 a été considérablement élaborée et étendue dans ce protocole complet. Auparavant, il a été démontré qu’aussi peu que ~2-10 mg de tissu musculaire de poids humide est suffisant pour la lyophilisation et l’analyse de la protéine isoforme du CMH à fibre unique9. Christensen et al.9 ont utilisé 30 % d’un segment de fibre de ~1 mm pour détecter l’isoforme du CMH présente par transfert de points, ce qui a été confirmé par transfert Western. Ce travail a montré qu’en remplaçant le western blot par le transfert de points, les coûts globaux étaient réduits de ~40 fois (pour 50 segments de fibres). Les fibres ont ensuite été « regroupées » en échantillons de type I et de type II, ce qui a permis une réplication expérimentale9. Néanmoins, une limite était que seuls deux échantillons spécifiques au type de fibre ont été obtenus : le type I (MHCI positif) et le type II (fibres MHCII positives), les échantillons de type II contenant un mélange de MHCIIa et de MHCIIx 6,10. Notamment, le protocole actuel montre comment les fibres pures de type IIx peuvent être identifiées et fournit un flux de travail très détaillé (résumé dans la figure 1), y compris des stratégies de dépannage pour les problèmes de protocole courants.

<table><tbody><tr><td>1x Tampon dénaturant</td><td>Fabriquer selon la recette</td><td>Les constituants peuvent provenir de Sigma-Aldrich ou d’autres sociétés de distribution de produits chimiques</td><td>&nbsp ; 1x tampon de dénaturation est fabriqué en diluant 3x tampon de dénaturation 1 en 3 v/v avec 1X Tris-HCl (pH 6,8). Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>3x tampon dénaturant</td><td>Fabriquer selon la recette</td><td>Les constituants peuvent provenir de Sigma-Aldrich ou d’autres distributeurs de produits chimiques</td><td>3x tampon dénaturant contient : 0,125M Tris-HCI, 10 % de glycérol, 4 % SDS, 4 M d’urée, 10 % de 2-mercaptoéthanol et 0,001 % de bleu de bromophénol, pH 6,8. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>95 % d’éthanol</td><td>N/A</td><td>100 % d’éthanol peut provenir de n’importe quelle entreprise</td><td>Dilué à 95 % avec du H2O ultra-pur.</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal d’actine de lapin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp ; A2066</td><td>Diluer 1 sur 1 000 avec tampon BSA.</td></tr><tr><td>Balances analytiques</td><td>Mettler Toledo</td><td>Numéro de modèle : MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur d’anticorps</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>Le nom du produit est Miser Extender d’anticorps Solution NC.</td></tr><tr><td>Bécher (100 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Nom du modèle : Mini Spin.</td></tr><tr><td>Tampon de blocage : 5 % de lait écrémé dans le tampon de lavage.</td><td>Tampon</td> BSA <td>acheté par</td><td></td>Diploma Store</tr><tr><td>: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3</td><td>BSA : Sigma-Aldrich&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; PBS : Laboratoires Bio-Rad. NaN3  : Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>BSA : A6003-25G&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 10x PBS : 1610780 &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; NaN3 : S2002</td><td>Albumine sérique bovine (BSA), solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et azoture de sodium (NaN3). Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Levier d’ouverture de la cassette</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>Utilisé pour ouvrir les cassettes de gel préfabriqué.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Numéro de modèle : Capot universel III</td><td>Tout système d’imagerie doté de capacités d’imagerie en gel sans taches.</td></tr><tr><td>Buvard Criterion</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>Comprend un sac de glace, un plateau de transfert, un rouleau, 2 porte-cassettes, du papier filtre, des tampons en mousse et un couvercle avec câbles.</td></tr><tr><td>Cellule Critère (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (chimiluminescence améliorée)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>Nom du produit : Substrat Clarity Max Western ECL.</td></tr><tr><td>Tampon d’électrophorèse 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>Diluer 10x TGS 1 sur 10 avec du H2O ultra-pur.</td></tr><tr><td>Papier filtre, 0,34 mm d’épaisseur</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>En vrac 3 MM, paquet de 100 feuilles, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>Pince à disséquer les tissus fins</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Bijouterie S Forceps n° 5.</td></tr><tr><td>Barquette/couvercle plat en plastique&nbsp ; &nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Assez grand pour y placer la membrane. Assurez-vous que la surface est complètement plane.</td></tr><tr><td>Système de lyophilisation</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4,5 L avec étage d’échantillonnage en chambre en verre.</td></tr><tr><td>Congélateur -80 oC&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tout congélateur avec une température constante de -80 &deg ; C convient.</td></tr><tr><td>Libérateurs de gel</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Glissez-vous sous la membrane pour rassembler ou déplacer la membrane.</td></tr><tr><td>Crayon mine gris</td><td>N/A N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>&NBSP ; Logiciel de laboratoire d’imagerie&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>Figures fait référence à la version 5.2.1 du logiciel mais d’autres versions peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1660521</td><td>Tout incubateur pouvant être réglé sur 37 &deg ; C suffirait.</td></tr><tr><td>Lampe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique avec puce</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rouleau à membrane&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>peut être acheté dans le pack Transfert. Cependant, si ce produit n’est pas disponible, n’importe quel tube cylindrique à surface lisse suffisamment long pour rouler sur la membrane suffirait.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation&nbsp ; (0,6 ml)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IgG de souris HRP secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L), RRID AB_228341. Diluer à 1 sur 20 000 dans un tampon de blocage.</td></tr><tr><td>Souris IgM HRP secondaire</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Chèvre Anti-souris IgM mu chaîne. Utiliser à la même dilution que les IgG de souris.</td></tr><tr><td>Anticorps primaire de la myosine à chaîne lourde I (MHCI)</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp ;</td><td>Plage de dilution : 1 sur 200 à 1 sur 500 en tampon BSA.</td></tr><tr><td>Anticorps primaire de la myosine à chaîne lourde IIa (MHCIIa)</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp ;</td><td>Plage de dilution : 1 sur 200 à 1 sur 500 en tampon BSA.</td></tr><tr><td>Anticorps primaire de la myosine à chaîne lourde IIx (MHCIIx)</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>Plage de dilution : 1 sur 200 à 1 sur 500 dans le tampon BSA.</td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique 0,45 & micro ; m&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620115</td><td>pour le western blot.</td></tr><tr><td>Couvercle de boîte de Pétri</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler en plastique</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bloc d’alimentation&nbsp ;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>164-5050 Nom du</td><td>produit : Alimentation de base.</td></tr><tr><td>Échelle protéique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Échelle protéique précolorée, 10 à 180 kDa.</td></tr><tr><td>Membrane PVDF 0.2 &micro ; m</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HRP secondaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>Chèvre anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution identique à celle des anticorps secondaires de souris.</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Règle</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Scisseaux</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de décapage</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>Nom du produit : Restore Western Blot Stripping Buffer.</td></tr><tr><td>Mouchoir en papier (non pelucheux)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>Nom du produit : Kimwipe.</td></tr><tr><td>Tampon de transfert (1x tampon Tris Glycine (TG), 20 % Méthanol)</td><td>TG : Bio-Rad Laboratories&nbsp ; &nbsp ; Méthanol : Tampon Merck</td><td>TG : 1610771 &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Méthanol : 1,06018</td><td>diluer 10x TG tampon avec H2O ultra-pur à 1x. Ajouter 100 % de méthanol à une concentration finale de 20 % de méthanol. Conserver à 4 °C.</td></tr><tr><td>Plateau de transfert</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Gel préfabriqué à activation UV</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>Type de gel : 4&ndash ; 15 % Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 puits, 15 & micro ;L.</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage (1x TBST)</td><td>10x TBS : Astral Scientific&nbsp ; Préadolescent 20 : Sigma</td><td>&nbsp ; BIOA0027-4L</td><td>1x recette TBST : 10x solution saline tamponnée au Tris (TBS) est diluée à 1x avec du H2O ultra-pur, Tween 20 est ajouté à une concentration finale de 0,1 %. Stockez la mémoire tampon à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td></td><td>N’importe</td><td></td><td>quel récipient tupperware, adapté aux dimensions approximatives de la membrane, suffirait.</td></tr></tbody></table>

identification du type de fibre du muscle squelettique humain

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

La technique décrite ici peut être utilisée pour identifier des isoformes spécifiques de la chaîne lourde de myosine (CMH) dans des segments de fibres musculaires individuelles à l’aide du transfert de points, ci-après dénommé détection de la chaîne lourde de l’osine par lotting Dot Bpour l’identificationdu type defibre musculaire (MyDoBID). Ce protocole décrit le processus de lyophilisation des muscles squelettiques humains et l’isolement de segments de fibres musculaires individuelles. À l’aide de MyDoBID, les fibres de type I et II sont classées avec des anticorps spécifiques de l’ICM et de l’IIa, respectivement. Les fibres classées sont ensuite combinées dans des échantillons spécifiques au type de fibre pour chaque biopsie.
La protéine totale dans chaque échantillon est déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et par la technologie de gel activé par les UV. Le type de fibre des échantillons est validé à l’aide du Western Blot. L’importance d’effectuer la normalisation de la charge protéique pour améliorer la détection des protéines cibles sur plusieurs Western blots est également décrite. Les avantages de la consolidation des fibres classées dans des échantillons spécifiques au type de fibre par rapport aux Western Blots à fibre unique comprennent la polyvalence des échantillons, l’augmentation du débit des échantillons, la réduction de l’investissement en temps et les mesures d’économie, tout en conservant des informations précieuses spécifiques au type de fibre qui sont souvent négligées à l’aide d’échantillons musculaires homogénéisés. L’objectif du protocole est d’obtenir une identification précise et efficace des fibres de type I et de type II isolées à partir d’échantillons de muscles squelettiques humains lyophilisés.
Ces fibres individuelles sont ensuite combinées pour créer des échantillons spécifiques au type de fibre de type I et de type II. De plus, le protocole est étendu pour inclure l’identification des fibres de type IIx, en utilisant l’actine comme marqueur pour les fibres qui étaient négatives pour MHCI et MHCIIa, qui sont confirmées comme des fibres IIx par western blot. Chaque échantillon spécifique au type de fibre est ensuite utilisé pour quantifier l’expression de diverses protéines cibles à l’aide de techniques de transfert Western.

Identification des fibres musculaires MHCI, MHCIIa et MHCIIx individuelles à l’aide du transfert de points L’une des caractéristiques de MyDoBID est la catégorisation de l’intensité variable du signal MHC et de l’actine dans une fibre donnée (Figure 4A). Le type de fibre a été identifié par la présence ou l’absence d’isoformes MHCI et IIa (Figure 4B). Six fibres n’ont montré aucune détection de CMH ou d’actine, ce qui indique qu’aucune fibre ...

Ce protocole démontre l’isolement d’une seule fibre à partir de muscles squelettiques humains lyophilisés et la classification du type de fibre selon l’isoforme de la chaîne lourde de myosine (CMH) à l’aide de la technique de transfert de points. Les échantillons de fibres CMH I et II identifiés peuvent ensuite être analysés plus en détail pour détecter les différences spécifiques au type de fibre dans l’expression des protéines à l’aide du transfert Western.

Identification du type de fibre du muscle squelettique humain

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Nos recherches sont centrées sur le muscle squelettique, qui est composé de cellules aux propriétés métaboliques et contractiles distinctives, caractérisées par des fibres à contraction lente ou rapide. Nous nous penchons sur les facteurs qui contribuent à ces différences et explorons leurs implications dans le contexte du vieillissement, de l’exercice et de diverses maladies. La mesure des réponses cellulaires dans différentes fibres musculaires squelettiques est souvent négligée, voire impossible en raison de l’examen des homogénats musculaires.La technique MyDoBID nous permet d’analyser de manière répétée les différences de protéines de type fibre qui étaient auparavant impossibles à mesurer. Ce protocole identifie avec précision et efficacité les fibres musculaires de type 1 et de type 2 à partir d’échantillons de muscles squelettiques humains lyophilisés. Cette méthode récemment révisée offre aux chercheurs une approche simple pour étudier les différences protéiques dans le muscle squelettique au niveau cellulaire.Notamment, il facilite l’identification des fibres X de type deux, et celles-ci ont toujours été difficiles à distinguer. La technique permet aux chercheurs de faire la lumière sur tous les types de fibres, y compris l’insaisissable fibre X de type deux. Grâce à la technique MyDoBID, il est désormais possible de répondre à de nombreuses questions.Par exemple, on peut découvrir les propriétés des fibres musculaires X de type 2 et déterminer s’il existe des preuves indiquant une atrophie préférentielle des fibres musculaires X de type 2 au cours du vieillissement ou de la maladie. On peut également observer l’impact d’une intervention d’exercice spécifique sur chaque type de fibre.

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Nous présentons ici un protocole d'analyse des fibres musculaires rapides, ce qui permet une meilleure qualité de coloration, et ainsi l'acquisition automatique et la quantification des populations de fibres à l'aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement.

Un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Marquage immunohistochimique des isoformes de la chaîne lourde de myosine a émergé comme le discriminant de l’état-of-the-art des fibres musculaires squelettiques de type (c'est-à-direde type I, type IIA, tapez IIX, type IIB). Nous présentons ici un protocole de coloration avec un nouvel algorithme semi automatisé qui facilite l’évaluation rapide de la morphologie de type fibre et fibre.

Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type

Ce rapport technique décrit une variation de la technique modifiée de Bergström pour la biopsie du tibialis de musculus antérieur qui limite les dommages de fibre.

Collection de biopsies musculaires squelettiques du compartiment supérieur du musculus humain tibialis antérieur pour l’évaluation mécanique

La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier

De plus en plus de preuves indiquent qu’une infiltration excessive de lipides à l’intérieur du muscle squelettique entraîne une lipotoxicité et un diabète. Ici, nous présentons un protocole complet, y compris le traitement des tissus, la coloration avec Bodipy, l’acquisition d’images et l’analyse, pour quantifier la taille, la densité et la distribution subcellulaire des gouttelettes lipidiques d’une manière spécifique au type de fibre.

Analyse du type de fibre et de la teneur en gouttelettes lipidiques dans le muscle squelettique

Nous décrivons un protocole pour obtenir des fibres dissociées enzymatiquement de différentes longueurs et types à partir de six muscles de souris adultes : trois d’entre eux déjà décrits (fléchisseur des doigts court, extenseur des doigts long, soléaire) et trois d’entre eux dissociés avec succès pour la première fois (extenseur de l’hallucis long, péronier long, péronier des doigts quarti).

Fibres musculaires squelettiques courtes, intermédiaires et longues intactes obtenues par dissociation enzymatique de six muscles des membres postérieurs de souris : au-delà du fléchisseur digitorum brevis

Ce protocole décrit l’isolement des fibres musculaires uniques intactes du solèus oxydatif et l’établissement de cultures de myoblast hautement purifiées dérivées de ces fibres. La procédure optimisée permet de fournir de manière fiable environ 300 à 500 myofibres intactes par souris, permettant des analyses moléculaires et cellulaires en aval.

Essai d’isolation à fibre unique pour l’évaluation du comportement des myofibres oxydatives

Un protocole de synthèse de peptoïdes à fonctionnalité cationique mixte dans la même séquence est présenté (monomères de type lysine et arginine). Des essais ultérieurs de ces composés contre Leishmania mexicana, les parasites protozoaires qui causent la leishmaniose cutanée, sont également décrits.

Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l&#39;évaluation de leur activité anti-leishmaniose

Nous proposons un protocole permettant d’identifier les acides gras sans avoir besoin de les purifier. Il combine des informations sur les temps de rétention avec les spectres de masse de trois types de dérivés d’acides gras : les esters méthyliques d’acides gras (FAME), les dérivés de 4,4-diméthyloxazoline (DMOX) et les esters de 3-pyridylcarbinyle (picolinyl).

Identification des acides gras dans<em&gt; Bacillus cereus</em

Les auteurs décrivent un protocole pour identifier des protéines de liaison à l’ARN et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN dans des cellules vivantes psoralen médiée par les UV et spectrométrie de masse.

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Découvrez la technique MyDoBID pour isoler des fibres musculaires squelettiques humaines lyophilisées et classifier leurs types par isoformes de chaîne lourde de myosine. Cette méthode permet d'analyser les différences d'expression protéique spécifiques à chaque type de fibre.

Identification du type de fibre du muscle squelettique humain

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