I linje med det akuta behovet av screening för typ 1-diabetes, celiaki och coronavirussjukdom 2019 utvecklade vi en 6-Plex elektrokemiluminescensanalys med hög genomströmning för att samtidigt upptäcka alla fyra ö-autoantikroppar, vävnadstransglutaminasautoantikroppar och antikroppar mot receptorbindningsdomänen för allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2.
En pågående klinisk studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), är den första screeningstudien i den allmänna befolkningen för typ 1-diabetes (T1D) och celiaki i USA. Med coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi behövs epidemiologin för COVID-19 i den allmänna befolkningen och kunskap om sambandet mellan COVID-19-infektion och T1D-utveckling. Den för närvarande standardiserade screeningmetoden för radiobindande analys (RBA) har mött två stora utmaningar: låg effektivitet med ett enda analysformat och låg sjukdomsspecificitet med en stor andel antikroppar med låg affinitet som genereras vid screening. Med plattformen för multiplex elektrokemiluminescens (ECL) -analysen som vi etablerade tidigare utvecklades en ny 6-Plex ECL-analys som kombinerar, i en enda brunn, alla fyra öautoantikroppar (IAbs) till insulin, glutaminsyradekarboxylas (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) och zinktransportör 8 (ZnT8) för T1D, transglutaminasautoantikroppar (TGA) för celiaki och svår akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptorbindande domän (RBD) antikroppar för Covid-19. Analysen validerades i blinda med 880 prover från ASK-studien, inklusive 325 positiva prover och 555 alla antikroppsnegativa prover, och jämfördes med standard RBA och en enda ECL-analys. Med fördelarna med hög effektivitet, låg kostnad och låg serumvolym har denna analys accepterats som det primära screeningverktyget för ASK-studien.
Stora epidemiologiska studier över hela världen visar att förekomsten av typ 1-diabetes (T1D) har ökat snabbt med 3%-5% årligen, och förekomsten av T1D har fördubblats under de senaste 20 åren, särskilt hos små barn 1,2. Ö-autoantikroppar (IAbs) uppträder vanligtvis år före kliniska symtom och är för närvarande de mest tillförlitliga prediktiva och diagnostiska biomarkörerna för T1D3. Screening för T1D-autoantikroppar kan identifiera personer i riskzonen för att utvecklas till klinisk T1D, utbilda allmänheten, till stor del minska den livshotande komplikationen av ketoacidos och gynna kliniska prövningar för förebyggande terapier. Världsomspännande förebyggande insatser för T1D pågår och flera interventionsstudier genomförs bland patienter med IAbs positiva för att fördröja utvecklingen till klinisk T1D, och Barbara Davis Center for Diabetes lanserade den första amerikanska kliniska prövningen av screening i den allmänna befolkningen 2016 för T1D och celiaki, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Celiaki (CD) är en kronisk inflammatorisk tarmsjukdom relaterad till immun- och genetiska faktorer. Prevalensen av CD hos barn med T1D kan nå upp till 24,5%5. Mer än hälften av individer med CD kanske inte har typiska symtom vid presentation6, så serologisk screening för celiaki är helt nödvändig.
Sedan pandemin av coronavirussjukdom 2019 (COVID-19) startade har över 200 miljoner fall rapporterats globalt, och barn står för upp till 16% av laboratoriebekräftade fall7. Många studier har visat effekten av befintlig T1D på svårighetsgraden och dödsfallet av COVID-19-infektion8, medan effekten av COVID-19-infektion på T1D-utvecklingen inte är tydlig. Undersökningen av den totala frekvensen av COVID-19-infektion i den allmänna befolkningen genom bestämning av allvarliga akuta respiratoriska syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antikroppar och studien av sambandet mellan COVID-19-infektion och utlösande T1D-autoimmunitet eller accelererande T1D-progression är brådskande och mycket viktigt, medan den pågående ASK-studien är en utmärkt plattform för detta. På grund av det enda analysformatet och genereringen av en stor andel antikroppspositivitet med låg affinitet har standardradiobindningsanalysen (RBA) mött en flaskhals med låg effektivitet och låg sjukdomsspecificitet9. I detta dokument presenterar vi en ny 6-plexed elektrokemiluminescens (ECL) -analys byggd på vår tidigare multiplex ECL-analysplattform med hjälp av en multipel-Plex-platta, som kombinerar sex autoantikroppsanalyser i en enda brunn, inklusive alla fyra stora IAbs till insulin (IAA), glutaminsyradekarboxylas-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) och zinktransport-8 (ZnT8A), autoantikroppar mot transglutaminas (TGA) för celiaki, och SARS-CoV-2 receptorbindande domän (RBD) antikroppar (COVID-19A). Detta är den första multiplexanalysen som rekryterade en komplett panel med fyra stora IAbs och ytterligare kombinerade detta med TGA och COVID-19A. Det har validerats och formellt accepterats som det primära screeningverktyget som ersätter standard RBA i ASK-studien.
Interventionen för T1D har gått in i pre-T1D-eran, med pågående nationella och internationella storskaliga screeningprogram för T1D och blomstrande kliniska prövningar som tillämpas i steg 1 T1D för att upphäva eller bromsa utvecklingen till klinisk T1D12,13. Mätningar av fyra IAbs med den nuvarande standarden RBA med ett enda IAb-analysformat är mödosamt och ineffektivt för ett massscreeningsprogram. Med den brådskande efterfrågan på en multiplexerad IAbs-analys med hög genomströmning har multiplexerad ECL-analys, 3-Screen ICA ELISA och antikroppsdetektering genom agglutination-PCR (ADAP) framträtt som för närvarande konkurrenskraftig teknik. I Fr1da-studien av screening för T1D hos en population av små barn i Tyskland användes 3-screen ICA ELISA som kombinerar 3 IAbs (GADA, IA-2A och ZnT8A) som huvudtest14. En stor begränsning av 3-Screen ICA ELISA är bristen på IAA, som oftast är den första IAb som uppträder med hög prevalens hos små barn med T1D. Dessutom kan analysen inte skilja vilken av de tre IAbs som är positiv från en positiv signal, och varje positivt prov måste upprepas med tre enkla analyser för bekräftelse. ADAP15 kombinerar GADA, IA-2A och IAA och illustrerade hög analyskänslighet och specificitet i IASP-workshopen men saknar data om hur prediktivt det är vid populationsbaserad screening för T1D-studier, vilket IASP-verkstaden inte kan fastställa. Multiplex ECL-analysen i den aktuella studien bygger på plattformen för en enda ECL-analys som har validerats mot nuvarande standard RBA i flera kliniska prövningar som TrailNet 9,16, DAISY17,18,19 och ASK 4,20,21 studera. Den aktuella analysen har validerats mot både RBA och single ECL-analys med 880 serumprover från deltagare i ASK-studien. Som visas i figur 2 och figur 3 var antikroppsnivåerna mellan 6-Plex och enstaka ECL eller mellan 6-Plex och RBA mestadels kongruenta med varandra för antikropparnas positivitet. Sammanträffandegraden för IAbs som testades av RBA och 6-Plex var 91,7% -97,8%, och sammanträffandegraden för IAbs som testades av enstaka ECL och 6-Plex var 95,3% -99,2%. Diskordinen mellan ECL-analysen och RBA var huvudsakligen från dem med enstaka IAb. Nivåerna av IAbs testade av 6-Plex och single ECL (r = 0,6431-0,9434, alla p < 0,0001) och 6-Plex och RBA (r = 0,5775-0,8576, alla p < 0,0001) var också väl korrelerade. TGA som testades med 6-Plex-analys var starkt korrelerad med resultaten från både RBA (99,4%) och enstaka ECL-analys (99,4%). Dessutom nådde COVID-19A som testades av 6-Plex 99.8% överensstämmelse med resultaten från den enda ECL-analysen.
Som ett resultat har 6-Plex ECL-analysen formellt accepterats som den primära screeningmetoden för den pågående ASK-studien och ersatt standard RBA22. Denna analys visade sin utmärkta känslighet och specificitet med högre genomströmning, lägre kostnad och mindre serumvolym jämfört med standard RBA.
Det har dokumenterats att i T1D-screeningstudien var enstaka IAb som upptäcktes av RBA, som tog upp en stor andel av IAb-positiviteter, av låg affinitet, med låg sjukdomsrisk och resulterade i totalt sett lågt prediktivt värde 19,21,23,24,25,26. En sådan låg riskprognos orsakade enorma extra kostnader för uppföljningsbesök och resulterade i svårigheter för T1D-förebyggande studier. Den etablerade ECL-analysplattformen har visats i flera kliniska prövningar för att skilja IAbs med hög affinitet från IAbs med låg affinitet som genereras av RBA och avsevärt förbättra de prediktiva värdena för alla fyra IAbs, särskilt med en enda IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analystekniken byggdes på plattformen för den enda ECL-analysen, med denna distinkta fördel av detekteringen av Abs med hög affinitet. I den aktuella studien illustrerade 6-Plex ECL-analysen dess likhet med motsvarande enda ECL-analyser i känslighet och specificitet.
Vissa begränsningar och de tekniska problemen med multiplex ECL-analys med flera Plex-plattor har redan behandlats i tidigare publikationer27,28. Med sex märkta antigener i en brunn kan det finnas vissa influenser mellan olika antigener, och analysbakgrunden kan öka när man lägger till varje antikroppsanalys för multiplexering i samma brunn. En stor mängd analysoptimeringsarbete behövs för att justera analysförhållandena, särskilt för att justera de slutliga koncentrationerna av varje märkt antigenprotein baserat på schackbrädets analys för varje antigen, för att bibehålla känsligheten och specificiteten för varje antikroppsanalys. Som nämnts i tidigare studier27,28 resulterar ett litet antal prover (<1%) i falsk positivitet på multipel Plex-plattan utan en tydlig bakomliggande orsak. Alla positiva resultat bör upprepas och bekräftas med en enda ECL-analys som rutinmässig kvalitetssäkring av laboratoriet. Vanligtvis tas de falska positiva bort från början. Falskt negativa resultat orsakade av "prozoneffekten" som observerades i den tidigare 7-Plex ECL-analysen27,28 observerades inte i den aktuella studien. I analysen som beskrivs här tog vi bort steget för syrabehandling av serumprover från det tidigare protokollet; Istället förvärmde vi serumproverna vid 56 °C i 30 minuter (steg 5.1.). På den andra dagen av platttvätt använde vi en tvättbuffert som innehåller 0,4 M NaCl (steg 8.1.) istället för vanlig tvättbuffert för att tvätta plattan strängare. Dessa modifieringar gjorde multiplex ECL-analysen enklare och lägre bakgrund utan att förlora analyskänsligheten.
Sammanfattningsvis har denna analys enastående prestanda för att upptäcka fyra IAbs, TGA och COVID-19A samtidigt. Multiplexeringsfunktionen, liksom kravet på hög genomströmning, låg kostnad och liten serumvolym, gör storskalig screening för T1D och samtidiga sjukdomar mycket mer genomförbar i den allmänna befolkningen. Patienter med T1D eller några autoimmuna sjukdomar har en mycket högre risk för andra autoimmuna sjukdomar. Multiplex ECL-analysen ger en utmärkt plattform för att screena för T1D och flera autoimmuna sjukdomar samtidigt.
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes av JDRF-bidrag 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-bidrag DK32083 och Diabetes Research Center (DRC) bidrag P30 DK116073.
5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
Blocker A | MSD | R93AA | |
Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |