Name: Culture à long terme de coupes organotypiques de moelle épinière de souris comme plate-forme de validation de la transplantation cellulaire dans les lésions de la moelle épinière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez une méthode de culture à long terme de coupes organotypiques de moelle épinière pour valider les thérapies cellulaires. Ce modèle ex vivo améliore la survie et la maturation des cellules souches neuronales greffées.

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L’étude a été soutenue par la Fondation Wings for Life (WFL-IT-20/21), le plan national pour la reprise et la résilience (NRRP) de l’Union européenne Next-Generation EU-mission 4 composante 2, l’investissement n° 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8) et Marina Romoli Onlus. Ce manuscrit ne reflète que les points de vue et opinions des auteurs, ni l’Union européenne ni la Commission européenne ne peuvent en être tenus responsables. Les données et les métadonnées sont disponibles sur Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Les images ont été générées avec Biorender https://www.biorender.com/.

Greffe à long terme de cellules h-SC-NES dans des cultures organotypiques de moelle épinière

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Il n’existe toujours pas de traitement efficace pour les patients atteints de LME. Différentes approches ont été testées et l’une des plus prometteuses est basée sur une stratégie régénérative de remplacement cellulaire. À l’heure actuelle, les progrès dans le domaine de la médecine régénérative nécessitent de nouvelles plateformes pour tester l’efficacité et l’innocuité des greffes de cellules, seules ou en combinaison avec d’autres approches. Leur validation préclinique est essentielle pour poursuivre les études cliniques. Les cultures organotypiques SC constituent une plate-forme utile pour étudier différents aspects de la neurodégénérescence, de la régénération neuronale et du neurodéveloppement, et pour étudier l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques23. En particulier, des caractéristiques spécifiques des cultures organotypiques telles que le maintien de l’histoarchitecture originale et de la composition cellulaire et microenvironnementale sont avantageuses pour démêler la dynamique de la transplantation, telle que la greffe, l’intégration, la différenciation et la maturation cellulaires.
Conformément aux protocoles publiés, les coupes organotypiques SC peuvent être maintenues en culture pendant environ 2 à 3 semaines dans des conditions saines, ce qui limite leur utilisation pour les investigations à long terme et le dépistage fonctionnel requis pour tester les schémas de thérapie cellulaire. L’exploration de processus importants tels que la différenciation et la maturation vers le destin correct des cellules transplantées à l’intérieur du tissu SC nécessite une surveillance à long terme. Ces processus cellulaires sont essentiels lors des greffes courantes dans les modèles animaux. La disponibilité d’un système ex vivo qui imite de nombreuses caractéristiques présentes in vivo serait utile dans la phase de dépistage préclinique.
Pour cette raison, dans ce travail, nous proposons une méthode de culture organotypique SC optimale à long terme (≥30 jours) qui permet de maintenir des tranches SC viables jusqu’à 90 jours, triplant ainsi leur délai de culture habituel. De plus, nous montrons une greffe stable de cellules h-SC-NES à l’intérieur des tranches SC et le maintien de la culture de transplantation jusqu’à 30 jours. Nous avons suivi l’enracinement cellulaire au fil du temps en observant l’expression de la GFP pour vérifier la survie cellulaire jusqu’à DPT 30. Après 30 DPT, nous avons évalué le taux d’apoptose cellulaire. Dans la littérature, l’évaluation de l’apoptose des cellules h-SC-NES transplantées dans des coupes SC à 7 DPT a été rapportée40. Ici, nous avons étendu l’analyse de l’apoptose cellulaire à DPT 30 pour comparer le taux d’apoptose par rapport au point temporel précédent (DPT 7). Nous avons découvert que nos données sont conformes à la littérature, ce qui suggère que les cellules h-SC-NES transplantées survivent également à un moment ultérieur si elles sont maintenues dans les conditions de culture optimisées dans notre travail. Cette plateforme ex vivo améliorée à long terme, seule et dans la configuration de la transplantation, aidera les chercheurs dans le dépistage préclinique des greffes de cellules souches pour les lésions médullaires. Cela leur permettra d’identifier la meilleure cellule candidate pour d’autres études in vivo favorisant le succès des greffes. De plus, après un criblage initial, les coupes organotypiques SC pourraient également être utilisées en parallèle des études in vivo pour confirmer et corroborer la dynamique cellulaire à long terme et les comportements observés dans les modèles animaux ou pour soutenir les études mécanistes.
Notre protocole décrit en détail comment générer ce modèle organotypique à long terme, mais certaines étapes critiques doivent également être discutées. En ce qui concerne la génération des cultures organotypiques SC, il y a quelques défis lors de la chirurgie et des premières étapes de la culture. Une intervention chirurgicale bien réalisée est essentielle pour générer des coupes qui maintiennent l’histoarchitecture d’origine. Si le SC est ruiné pendant l’isolement, les tranches peuvent perdre leur structure anatomique typique et des lésions tissulaires peuvent induire une agression pro-inflammatoire excessive entraînant des conditions malsaines et la mort cellulaire. La phase la plus difficile de la chirurgie est l’extraction du SC de la colonne vertébrale et l’ablation des méninges du SC isolé. La réussite de ces étapes dépend de l’expérience de l’opérateur ; Par conséquent, une période de formation avant de commencer les expériences est recommandée.
La section coronale du SC à travers un hacheur est également une phase difficile. Le SC isolé doit être placé sur le plateau de coupe exactement perpendiculairement à la lame. L’opérateur doit également placer la lame perpendiculairement au plateau de coupe. Ces précautions sont nécessaires pour assurer la génération de coupes reproductibles entre les mêmes expériences et les différentes expériences. Un autre point important est que le temps de l’opération est limité : l’ensemble de la procédure de génération de tranches doit prendre ~30 min. Si l’opérateur passe plus de temps sur la chirurgie et la coupe, le tissu SC en souffrira, ce qui peut nuire au succès de la culture et aux prochaines étapes de l’expérience.
Une fois les tranches placées sur la membrane de culture, il est important de les nourrir correctement. Le GDNF est nécessaire pour soutenir la récupération et la survie des tissus. La coupe avec un hachoir est traumatisante pour le tissu et, pour cette raison, les tranches sont placées peu de temps après la coupe dans un milieu de dissection glacé pour nettoyer l’excès de molécules pro-inflammatoires et favorisant la mort. Ensuite, les tranches sont placées sur les membranes de culture (inserts de culture cellulaire) avec un milieu frais modifié avec du GDNF pour favoriser une récupération plus rapide et une adhésion de la tranche à la membrane. Le GDNF doit être ajouté au milieu tous les jours pendant la première semaine de culture en raison de sa courte demi-vie50,51. Nous avons observé que les tranches ont besoin de la présence continue de GDNF pendant les premiers jours de culture pour favoriser la récupération et la viabilité des tissus. Dans tous les cas, comme la présence de GDNF est importante pendant toute la période de culture, il est fortement déconseillé d’interrompre l’administration de GDNF à d’autres moments.
Au cours de la première semaine de culture, il est également important de vérifier les coupes macroscopiquement à l’œil nu et au microscope. Le tissu translucide et la transparence des bords sont des signes de bonne adhérence des tranches à la membrane et de tissu viable. Le tissu nécrotique apparaîtra extrêmement blanc à la première vue macroscopique et les zones nécrotiques apparaîtront gris foncé au microscope. Après quelques semaines de culture, la morphologie des tissus peut changer : les mouvements cellulaires et l’adhésion des tissus à la membrane peuvent influencer ce processus. Nous avons observé, par exemple, la perte de la lumière centrale dans certaines tranches remplies de cellules et la perte de la morphologie de la corne dorsale et ventrale. Cela se produit principalement avec des tranches plus petites, alors que la plupart d’entre elles conserveront une structure anatomique proche de celle d’origine. Les coupes sont généralement générées à partir des régions lombaires ou thoraciques, car de cette façon, elles peuvent avoir la taille appropriée pour maintenir leur histoarchitecture d’origine dans le temps : si elles sont trop petites, elles perdent leur architecture tandis que, si elles sont trop grandes, la région centrale peut subir une nécrose. Ainsi, nous avons utilisé la région lombaire des petits de souris pour générer des tranches de la taille appropriée pour une culture optimale à long terme, mais, en principe, d’autres segments peuvent être envisagés. De plus, nous avons choisi d’utiliser la région lombaire, car les régions ventrale et dorsale sont plus distinctes l’une de l’autre. De plus, cette région présente des zones tissulaires avec un pourcentage plus élevé de motoneurones et de matière grise, qui sont des sites d’intérêt pour les thérapies de remplacement cellulaire dans les LME. En ce qui concerne la transplantation de cellules dans les tranches, le principal problème est lié à la rupture de la pointe de la micro-aiguille de verre. Si le trou pour le passage des cellules est trop grand, il peut endommager le tissu SC lors de la microinjection. S’il est trop petit, l’empilement de cellules peut obstruer l’aiguille, entravant le processus de transplantation. La procédure de transplantation doit être terminée dans un délai de 1 h pour minimiser la souffrance et la mort des cellules.
Le protocole proposé fournit un outil optimal et polyvalent pour différents types d’enquêtes. Ici, nous appliquons notre plateforme à long terme pour valider la transplantation de cellules h-SC-NES aux premiers stades de la différenciation à l’intérieur du tissu SC de souris pendant 30 jours. La principale nouveauté de l’approche proposée est l’optimisation du protocole de co-culture. Les composants de GM maintiennent la survie neuronale à long terme des tranches SC et des cellules h-SC-NES transplantées. En effet, la GM, étant un milieu sans sérum, soutient la différenciation des cellules transplantées vers le destin neuronal par rapport au milieu précédemment utilisé pour la culture en tranches organotypiques47.
En ce qui concerne les modèles proposés pour les lésions médullaires, les expériences sont généralement réalisées sur des souris adultes. Jusqu’à présent, les différences les plus importantes entre les cellules souches néonatales et adultes sont liées au potentiel de régénération plus élevé observé chez les souris néonatales par rapport aux souris adultes52. Cependant, ces différences n’ont pas d’impact sur le type de protocole que nous proposons, car nous nous concentrons ici sur la réponse des cellules greffées à l’environnement du tissu hôte plutôt qu’aux capacités de régénération des neurones résidents. Une autre différence entre les souris néonatales et adultes après une lésion médullaire est liée à la formation de la cicatrice gliale qui se produit chez les adultes. Cet aspect n’est pas pris en compte dans le modèle proposé, qui ne prend pas en compte les processus physiopathologiques complexes résultant de lésions primaires et secondaires.
En ce qui concerne les applications, la plateforme pourrait également être utilisée pour étudier l’intégration entre les cellules transplantées et les circuits résidents présents dans le modèle organotypique SC. Des outils de génie génétique étaient déjà utilisés dans le SNC pour évaluer la connectivité synaptique et pouvaient être exploités à cet égard 53,54,55. En particulier, l’intégration pourrait être étudiée et validée en évaluant la formation de synapses entre les cellules greffées et le tissu SC ex vivo. Ces cultures organotypiques à long terme pourraient également être exploitées pour tester des agents neuroprotecteurs et neurorégénératifs ou de nouvelles molécules/matériaux ou pour étudier des troubles neurodégénératifs impliquant le CS. Pour étudier des troubles neurodégénératifs spécifiques, le protocole doit être adapté à la culture de coupes SC générées à partir de modèles pertinents, tels que des souris transgéniques porteuses de mutations spécifiques associées à une pathologie, au stade pertinent de la pathologie (c’est-à-dire néonatale, juvénile, adulte). En conclusion, notre protocole et les cultures organotypiques en général, étant des explants d’un organe spécifique, présentent des caractéristiques qui comblent le fossé entre les cultures cellulaires 2D et les modèles in vivo, les confirmant comme un outil inestimable pour la recherche fondamentale et les essais précliniques.

Les lésions traumatiques de la moelle épinière (LME) ont des conséquences physiques, psychologiques et économiques dévastatrices pour les patients et les soignants1. De nombreuses tentatives ont été faites pour favoriser la régénération axonale dans les lésions médullaires avec différentes approches 2,3,4 et certains effets bénéfiques ont été démontrés par la formation de relais neuronaux entre les neurones proximaux et distaux dans le site de la lésion par le biais de thérapies de remplacement cellulaire. L’intérêt pour les thérapies cellulaires ne cessede croître 5 car les cellules transplantées peuvent jouer de nombreux rôles, notamment en fournissant un soutien trophique, une modulation immunitaire, en régénérant les circuits neuronaux perdus par induction de la plasticité, en remplaçant les cellules et en remyélinisant des axones6.
Récemment, l’effort principal dans le domaine s’est concentré sur les cellules souches/progénitrices neurales humaines (NSC/NPC)7. Plusieurs études suggèrent que les NSC/NPC modulent la réponse astrocytaire8, favorisent la sécrétion de facteurs prorégénératifs 9,10 et remplacent les cellules neuronales manquantes dans les lésions médullaires11,12. Cependant, les études qui soutiennent la différenciation des cellules transplantées en neurones fonctionnels sont encore médiocres. De plus, la survie et la différenciation des cellules transplantées dans la moelle épinière lésée (SC) sont faibles13, peut-être parce que les cellules transplantées mettent plusieurs semaines, voire des mois, à se différencier in vivo. De plus, les études actuelles n’ont pas complètement élucidé de nombreux aspects biochimiques, moléculaires, cellulaires et fonctionnels des thérapies de remplacement cellulaire. Dans ce contexte, des modèles simples, rapides et rentables sont nécessaires pour étudier les mécanismes de la greffe cellulaire, la capacité des cellules greffées à proliférer, à se différencier en types spécifiques ou sous-populations de cellules et à former des synapses avec les neurones résidents.
L’intégration des études histologiques dans l’enregistrement électrophysiologique et le profilage du transcriptome et du protéome est nécessaire pour une compréhension complète de la cascade moléculaire qui se produit après la greffe de cellule. Cela accélérera certainement la conception et la validation de nouvelles thérapies de remplacement cellulaire dans des modèles précliniques et des études cliniques. En effet, à ce jour, l’utilisation de rongeurs, de grands animaux et de primates non humains a permis d’élucider de nombreux processus cellulaires après transplantation14. Cependant, en raison de leur coût élevé, de leur impact éthique élevé et de la complexité de l’organisme, leur utilisation n’est souvent pas simple ou insuffisante pour démêler les processus biochimiques et moléculaires. De plus, ils peuvent présenter de nombreux inconvénients corrélés à des différences biologiques, à la fois inter-espèces (métabolisme) et intra-espèces (sexe, âge).  Ces facteurs, ainsi que des facteurs externes tels que des situations stressantes, pourraient modifier le résultat d’une expérience et leur prévisibilité en termes d’application thérapeutique chez l’homme 15,16,17.
Ainsi, de nombreux groupes utilisent la culture cellulaire in vitro 2D et des coupes organotypiques ex vivo (cultures ex vivo) en plus des modèles animaux. La culture cellulaire 2D est le système le plus couramment utilisé pour étudier des processus biologiques spécifiques au niveau d’une cellule unique et/ou d’une population cellulaire. Néanmoins, les cultures cellulaires monocouches ne reflètent pas la complexité que l’on trouve dans un organisme entier. L’absence de structures tissulaires et d’environnement physiologique ne permet pas aux systèmes de culture 2D d’imiter complètement les principaux aspects structurels, morphologiques et fonctionnels des tissus étudiés 18,19,20.Les cultures organotypiques peuvent surmonter certains de ces problèmes. Les modèles organotypiques sont basés sur l’explantation d’un fragment d’un tissu ou d’un organe et son maintien ex vivo pendant une période limitée21,22. En particulier, des tranches de tissu explanté sont générées avec une épaisseur précise qui permet aux nutriments d’atteindre facilement presque toutes les cellules des tranches. Ils peuvent être générés à partir de diverses régions du système nerveux central, telles que l’hippocampe, l’hypothalamus, le cervelet, le thalamus, le cortex cérébral, la substance noire et le striatum, et la moelle épinière23. Les cultures organotypiques conservent l’architecture tissulaire, la distribution spatiale des cellules, la diversité cellulaire et l’environnement (c’est-à-dire la composition de la matrice extracellulaire) de l’organe d’origine. De plus, ils préservent l’activité neuronale d’origine, les connexions entre les cellules, et en particulier, les circuits à courte distance après l’explantation.
Ces aspects offrent certains avantages pour les cultures ex vivo par rapport aux cultures monocouches et aux modèles animaux. Ils conservent les principales caractéristiques tissulaires trouvées in vivo, mais avec la réduction des coûts et la possibilité de réaliser différents types d’expériences moléculaires, cellulaires et fonctionnelles avec une régulation précise des paramètres environnementaux de la culture 24,25,26,27,28,29. Les coupes organotypiques peuvent également être exploitées pour développer des modèles pour différents troubles neurologiques en ressemblant à des caractéristiques histopathologiques clés de conditions spécifiques30. De plus, la conservation de l’environnement tissulaire multicellulaire d’origine en fait des plateformes appropriées pour le criblage de médicaments et pour tester des molécules et des matériaux neuroprotecteurs et neuro-régénératifs.
Dans ce travail, nous proposons l’utilisation de cultures organotypiques SC comme modèle pour optimiser les greffes de NSC. Ce n’est pas anodin puisque des conditions de culture optimales sont nécessaires pour garantir la survie de l’hôte (tissu SC) et de la greffe (CSN) pendant des semaines. Différents groupes de recherche greffés dans des cultures organotypiques, dérivées du cerveau et dérivées de SC, divers types de cellules. La plupart des travaux ont montré la transplantation de cellules souches mésenchymateuses31,32,33, de cellules olfactives34, ou NSCs 35,36,37,38,39,40 et ont évalué les interactions des cellules greffées avec les cellules hôtes, la survie de l’ensemble du système et si les cellules transplantées se différenciaient en neurones ou en cellules neuronales à l’intérieur de l’environnement tissulaire ex vivo 32,33,41. Certains d’entre eux ont évalué le potentiel de régénération des cellules après la greffe, en observant leur croissance axonale à l’intérieur du tissu 37,40,41, la capacité myélinisante des précurseurs greffés d’oligodendrocytes 42, la migration des cellules greffées dans le tissu hôte43, et si les cellules transplantées libéraient des facteurs poussant vers un environnement prorégénératif31. L’une des limites des études actuelles est qu’elles n’explorent pas la greffe sur une période à long terme.
Étant donné que les NSC semblent nécessiter plusieurs semaines pour se différencier in vivo44,45, cette étude se concentre sur la façon de générer et de maintenir à long terme (≥30 jours) des tranches de CS de souris jusqu’à 90 jours. On a constaté que les coupes conservaient leur structure anatomique d’origine et maintenaient un taux d’apoptose faible et stable au fil du temps et une viabilité cellulaire élevée. Nous avons observé une expression diffuse des marqueurs neuronaux de liaison à l’ARN fox-1 homologue 3 (RBFOX3) et de la chaîne légère des neurofilaments (NFL), ces dernières montrant une tendance croissante à la germination axonale autour des tranches au fil du temps, attestant de leur état de santé. De plus, nous avons transplanté avec succès dans les tranches SC des cellules souches neuroépithéliales humaines dérivées de SC (H-SC-NES) exprimant la GFP aux premiers stades de la différenciation neuronale. Le greffon de NSC a été maintenu pendant 30 jours après la greffe et les cellules ont montré une expression de la GFP pendant toute la période de culture. Le taux d’apoptose des cellules le jour suivant la greffe (DPT) 30 s’est également avéré être conforme à la valeur du taux d’apoptose observée à la DPT 7 dans les mêmes cellules40. Les cellules semblaient se greffer dans l’environnement tissulaire et survivaient jusqu’à plusieurs semaines.
En résumé, nos données démontrent qu’il est possible de maintenir en culture des tranches organotypiques SC pendant 3 mois sans compromettre leur cytoarchitecture d’origine et l’environnement tissulaire. Plus important encore, ils peuvent être exploités pour tester des thérapies cellulaires avant de procéder à une expérience in vivo , réduisant ainsi les coûts et le temps expérimental. Ici, nous illustrons en détail tous les passages pour générer des tranches organotypiques de SC de souris et comment les maintenir pendant de longues périodes (≥30 jours). De plus, nous expliquons en profondeur comment effectuer la transplantation de NPC dans les tranches et comment les maintenir pour l’analyse en aval.

<table><tbody><tr><td>caspase-3 anti-clivée,&nbsp ; (ASP175) (5A1E) (Lapin)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-GFP (souris) - monoclonal</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-noyaux humains (souris) - monoclonal, clone 235-1&nbsp ;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-noyaux humains (lapin)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN (RBFOX3) (lapin) - polyclonal</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL (souris)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL H-Phospho (lapin) -polyclonal</td><td>Biologend</td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Leica</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>Eau graduée pour culture cellulaire</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de queue de rat</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal - Microscope confocal A1 (Eclipse Ti)</td><td>Nikon·s ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Pince à dissection</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre, 3.5"&nbsp ;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-chèvre Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-chèvre souris Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG Chèvre-anti lapin Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Chèvre-anti Lapin IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Graph Pad-Prism</td><td>Dotmatics Logiciel pour l’analyse</td><td></td><td>statistique</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Cheval Sérum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Préparation lentivirale</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de dosage de viabilité/cytotoxicité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>pour charger les cellules dans l’aiguille pour la transplantation</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de culture cellulaire</td><td>Millicell Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Lunettes de protection Miscroscope</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122 Boîte de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri (35mm)</td><td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette pasteur en plastique</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Micro-injecteur pour transplantation</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel No 10 Stérile en acier inoxydable</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Manche #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Spring Ciseaux</td><td>World Precision Instruments</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope pour l’imagerie et l’acquisition</td><td>Nikon ;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope pour chirurgie</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler-Dumont #5-inox</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette vertical</td><td>Shutter Instrument</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R& D Systèmes</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

culture à long terme de coupes organotypiques de moelle épinière de souris comme plate-forme de validation de la transplantation cellulaire dans les lésions de la moelle épinière

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Il n’existe toujours pas de remèdes résolutifs pour les lésions de la moelle épinière (LME) en raison de la physiopathologie complexe. L’une des approches régénératives les plus prometteuses est basée sur la greffe de cellules souches pour remplacer les tissus perdus et favoriser la récupération fonctionnelle. Cette approche devrait être mieux explorée in vitro et ex vivo pour en assurer l’innocuité et l’efficacité avant de procéder à des essais sur des animaux, qui sont plus coûteux et prennent plus de temps. Dans ce travail, nous montrons la mise en place d’une plateforme à long terme basée sur des coupes organotypiques de moelle épinière (CS) de souris transplantées avec des cellules souches neurales humaines pour tester des thérapies de remplacement cellulaire pour les LME.
Les cultures organotypiques SC standard sont maintenues pendant environ 2 ou 3 semaines in vitro. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la maintenance à long terme (≥30 jours) jusqu’à 90 jours. Le milieu utilisé pour la culture à long terme des tranches SC a également été optimisé pour la transplantation de cellules souches neurales dans le modèle organotypique. Des cellules souches neuroépithéliales humaines dérivées de SC (h-SC-NES) portant un rapporteur de protéine fluorescente verte (GFP) ont été transplantées dans des tranches de SC de souris. Trente jours après la greffe, les cellules présentent toujours une expression de GFP et un faible taux d’apoptotique, ce qui suggère que l’environnement optimisé a soutenu leur survie et leur intégration à l’intérieur du tissu. Ce protocole représente une référence solide pour tester efficacement les thérapies de remplacement cellulaire dans le tissu SC. Cette plateforme permettra aux chercheurs d’effectuer un pré-dépistage ex vivo de différentes thérapies de transplantation cellulaire, ce qui les aidera à choisir la stratégie la plus appropriée avant de procéder à des expériences in vivo .

Les méthodes décrites permettent l’établissement de coupes organotypiques SC à partir de souris au stade P3 et leur maintien en culture pendant une période prolongée dans des conditions saines. De plus, nous montrons un protocole pour la transplantation de cellules dans les tranches et pour leur co-culture jusqu’à 30 jours (Figure 1). Dans un premier temps, nous montrons l’optimisation des conditions de culture et un protocole adapté à la culture prolongée des tranches SC avec des cellules transplantées (Figure 2A). Les tranches sont générées et gérées à partir de DEV 0 jusqu’à DEV 2 dans le MO, qui a été proposé à l’origine comme un support optimal pour la maintenance des tranches SC47. Cependant, en raison de la présence de protéines sériques, ce milieu pourrait être sous-optimal pour soutenir la différenciation neuronale et la maturation des cellules précurseurs neurales transplantées. En effet, à DEV 3, nous avons testé le passage de l’OM au GM, une formulation contenant du Neurobasal plus B27, qui soutient la survie neuronale, et sans sérum, qui inhibe la différenciation neuronale correcte, favorisant à la place un destin glial48,49.
La figure 2B montre les résultats obtenus en changeant le milieu au DEV 3 de OM à GM, par rapport aux tranches SC ne recevant pas le commutateur (les tranches de contrôle ont été cultivées en MO). Nous avons utilisé la distribution du signal NFL à l’intérieur des tranches comme marqueur de l’intégrité neuronale (Figure 2B,C). Les coupes de DEV 7 étaient saines dans les deux conditions de culture, montrant la distribution diffuse de neurofilaments (NFL, en vert) à l’intérieur. À DEV 10, les tranches cultivées en GM semblaient être plus saines par rapport aux tranches témoins cultivées en OM, comme documenté par la distribution de coloration NFL. Nous avons également estimé la surface NFL+ (% NFL+ Area/DAPI+ Area) des tranches montrées dans les images représentatives de la figure 2B. La zone NFL+ estimée est représentée dans les histogrammes de la figure 2C, confirmant que le signal NFL est distribué de manière diffuse dans les tranches à DEV 7 dans les deux conditions. Cependant, à DEV 10, la zone estimée couverte par la coloration NFL diminue pour la condition de culture OM.
Ces données suggèrent que le passage à la MG à DEV 3 est bien toléré pour la culture prolongée de tranches SC (DEV 10). Comme étape suivante, nous avons testé GM à des moments plus prolongés : DEV 30, DEV 60 et DEV 90. Comme le montrent les figures 3A et B, les tranches ont été maintenues saines en culture jusqu’à DEV 90. La coloration NFL a été trouvée largement présente dans les tranches à chaque point temporel, avec une germination diffuse autour des tranches de neurites partant de la région centrale. En effet, nous avons estimé la surface NFL+ des tranches montrées à la figure 3A et elle a augmenté au fil du temps comme le montrent les histogrammes de la figure 3B. Nous avons également observé une positivité au marqueur neuronal RBFOX3, fournissant une autre preuve de la différenciation neuronale des tranches. À chaque point temporel, nous avons également vérifié le taux d’apoptose en évaluant dans différentes tranches le nombre de cellules positives à aCASP3 (Figure 4A,B). L’analyse a été effectuée conformément à la section 10.2 du protocole. Le taux d’apoptose (% de cellules aCASP3+/nombre total de cellules DAPI+) s’est avéré très faible à chaque point temporel (0,85 ± 0,52 %, 0,71 ± 0,27 %, 0,66 ± 0,45 % pour DEV 30, 60 et 90, respectivement), sans différences significatives entre les trois points temporels considérés (valeur p &gt; 0,05, figure 4B). Ces données suggèrent que le taux d’apoptose associé à aCASP3 reste stable au cours du temps et, avec la large distribution de NFL dans les coupes (Figure 4A), confirment la survie des tranches à chaque point temporel.
À l’appui des données précédentes, nous avons également effectué un test vivant/mort pour évaluer la viabilité des coupes aux trois points temporels différents. Nous avons utilisé Calcein (coloration verte) pour marquer les cellules viables et métaboliquement actives et Sytox (coloration cyan) pour évaluer la mort cellulaire. Comme le montrent les histogrammes de la figure 4C, le pourcentage de cellules métaboliquement actives augmente légèrement de DEV 30 à DEV 90 (93,17 ± 5,21 %, 96,43 ± 3,02 %, 96,33 ± 3,10 % pour DEV 30, 60 et 90, respectivement), se stabilisant entre les deux derniers points temporels (DEV 30 vs DEV 60 valeur p = 0,018 ; DEV 30 vs DEV 90 : valeur p = 0,027 ; DEV 60 vs DEV 90 valeur p = 0,99). Nous avons constaté de faibles niveaux de mort cellulaire qui ont diminué au fil du temps (6,83 ± 5,21 %, 3,57 ± 3,02 %, 3,66 ± 3,10 % pour DEV 30, 60 et 90, respectivement) et une différence significative a été observée entre DEV 30 et les points temporels ultérieurs, DEV 60 et DEV 90 (DEV 30 vs DEV 60 valeur p = 0,018 ; DEV 30 vs DEV 90 : valeur p = 0,027 ; DEV 60 vs DEV 90 valeur p = 0,99). Ces données, associées au taux d’apoptose, confirment la survie des tranches au fil du temps et soutiennent l’efficacité du protocole de culture à long terme effectué.
Une fois que la faisabilité d’une culture prolongée des tranches SC a été établie, nous avons défié le système par la transplantation de cellules h-SC-NES aux premiers stades de la différenciation neuronale. Nous avons testé les cellules h-SC-NES car elles ont montré des résultats prometteurs pour le traitement des lésions médullaires12. La procédure de transplantation de cellules h-SC-NES dans des tranches SC de souris est décrite dans la section 6 du protocole. Les coupes SC et les cellules h-SC-NES transplantées ont été maintenues jusqu’à DPT 30. Les cellules ont été greffées à la DIV 10 de différenciation (stade précurseur neural) en tranches organotypiques DEV 4, comme le montre le schéma de protocole de la figure 5A. L’expression de la GFP en culture a permis de surveiller l’expression de la GFP dans les cellules transplantées pendant une période allant jusqu’à 30 jours. La figure 5B montre des images en direct représentatives, à différents DPT, d’une tranche SC avec des cellules GFP+ transplantées. L’expression stable de la GFP au fil du temps (figures 5B et 6A) suggère que les cellules ont survécu dans le tissu SC dans les conditions de culture précédemment optimisées. Nous avons également vérifié le taux d’apoptose des cellules transplantées comme décrit dans la section 10.2 du protocole. Le taux d’apoptose (% de cellules aCASP3+ /nombre total de cellules Hu-Nu+ ) s’est avéré très faible (0,44 ± 0,34 %) après 30 DPT (Figure 6B). De plus, le taux d’apoptose à DPT 30 s’est avéré être conforme à celui trouvé pour le même type de cellules à DPT 7, comme précédemment rapporté40, documentant que les cultures se stabilisent au fil du temps.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail du protocole. Schéma représentatif montrant le flux de travail général du protocole effectué. (A) À gauche, un schéma résumant la génération de tranches SC de souris à partir de SC isolés de petits de souris à P3 et la culture à long terme de tranches organotypiques SC. (B) À droite, un schéma résumant la transplantation de cellules h-SC-NES exprimant la GFP dans des coupes organotypiques de SC de souris. Les cellules greffées sont conservées pendant 30 jours après la greffe. Abréviations : h-SC-NES = tige neuroépithéliale dérivée de la moelle épinière humaine ; GFP = protéine fluorescente verte ; DEV = jour ex vivo ; DTC = jour après la greffe ; NFL = chaîne légère de neurofilaments ; RBFOX3 = ARN liant l’homologue 3 du fox-1 ; aCASP3 = caspase-3 active ; SC = moelle épinière. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Figure 2 : Optimisation des conditions d’élevage à long terme. (A) Schéma représentatif du protocole d’essai OM et GM. OM est maintenu jusqu’au DEV 7-10 pour le groupe témoin. Le milieu est basculé sur le GM à DEV 3 pour les tranches traitées ; ensuite, ils sont fixés à DEV 7-10 pour comparaison avec les commandes. (B) Images représentatives comparant des coupes organotypiques de souris SC à DEV 7 et 10 cultivées dans des conditions différentes. Les tranches sont colorées pour le neurofilament marqueur du cytosquelette (NFL, vert). La large distribution de la coloration NFL dans les tranches cultivées avec des OGM suggère une survie et une différenciation globales. Les noyaux sont contre-colorés avec du DAPI. Barre d’échelle = 500 μm. (C) Histogrammes représentatifs de l’estimation de la zone couverte par NFL dans les tranches illustrées à la figure 1B. À DEV 10, la surface de NFL diminue dans les conditions de culture de la MO. Abréviations : DEV = jour ex vivo ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; NFL = chaîne légère de neurofilaments. ; OM = milieu organotypique ; GM = milieu de greffe ; SC = moelle épinière. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Figure 3 : Coupes organotypiques de souris cultivées à long terme. (A) Les tranches sont maintenues en culture jusqu’à DEV 90. Le test d’immunofluorescence révèle une large distribution du neurofilament marqueur cytosquelettique (NFL, vert) et du marqueur neuronal nucléaire RBFOX3 (rouge), attestant de leur état de santé et de leur identité neuronale après une culture à long terme. Il est à noter que les axones NFL+ poussent de manière diffuse autour des tranches au fil du temps. Les noyaux sont contre-colorés avec du DAPI. Barre d’échelle = 500 μm. (B) Histogrammes représentatifs de l’estimation de la zone et du temps NFL+ et de l’aire RBFOX3+ des coupes montrées dans le panneau A. La surface neurite NFL+ augmente avec le temps. Abréviations : DEV = jour ex vivo ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; NFL = chaîne légère de neurofilaments ; SC = moelle épinière ; RBFOX3 = Homologue 3 de l’ARN reliant l’ARN-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Figure 4 : Évaluation de la viabilité cellulaire dans les coupes SC au cours du temps. (A) Images représentatives de coupes organotypiques à DEV 60 colorées pour aCASP3 (rouge) et NFL (vert). Barre d’échelle = 100 μm. NFL montre un motif diffus. Des cellules rares sont positives pour le marqueur apoptotique aCASP3 (Inserts : 1-2-3). (B) Analyse du taux d’apoptose en tranches à différents points temporels. Moyenne ± écart-type, N (répétitions) = 6 tranches, n (cellules totales) &gt; 1 000 pour chaque tranche, test de Kruskal-Wallis, comparaison multiple, valeur p &gt; 0,05. Le taux d’apologie est stable dans le temps. Dans les encarts 1-2-3 du panneau A, il est possible d’observer le détail des cellules positives pour aCASP3 (coloration rouge, flèches blanches). De petits points rouges marquent les débris cellulaires et les noyaux pycnotiques. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Images représentatives du test vivant/mort réalisé sur des coupes SC à DEV 90 : les cellules métaboliquement actives sont marquées en vert avec Calcein, tandis que les cellules mortes et endommagées sont marquées en bleu clair (cyan) avec Sytox. Les deux histogrammes montrent le % de cellules positives pour Calcein (à gauche) et Sytox (à droite) sur le nombre total de cellules. Pour les deux moyennes ± écarts-types, N (répétitions) = 6 tranches, n (cellules totales) &gt; 1 000 pour chaque tranche, test de Kruskal-Wallis, comparaison multiple, valeur p DEV 30 vs DEV 60 = 0,018 ; DEV 30 vs DEV 90 : valeur p = 0,027 ; DEV 60 vs DEV 90 : la valeur p &gt; 0,99. Abréviations : DEV = jour ex vivo ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; NFL = chaîne légère de neurofilaments ; SC = moelle épinière ; aCASP3 = caspase-3 active. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Figure 5 : Transplantation de cellules h-SC-NES dans des coupes organotypiques de souris. (A) Schéma représentatif du protocole de transplantation. Les cellules sont transplantées en tant que précurseurs neuraux à la DIV 10 de la différenciation en tranches organotypiques DEV 4. (B) Images représentatives de coupes organotypiques de souris transplantées avec des cellules h-SC-NES exprimant la GFP au fil du temps jusqu’à DPT 30. Les cellules sont transduites à l’aide d’un vecteur lentiviral porteur du gène GFP. L’expression de la GFP au fil du temps confirme leur viabilité et leur adaptation à l’environnement de la tranche. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviations : DIV = premier jour de pré-différenciation ; h-SC-NES = tige neuroépithéliale dérivée de la moelle épinière humaine ; GFP = protéine fluorescente verte ; DEV = jour ex vivo ; OM = milieu organotypique ; GM = milieu de greffe ; DTC = jours après la greffe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Figure 6 : Évaluation du taux d’apoptose des cellules h-SC-NES transplantées 30 jours après la greffe. (A) Image représentative d’une tranche organotypique de souris transplantée avec des cellules h-SC-NES exprimant la GFP. Les cellules sont transduites à l’aide d’un vecteur lentiviral porteur du gène GFP pour les surveiller dans les tranches après la transplantation. L’expression de la GFP au fil du temps confirme leur viabilité et leur adaptation à l’environnement de la tranche. Le point temporel indiqué est DPT 30 ; Les cellules sont colorées pour les noyaux humains (cyan) et aCASP3 (rouge). Barre d’échelle = 150 μm. (B) À gauche, graphique circulaire représentatif de l’analyse de l’apoptose des cellules transplantées en coupes à DPT 30 (N (répétitions) = 5 tranches, n (cellules) = 5 000), et à droite, un encart de cellules Hu-Nu+ et le détail d’une cellule positive à aCASP3 (flèche blanche). Barre d’échelle = 75 μm. De petits points rouges marquent les débris cellulaires et les noyaux pycnotiques. Abréviations : h-SC-NES = tige neuroépithéliale dérivée de la moelle épinière humaine ; GFP = protéine fluorescente verte ; DTC = jour après la greffe ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; NFL = chaîne légère de neurofilaments ; aCASP3 = caspase-3 active ; Hu-Nu = noyaux humains. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Composition des solutions utilisées dans ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Dans cet article, nous proposons une méthode reproductible pour générer et maintenir à long terme des coupes organotypiques de la moelle épinière transplantées avec des cellules souches neurales comme modèle ex vivo pour tester des thérapies de remplacement cellulaire.

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