Name: Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come generare podociti specifici del paziente da biopsie cutanee mediante riprogrammazione episomale in cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo avanzato consente di modellare malattie renali in modo personalizzato.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato finanziato dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) dell'Università Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg con il numero di sovvenzione M4-IZKF-F009 assegnato a Janina Müller-Deile, e dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) con il nome di progetto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, numero di sovvenzione 01GM2202D assegnato a Janina Müller-Deile. Ringraziamo Annalena Kraus per il supporto nello scattare immagini SEM.

Utilizzo di biopsie cutanee per generare podociti derivati da pazienti

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo basato su colture cellulari combina la riprogrammazione episomiale dei fibroblasti dermici umani in hiPSC specifiche del paziente e la successiva differenziazione in podociti derivati dall'hiPSC. Questo ci permette di studiare le alterazioni correlate alla mutazione dei podociti di pazienti con malattia glomerulare genetica per quanto riguarda il danno da podocita. Il protocollo per riprogrammare i fibroblasti dermici con un metodo privo di integrazione mediante elettroporazione è adattato dal lavoro pubblicato di Bang et al.32 e Okita et al.33. Il protocollo per differenziare i podociti dalle hiPSC è adattato dal protocollo pubblicato da Musah et al.28,34,35. Sono già disponibili pubblicazioni che descrivono la generazione di podociti da hiPSCs 27,34,35. Tuttavia, il protocollo fornito qui è ottimizzato e meno costoso per quanto riguarda la differenziazione delle hiPSC in podociti. Rispetto al protocollo pubblicato da Musah et al., abbiamo testato questo protocollo su diversi reagenti di rivestimento, come vitronectina, laminina seta-511 e matrice di membrana basale solubilizzata. Le concentrazioni di vitronectina e laminina seta-511 potrebbero essere ridotte a 2,5 μg/mL invece di 5 μg/mL 28,34,35. Inoltre, è stato possibile ridurre le concentrazioni di BMP7 e activina A, due fattori di crescita molto costosi, del 50%, da 100 ng / mL a 50 ng / mL.
Ciò consente una differenziazione meno costosa. Le cellule progenitrici del nefrone dal giorno 7 stavano ancora proliferando e la possibilità di congelamento era stata mostrata prima. Abbiamo espanso queste celle dopo lo scongelamento e prima della differenziazione finale in terreno di base contenente il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) e B27 per diversi giorni, riducendo ulteriormente i costi. Oltre alle fasi di differenziazione, questo protocollo descrive la crescita dei fibroblasti dalle biopsie cutanee con successiva generazione di hiPSC paziente-specifiche tramite riprogrammazione episomiale. La combinazione di questi due metodi consente la generazione di podociti specifici per il paziente. Pertanto, qui viene fornito un protocollo passo-passo completo per generare podociti derivati dall'hiPSC specifici per il paziente che non è stato descritto prima in modo così dettagliato.
Poiché il protocollo generale include diversi tipi di cellule, è fondamentale caratterizzare i tipi di cellule generate in diversi passaggi. Le cellule sono in coltura per un lungo periodo di tempo, quindi il controllo di qualità dovrebbe essere eseguito in diversi passaggi. Quando si lavora con hiPSC, è necessaria l'alimentazione quotidiana, nonché il monitoraggio del comportamento cellulare e della morfologia. La sterilità dei mezzi di differenziazione deve essere garantita dalla sterilizzazione del filtro attraverso un filtro da 0,2 μm. L'intero protocollo, dalla biopsia cutanea ai podociti derivati dall'hiPSC, richiede diversi mesi, ma è possibile congelare le cellule in fasi distinte del processo. I fibroblasti, i cloni hiPSC selezionati e le cellule progenitrici proliferative del nefrone dopo 7 giorni nel mezzo di differenziazione dei progenitori del nefrone possono essere congelati e può essere generata una banca cellulare funzionante.
Anche se i podociti sani derivati dall'hiPSC sviluppano una rete distinta di processi primari e secondari del piede (Figura 5A,B) ed esprimono il tipico marcatore specifico del podocita (Figura 6A-C), i caratteristici diaframmi a fessura, come si vedono in vivo, sono difficili da imitare nei classici modelli di coltura cellulare bidimensionale. Inoltre, la comunicazione intercellulare con altri tipi di cellule glomerulari non è possibile in questo contesto di monocoltura.
A causa del loro stato differenziato terminale e della mancanza di capacità di proliferazione, è difficile studiare i podociti ex vivo. Con l'aiuto di podociti primari condizionatamente immortalanti, è possibile superare questa limitazione con l'inserimento di un interruttore termosensibile, risultando in un modello di coltura cellulare in cui le cellule proliferano a 33 °C e si differenziano a 37 °C13,14. Sebbene questi ciPodociti abbiano un alto potenziale per la ricerca sui podociti, ci sono limitazioni, come la mancanza di espressione dei marcatori, la morfologia sdifferenziata e la mancata formazione dei processi del piede15,16.
La differenziazione dei podociti da cellule somatiche derivate dal paziente consente la generazione e il confronto di podociti malati con cellule di controllo sane ex vivo. Questo ci permette di studiare il danno podocita dovuto a mutazioni nei geni specifici del podocita. Inoltre, lavorare con le hiPSC ha il potenziale per creare modelli tridimensionali di malattia da coltura cellulare, o meglio organoidi43,44. La co-coltura di podociti derivati dall'hiPSC con altre cellule glomerulari, come le cellule endoteliali glomerulari o le cellule mesangiali, potrebbe portare a nuove intuizioni sulla comunicazione intercellulare nella salute e nella malattia glomerulare.
Inoltre, la caratterizzazione e il trattamento dei podociti paziente-specifici possono essere eseguiti ex vivo in analisi ad alta produttività. L'approccio individualizzato apre l'opportunità di studiare nuovi bersagli terapeutici per mutazioni specifiche e di eseguire la medicina individualizzata in futuro.

I podociti sono cellule epiteliali renali post-mitotiche specializzate che formano la barriera di filtrazione glomerulare del rene insieme alla membrana basale glomerulare (GBM), alle cellule endoteliali glomerulari e al glicocalice. Fenotipicamente, i podociti sono costituiti da un corpo cellulare e da estensioni primarie della membrana guidate da microtubuli, nonché estensioni secondarie chiamate processi del piede 1,2. La barriera di filtrazione glomerulare che filtra l'urina dal sangue è costruita con endotelio fenestrato, GBM e un tipo specializzato di giunzione intercellulare che collega i processi del piede podocita vicini, chiamato diaframma a fessura dei podoctyes3. In condizioni di salute, le proteine più grandi dell'albumina vengono trattenute dalla barriera di filtrazione a causa delle loro dimensioni e carica4.
È noto che le mutazioni nei geni citoscheletrici o podociti specifici, così come i fattori circolanti che influenzano le vie di segnalazione dei podociti, inducono effacement, distacco o apoptosi del podocita con conseguente proteinuria e sclerosi glomerulare. In particolare, il riarrangiamento citoscheletrico, i cambiamenti nella polarità del podocita o il danneggiamento dei processi del piede con una perdita associata delle giunzioni a fessura sono fondamentali5. A causa del loro stato terminale differenziato, i podociti difficilmente possono essere sostituiti dopo il distacco del GBM. Tuttavia, se i podociti sono attaccati al GBM, possono ancora recuperare dall'effacement e riformare i processi interdigitati del piede 6,7,8. Un'ulteriore comprensione degli eventi che portano al danno da podocita in vari disturbi glomerulari può fornire nuovi obiettivi terapeutici che aiuteranno a sviluppare trattamenti per queste malattie. Il danno da podocita è un segno distintivo di diverse malattie glomerulari, tra cui la glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS), la nefropatia diabetica, la malattia a cambiamento minimo e la glomerulonefropatia membranosa, che richiedono modelli affidabili di podocita ex vivo per studiare i meccanismi patologici e i potenziali approcci terapeutici per queste malattie 9,10. I podociti possono essere studiati ex vivo mediante coltura cellulare primaria classica basata sull'isolamento dei glomeruli mediante setacciatura differenziale11. Tuttavia, a causa dello stato terminalmente differenziato con limitata capacità di proliferazione, la maggior parte dei ricercatori utilizza linee cellulari di ciPodociti di topo o umani che esprimono varianti sensibili alla temperatura del grande antigene T SV40. In alternativa, i ciPodociti sono isolati da topi transgenici che ospitano il gene immortale SV40 Tag 1,12.
I cipotociti proliferano a 33 °C, ma entrano in arresto della crescita e iniziano a differenziarsi a 37 °C13,14. Va tenuto presente che i dati sperimentali ottenuti con queste cellule devono essere interpretati con una certa cautela, poiché le cellule sono generate utilizzando un'inserzione genica innaturale15. Poiché queste cellule ospitano un gene immortale, la fisiologia cellulare è alterata a causa della proliferazione in corso12. Le linee cellulari di podocite generate da questo approccio sono state recentemente messe in discussione, poiché i ciPodociti di topo, uomo e ratto esprimono meno del 5% di sinaptopodina e nefrrina a livello proteico, così come NPHS1 e NPHS2 a livello di mRNA rispetto all'espressione glomerulare16. Inoltre, la maggior parte delle linee cellulari di podocita non esprime nefrrina17,18. Chittiprol et al. hanno anche descritto una differenza significativa nella motilità cellulare e nelle risposte alla puromicina e alla doxorubicina nei ciPodocytes16. I podociti possono essere trovati nelle urine dopo il distacco dal GBM in diverse malattie glomerulari 19,20,21,22. I podociti urinari vitali possono essere coltivati ex vivo per un massimo di 2-3 settimane, ma la maggior parte delle cellule subisce l'apoptosi23,24. È interessante notare che i podociti non si trovano solo nelle urine di pazienti con malattia glomerulare ma anche nelle urine di soggetti sani, molto probabilmente quando sono senescenti, di nuovo con un limitato potenziale di replicazione in coltura24. Inoltre, il numero di podociti di derivazione urinaria è limitato e le cellule si dedifferenziano in coltura, mostrano meno processi del piede, cambiano morfologia e, soprattutto, hanno una capacità di proliferazione limitata. L'espressione dei geni podocit-specifici è assente, scompare entro poche settimane o varia tra questi cloni cellulari. Alcune cellule positive per il marcatore podocita specifico hanno co-espresso il marker di cellule epiteliali tubulari o miofibroblasti e cellule mesangiali, il che suggerisce la dedifferenziazione e/o la transdifferenziazione dei podociti urinari in coltura24,25.
Recentemente, è stata descritta la generazione di linee cellulari di ciPodociti derivate dall'urina di pazienti e volontari sani mediante trasduzione con un antigene T di grandi dimensioni SV40 termosensibile e hTERT26. È stata rilevata l'espressione di mRNA per sinaptopodina, nestina e proteina associata a CD2, ma l'mRNA della podocina era assente in tutti i cloni. Oltre ai problemi con i podociti urinari, queste cellule contengono anche il gene immortalizzante inserito, con conseguenti svantaggi discussi sopra.
Al contrario, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) hanno un'enorme capacità di auto-rinnovarsi e differenziarsi in più tipi di cellule in condizioni appropriate. È stato dimostrato in precedenza che le hiPSC possono servire come fonte quasi illimitata di podociti27,28.
Qui viene descritto un protocollo in due fasi per generare podociti specifici per il paziente da fibroblasti dermici di biopsie cutanee con successiva riprogrammazione episomiale in hiPSC e una differenziazione finale in podociti derivati da hiPSC (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Figura 1: Protocollo per generare podociti derivati dall'hiPSC specifici per il paziente. Panoramica grafica del protocollo per generare podociti paziente-specifici da fibroblasti dermici di una biopsia cutanea mediante riprogrammazione in hiPSCs e differenziazione in podociti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Come primo passo, i fibroblasti dermici somatici sono stati superati da una biopsia cutanea e riprogrammati in hiPSCs utilizzando un metodo privo di integrazione mediante elettroporazione con plasmidi che esprimono i fattori di trascrizione OCT3/4, KLF4, SOX2 e c-MYC 29,30,31. Le colonie di hiPSC emergenti sono state successivamente selezionate ed ampliate. La differenziazione è iniziata con l'induzione della linea mesodermica mediante l'attivazione della via di segnalazione WNT, seguita dalla generazione di cellule progenitrici del nefrone che erano ancora in grado di proliferare. Infine, le cellule sono state differenziate in podociti. In questa procedura, abbiamo modificato e combinato protocolli precedentemente pubblicati per la riprogrammazione episomiale per la generazione di hiPSCs da Bang et al.32 e Okita et al.33, così come un protocollo per la differenziazione di hiPSCs in podociti di Musah et al.28,34,35.
Infatti, i podociti generati dal nostro protocollo avevano un fenotipo più vicino ai podociti in vivo, per quanto riguarda lo sviluppo di una rete distinta di processi primari e secondari del piede e l'espressione di marcatori podocita specifici, come sinaptopodina, podocina e nefrina. Con l'uso di podociti derivati da hiPSC, il background genetico del paziente viene mantenuto durante la riprogrammazione e la differenziazione. Ciò consente la modellizzazione della malattia podocita specifica del paziente e la scoperta di potenziali sostanze terapeutiche ex vivo in un numero di cellule quasi illimitato. Inoltre, questo protocollo è minimamente invasivo, economico, eticamente accettabile e può facilitare nuove strade per lo sviluppo di farmaci.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtro sterile</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>per la sterilizzazione del mezzo di differenziazione</td></tr><tr><td>acido retinoico all-trans</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td>integratore per la differenziazione</td></tr><tr><td>Integratore B27 (50 x),</td> integratore <td>di 17504044 Gibco</td><td></td> senza siero <td>per terreno di differenziazione privo di siero</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>opzione aggiuntiva di reagente per matrice extracellulare utilizzato nella soluzione di rivestimento per colture cellulari plastiche adatte per colture hiPSC</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Filter Cap Palloni per colture cellulari, T75, 250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>plastiche per colture cellulari adatte per CHIR99021 per colture di fibroblasti</td></tr><tr><td>(5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>Integratore per la differenziazione</td></tr><tr><td>Matrice qualificata Corning Matrigel hESC&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354277</td> opzione <td>aggiuntiva di reagente per matrice extracellulare utilizzato nella soluzione di rivestimento per rivestire le plastiche per colture cellulari adatte per la coltura hiPSC (matrice di membrana basale solubilizzata)</td></tr> <tr><td>countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>per contare le cellule</td></tr><tr><td>countess II FL&nbsp; Contatore di cellule automatizzato</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>per contare le cellule</td></tr><tr><td>provette cryoPure, 2 ml, tappo a vite QuickSeal, bianco</td><td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>crioviali per il congelamento di cellule</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>per terreno di congelamento dei fibroblasti</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td>Terreno di base <td>Gibco</td><td>11320074</td><td>per la differenziazione</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>terreno di base per terreno di coltura per fibroblasti</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Sistema di imaging</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>microscopio a contrasto di fase</td></tr><tr><td>siero bovino fetale premium, inattivato (FCS)</td><td>PAN Biotech</td><td>siero</td><td>P301902 per terreno fibroblastico, terreno di congelamento fibroblasti e mezzo di mantenimento podociti</td></tr><tr><td>fisherbrand Cuvette per elettroporazione Plus, gap 4 mm, 800 &; Capacità L, cuvetta sterile</td><td>Fisherbrand</td><td>FB104</td><td>utilizzata per l'elettroporazione/riprogrammazione episomiale di fibroblasti (gap di 4 mm)</td></tr><tr><td>Terreno di montaggio fluoromount-G, con</td><td>terreno di montaggio</td>DAPI <td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td> contenente</tr><tr><td>ago di misura dapi (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>per la separazione di colonie di hiPSC in piccoli pezzi</td></tr><tr><td>di proteina umana ricombinante dell'activina A</td><td>78001.1</td><td>Integratore di tecnologie delle cellule staminali</td><td>per la differenziazione</td></tr> della <tr><td>proteina morfogenetica ossea ricombinante umana 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>integratore per la differenziazione</td></tr><tr><td>umana VEGF-165 Proteina ricombinante</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>integratore per la differenziazione</td></tr><tr><td>insulina-transferrina-selenio (ITS -G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>integratore per terreno di mantenimento dei podociti</td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X964.1</td><td>per il test di sterilità della coltura hiPSC</td></tr><tr><td>lookOut Kit di rilevamento PCR del micoplasma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MP0035-1KT</td><td>kit di rilevamento del micoplasma commerciale</td></tr><tr><td>vetrini per microscopio</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21.102</td><td></td></tr><tr><td>microprovette 1,5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Kit completo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>terreno di base per terreno di coltura hiPSC senza siero</td></tr><tr><td>contenitore di congelamento nalgene Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>per garantire condizioni di congelamento ottimali</td></tr><tr><td>siero di capra normale</td><td>abcam</td><td>ab 7481</td><td>per soluzione di preincubazione e diluente anticorpale</td></tr><tr><td>nunc piastre a 24 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>plastiche per colture cellulari adatte per colture hiPSC</td></tr><tr><td>nunc piastre a 48 pozzetti&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>plastiche per colture cellulari adatte per colture hiPSC</td></tr><tr><td>nunc piastre a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>plastiche per colture cellulari adatte alla coltura hiPSC</td></tr><tr><td>nunc EasYDish Piastre 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>plastiche per colture cellulari adatte alla coltura hiPSC</td></tr><tr><td>nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treatated, Micropiastra a fondo piatto</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>plastiche per colture cellulari adatte alla coltura hiPSC</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 Terreno di crioconservazione</td><td>Sartorius</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>terreno di crioconservazione privo di siero per la crioconservazione di cellule progenitrici hiPSC e nefrone</td></tr><tr><td>Mezzo di elettroporazione</td> <td>Opti-MEM</td><td>Gibco 11058021</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>plasmide per la riprogrammazione episomiale</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 plasmide</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>plasmide per la riprogrammazione episomiale</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK plasmide</td><td>Addgene</td><td>#27078</td><td>plasmide per la riprogrammazione episomiale</td></tr><tr><td>penicillina-streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>per evitare la contaminazione batterica</td></tr><tr><td>plastica vetrini coprioggetti</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>per colorazioni immunofluorescenti di hiPSC e podociti derivati da hiPSC</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>paraformaldeide commerciale (4 %) per la fissazione di cellule</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>terreno basico per la conservazione dei podociti</td></tr><tr><td>camera di colorazione del terreno StainTray Black lid</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>reagente per dissociazione cellulare stemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>soluzione enzimatica per il distacco cellulare utilizzata per la dissociazione di hiPSC</td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato sterile (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>utilizzata per il lavaggio e il rivestimento</td></tr> di <tr><td>acqua sterile</td> Siringa <td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>senza ago 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>per filtrare sterilizzare terreno di differenziazione</td></tr><tr><td>TC piatto 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8.33.902</td><td>plastiche sterili per colture cellulari utilizzate per il taglio della biopsia cutanea e la coltura dei fibroblasti</td></tr><tr><td>TC piatto 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8.33.900</td><td>plastiche sterili per colture cellulari utilizzate per la crescita dei fibroblasti dalla biopsia cutanea</td></tr><tr><td>triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>per soluzione di preincubazione&nbsp;</td></tr><tr><td>trypan Blue Stain (0,4 %) da utilizzare con il contatore di cellule automatizzato Countess</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>per contare le cellule</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (10 x)&nbsp;</td><td>Reagente</td> di dissociazione Biowest <td>X0930-100</td><td>utilizzato per fibroblasti e cellule progenitrici del nefrone</td></tr><tr><td>provetta 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>provetta 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>vitronectina ACF</td><td>Sartorius</td><td>05-754-0002</td><td>reagente matrice extracellulare utilizzato nella soluzione di rivestimento per rivestire le plastiche per colture cellulari adatte per la coltura</td></tr> <tr><td>hiPSCY-27632 dicloridrato (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>per evitare l'apoptosi delle hiPSC durante la scissione</td></tr><tr><td><forte>Anticorpi primari</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>marcatore di pluripotenza, diluizione 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>marcatore di pluripotenza, diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>marcatore di proliferazione, diluizione 1:300</td></tr><tr><td>sinaptododina</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>marcatore specifico per il podocitio, diluizione 1:200</td></tr><tr><td>nefrrina</td><td>Progen</td><td>GP-N2</td><td>marcatore specifico per i podociti, diluizione 1:25</td></tr><tr><td>podocin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>marcatore specifico per i podociti, diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat anti-Guinea IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>secondario e itbody, diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, altamente adsorbito in modo incrociato</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>secondario e itbody, diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>asino anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>secondario e itbody, diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>capra anti-topo IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>secondario eitbody, diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>capra anti-IgG di topo (H+L) anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>secondario ecorpo, diluizione 1:1000</td></tr></tbody></table>

generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

I podociti sono cellule epiteliali situate sul sito urinario della barriera di filtrazione glomerulare che contribuiscono alla funzione di filtro selettivo del glomerulo. Le mutazioni nei geni podocita specifici possono causare glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS) e i podociti sono colpiti anche in molte altre nefropatie primarie e secondarie. A causa della loro natura differenziata, i modelli di coltura cellulare primaria sono limitati per i podociti. Pertanto, vengono utilizzate comunemente cellule condizionatamente immortalate. Tuttavia, questi podociti condizionatamente immortalizzati (ciPodocytes) hanno diverse limitazioni: le cellule possono dedifferenziarsi in coltura, specialmente quando raggiungono la confluenza, e diversi marcatori specifici del podocita sono solo leggermente o non espressi affatto. Ciò mette in discussione l'uso dei ciPodociti e la loro applicabilità per la portata fisiologica, fisiopatologica e clinica. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di podociti umani, inclusi podociti specifici del paziente, da una biopsia cutanea mediante riprogrammazione episomiale dei fibroblasti dermici in hiPSC e successiva differenziazione in podociti. Questi podociti assomigliano molto meglio ai podociti in vivo in termini di caratteristiche morfologiche, come lo sviluppo dei processi del piede e l'espressione del marcatore specifico del podocita. Infine, ma ancora meno importante, queste cellule mantengono le mutazioni dei pazienti, risultando in un modello ex vivo migliorato per studiare le malattie dei podociti e le potenziali sostanze terapeutiche in un approccio individualizzato.

Con questo protocollo passo-passo che combina la riprogrammazione episomiale e la differenziazione, è possibile generare podociti portatori della mutazione di un paziente in un gene rilevante per il podocita. Ciò consente l'analisi ex vivo delle alterazioni dei podociti specifici della malattia. Il background genetico del paziente viene preservato durante il protocollo durante tutte le diverse fasi cellulari. Inoltre, la limitazione del numero insufficiente di cellule di podociti non proliferanti differenziati terminalmente può essere superata utilizzando podociti derivati da hiPSC. Sebbene siano necessari diversi mesi prima che i podociti hiPSC siano generati da fibroblasti dermici superati attraverso la riprogrammazione in hiPSC e la successiva differenziazione in podociti, è possibile congelare le cellule in tre diverse fasi del protocollo (Figura 2). Il congelamento è possibile per fibroblasti, hiPSCs e cellule progenitrici del nefrone dopo la differenziazione nel mezzo di differenziazione dei progenitori del nefrone per 7 giorni. Pertanto, è possibile la generazione di banche cellulari funzionanti e esperimenti su larga scala.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Figura 2: Singoli passaggi del protocollo attraverso un microscopio a contrasto di fase. (A) Fibroblasti dermici troppo grandi. (B) formazione di colonie hiPSC dopo riprogrammazione. (C) Cultura hiPSC selezionata. (D) Cellule del mesoderma dopo 2 giorni di differenziazione. (E) Cellule progenitrici di nefrone dopo 14 giorni di differenziazione nel mezzo di differenziazione dei progenitori del nefrone. (F) Podociti terminali differenziati derivati da hiPSC. Le barre della scala rappresentano 300 μm (A,B,D-F) e 150 μm (C). Il fiocco di neve evidenzia possibili passaggi di congelamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Poiché i podociti derivati dall'hiPSC generati attraversano un lungo protocollo con drastici cambiamenti riguardanti il tipo e la morfologia cellulare, la caratterizzazione cellulare è obbligatoria. La morfologia cellulare, come le dimensioni e la forma delle cellule, così come il comportamento di crescita, possono essere monitorati utilizzando un microscopio a contrasto di fase. I fibroblasti presentano un lungo fenotipo simile a un fuso con una dimensione da 150 μm a 300 μm (Figura 2A). Dopo la riprogrammazione, si verificano colonie con piccole hiPSC da 50 μm. Queste colonie mostrano bordi distinti e hiPSC distinti con un elevato rapporto nuclei-corpo e un aumento del tasso di proliferazione (Figura 2C). Poiché i podociti sono cellule differenziate terminalmente, il tasso di proliferazione diminuisce con la differenziazione progressiva e la morfologia cellulare cambia in podociti a forma di stella di 300 μm con processi del piede prominenti (Figura 2F).
La confluenza è un punto critico della coltura hiPSC e la differenziazione spontanea può apparire quando le colonie diventano troppo dense (Figura 3). Queste colonie devono essere rimosse prima di passare raschiando le parti interessate del piatto di coltura.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Figura 3: Esempi di hiPSC di diversa qualità. Immagini a contrasto di fase di (A) colonie hiPSC riprogrammate con successo e (B) hiPSC selezionate, nonché (C) differenziazione spontanea, (D,E) colonie non-hiPSC e (F) una coltura hiPSC troppo densa. Le barre della scala rappresentano 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
I diversi tipi di cellule di questo protocollo devono essere validati per quanto riguarda l'espressione di un marcatore specifico. Dopo la riprogrammazione, le hiPSC riacquistano la capacità di pluripotenza ed esprimono marcatori di proliferazione e pluripotenza come SSEA4, OCT3/4 e Ki67 (Figura 4)38,39,40. È noto che la riprogrammazione, così come la lunga coltura di hiPSCs e la differenziazione, possono portare ad un cariotipo anomalo, o meglio indurre mutazioni41. Pertanto, il background genetico delle cellule in coltura deve essere monitorato nel tempo e in diversi passaggi mediante g-banding e sequenziamento dell'intero esoma.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Figura 4: Caratterizzazione delle hiPSC generate mediante colorazione con immunofluorescenza. Caratterizzazione delle hiPSC generate mediante colorazione per (A) il marcatore proliferativo Ki67, così come i marcatori di pluripotenza (B) OCT3/4 e (C) SSEA4. Le barre della scala rappresentano 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Morfologicamente, i podociti derivati dall'hiPSC appaiono a forma di stella ed esprimono una rete distinta di lunghi processi primari e secondari del piede rispetto ai ciPodciti (Figura 5). I podociti derivati da HiPSC esprimono proteine marcatrici specifiche del podocita come sinaptopodina, nefrina e podocina (Figura 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Figura 5: Morfologia dei podociti derivati dall'hiPSC rispetto ai ciPodociti. Confronto tra podociti derivati da (A,B) hiPSC da un donatore sano a (C,D) ciPodocytes per quanto riguarda la morfologia cellulare e la filopodia utilizzando un microscopio a contrasto di fase (A,C) e un microscopio elettronico a scansione (B,D). Le barre della scala rappresentano 150 μm (A,C) e 20 μm (B,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Pertanto, il confronto dei podociti derivati dall'hiPSC non solo da donatori sani, ma anche da pazienti con mutazioni in geni podocita specifici, consente una caratterizzazione individualizzata della mutazione ex vivo del paziente.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Figura 6: Caratterizzazione di un marcatore podocita specifico in podociti e ciPodciti derivati da hiPSC. Confronto tra i podociti derivati da (A-C) hiPSC da un donatore sano con i ciPodociti (D-F) per quanto riguarda le proteine marcatrici podocite specifiche sinaptopodina (A,D), nefrrina (B,E) e podocina (C,F). Le barre della scala rappresentano 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1. Composizione di tutti i terreni di coltura cellulare e delle soluzioni utilizzate nello studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Questo manoscritto descrive un protocollo in due fasi per generare podociti specifici del paziente dai fibroblasti dermici attraverso la riprogrammazione episomiale in cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e la successiva differenziazione in podociti.

Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Descriviamo un protocollo per la generazione di podociti umani mediante riprogrammazione episomiale dei fibroblasti dermici in cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Queste cellule assomigliano ai podociti in vivo molto meglio dei podociti immortalizzati in termini di processi alimentari di podocita ed espressione del marcatore specifico del podocita. I podociti sono cellule terminalmente differenziate.Pertanto, queste cellule non proliferano più e l'analisi primaria dei podociti in coltura cellulare è limitata. Anche se il problema del numero limitato di cellule è stato superato utilizzando podociti condizionatamente immortalati, questi podociti presentano un fenotipo e un comportamento dedifferenziati, che mette in discussione il loro uso nella ricerca di base. Con l'aiuto di cellule staminali pluripotenti indotte, i podociti possono essere generati in vitro in un numero di cellule quasi illimitato con morfologia tipica del podocita che include processi alimentari distinti ed espressione del marcatore specifico del podocita.Quando si utilizzano le cellule staminali specifiche del paziente per differenziarsi in podocitici, è possibile studiare ex vivo le alterazioni specifiche della malattia della cellula. Nel caso, la biopsia cutanea iniziale è stata prelevata da un paziente con una malattia genetica podocita. I podociti generati con il nostro protocollo sono cellule malate personalizzate portatrici della mutazione del paziente.Pertanto, queste cellule rappresentano un modello ex vivo migliorato per studiare le malattie dei podociti e le potenziali sostanze terapeutiche in un approccio individualizzato.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo video, descriviamo il protocollo per derivare podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte attraverso la differenziazione cellulare in condizioni chimiche definite. I podociti generati possono essere utilizzati per i test di nefrotossicità e la modellazione delle malattie.

Derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte: una procedura per la differenziazione diretta di podociti renali maturi da cellule staminali

L'obiettivo di questo articolo è fornire un protocollo completo e dettagliato su come generare pelle organica umana geneticamente modificata da cheratinociti epidermici e derma umano devitalizzato.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Qui viene presentato un protocollo chimicamente definito per la derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte ad alta efficienza (&gt;90%) e indipendenti da manipolazioni genetiche o selezione di sottopopolazioni. Questo protocollo produce il tipo di cellula desiderato entro 26 giorni e potrebbe essere utile per i test di nefrotossicità e la modellazione della malattia.

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per aggitation tessuto per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto nerual è spiegato.

Generazione di Single-Cell Sospensioni dal tessuto neurale del mouse

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Generazione indotte pluripotenti cellule staminali (IPSC) linee produce linee di diverso potenziale di sviluppo, anche quando passano i test standard per la pluripotenza. Qui si descrive un protocollo per la produzione di topi ottenute interamente da iPSCs, che definisce le linee IPSC come in possesso di pluripotenza...

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.

Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro

Qui, descriviamo un protocollo basato su riprogrammazione epigenetica di cellule staminali embrionali umane (hESCs) verso generare una popolazione omogenea di progenitori muscolari scheletriche che in condizioni di coltura permissive formano cluster tridimensionali delle miofibre contrattili (myospheres), che ricapitolano caratteristiche biologiche umana muscoli scheletrici.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Scopri come generare podociti specifici del paziente da biopsie cutanee mediante riprogrammazione episomale in cellule staminali pluripotenti indotte. Questo metodo avanzato consente di modellare malattie renali in modo personalizzato.

Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Esplora altri video