Name: Saggi sullinvecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata della durata della vita nel nematode C. elegans utilizzando la Lifespan Machine. Questo metodo ad alto rendimento consente di studiare i determinanti fisiologici e molecolari dell'invecchiamento con elevata riproducibilità.

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Ringraziamo Julian Ceron e Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) per aver prodotto l'allele rpb-2 (cer135). Questo progetto è stato finanziato dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (accordo di sovvenzione n. 852201), dal Ministero spagnolo dell'Economia, dell'Industria e della Competitività (MEIC) al partenariato EMBL, dal Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033), dal Programma CERCA/Generalitat de Catalunya, dal premio MEIC Excelencia BFU2017-88615-P, e un premio della Glenn Foundation for Medical Research.

Svelare i misteri dell'invecchiamento: Lifespan Machine per approfondimenti ad alto rendimento

<ol><li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+process%3A+Major+risk+factor+for+disease+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The aging process: Major risk factor for disease and death.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5360-5363 (1991).</li>
<li>Vaupel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodemography+of+human+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biodemography of human ageing.</a> Nature. 464 (7288), 536-542 (2010).</li>
<li>Mair, W., Goymer, P., Pletcher, S. D., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demography+of+dietary+restriction+and+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demography of dietary restriction and death in Drosophila.</a> Science. 301 (5640), 1731-1733 (2003).</li>
<li>Petrascheck, M., Miller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+lifespan+experiment+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of lifespan experiment reproducibility.</a> Frontiers in Genetics. 8, 92(2017).</li>
<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+genetic+background+and+experimental+reproducibility+on+identifying+chemical+compounds+with+robust+longevity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects.</a> Nature Communications. 8 (1), 14256(2017).</li>
<li>Banse, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+lifespan+determination+across+Caenorhabditis+strains+and+species+reveals+assay-specific+effects+of+chemical+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions.</a> Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).</li>
<li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans.</a> Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).</li>
<li>Kirkwood, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+accounts+for+the+wide+variation+in+life+span+of+genetically+identical+organisms+reared+in+a+constant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">What accounts for the wide variation in life span of genetically identical organisms reared in a constant environment.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (3), 439-443 (2005).</li>
<li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+scaling+of+Caenorhabditis+elegans+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing.</a> Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).</li>
<li>Hamilton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).</li>
<li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nature Genetics. 33 (1), 40-48 (2003).</li>
<li>Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replica+set+method%3A+A+high-throughput+approach+to+quantitatively+measure+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The replica set method: A high-throughput approach to quantitatively measure Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57819(2018).</li>
<li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormFarm%3A+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> Elife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Kerr, R. A., Roux, A. E., Goudeau, J. F., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+observatory%3A+High-throughput+exploration+of+behavioral+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging%22%5BJournal%5D)">The C. elegans observatory: High-throughput exploration of behavioral aging.</a> Frontiers in Aging. 3, 932696(2022).</li>
<li>Javer, A., Ripoll-Sánchez, L., Brown, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powerful+and+interpretable+behavioural+features+for+quantitative+phenotyping+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Powerful and interpretable behavioural features for quantitative phenotyping of Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1758), 20170375(2018).</li>
<li>Miller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interaction+with+temperature+is+an+important+determinant+of+nematode+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interaction with temperature is an important determinant of nematode longevity.</a> Aging Cell. 16 (6), 1425-1429 (2017).</li>
<li>Bansal, A., Zhu, L. J., Yen, K., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+lifespan+and+healthspan+in+Caenorhabditis+elegans+longevity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Uncoupling lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans longevity mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E277-E286 (2015).</li>
<li>Huang, C., Xiong, C., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+age-related+changes+of+physiological+processes+that+predict+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measurements of age-related changes of physiological processes that predict lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8084-8089 (2004).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
<li>Oswal, N., Martin, O. M., Stroustrup, S., Bruckner, M. A. M., Stroustrup, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+process+model+links+behavioral+aging+and+lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A hierarchical process model links behavioral aging and lifespan in C. elegans.</a> PLoS Computational Biology. 18 (9), 1010415(2022).</li>
<li>Sen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-16%2FFOXO+requires+protein+phosphatase+4+to+initiate+transcription+of+stress+resistance+and+longevity+promoting+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DAF-16/FOXO requires protein phosphatase 4 to initiate transcription of stress resistance and longevity promoting genes.</a> Nature Communications. 11 (1), 138(2020).</li>
<li>Schiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Caenorhabditis+elegans+processes+sensory+information+to+choose+between+freeloading+and+self-defense+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">et al.Caenorhabditis elegans processes sensory information to choose between freeloading and self-defense strategies.</a> Elife. 9, 56186(2020).</li>
<li>Bazopoulou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+ROS+individualizes+organismal+stress+resistance+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental ROS individualizes organismal stress resistance and lifespan.</a> Nature. 576 (7786), 301-305 (2019).</li>
<li>Guerrero-Rubio, M. A., Hernández-García, S., García-Carmona, F., Gandía-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+using+a+RNAi+model+and+in+vivo+antioxidant+effect+of+Opuntia+fruit+extracts+and+pure+betalains+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span using a RNAi model and in vivo antioxidant effect of Opuntia fruit extracts and pure betalains in Caenorhabditis elegans.</a> Food Chemistry. 274, 840-847 (2019).</li>
<li>Janssens, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics-based+screening+identifies+pharmacological+inhibition+of+Hsp90+as+a+means+to+defer+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics-based screening identifies pharmacological inhibition of Hsp90 as a means to defer aging.</a> Cell Reports. 27 (2), 467-480 (2019).</li>
<li>Kasimatis, K. R., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin-mediated+sterility+induction+system+for+longevity+and+mating+studies+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Auxin-mediated sterility induction system for longevity and mating studies in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (8), 2655-2662 (2018).</li>
<li>Lin, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-16%2FFOXO+and+HLH-30%2FTFEB+function+as+combinatorial+transcription+factors+to+promote+stress+resistance+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DAF-16/FOXO and HLH-30/TFEB function as combinatorial transcription factors to promote stress resistance and longevity.</a> Nature Communications. 9 (1), 4400(2018).</li>
<li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temporal+scaling+of+Caenorhabditis+elegans+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The temporal scaling of Caenorhabditis elegans ageing.</a> Nature. 530 (7588), 103-107 (2016).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).</li>
<li>Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age+generates+phenotypic+variation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).</li>
<li>Wilkinson, D. S., Taylor, R. C., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 353-381 (2012).</li>
<li>Hosono, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+growth+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+by+5-fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine.</a> Experimental Gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).</li>
<li>Lithgow, G. J., Driscoll, M., Phillips, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long+journey+to+reproducible+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A long journey to reproducible results.</a> Nature. 548 (7668), 387-388 (2017).</li>
<li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin-inducible+degradation+%28AID%29+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li>
<li>Baeriswyl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+aging+profiles+in+isogenic+populations+of+Caenorhabditis+elegans+by+bacteria+causing+different+extrinsic+mortality+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates.</a> Biogerontology. 11 (1), 53(2010).</li>
<li>Banse, S. A., Blue, B. W., Robinson, K. J., Jarrett, C. M., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stress-Chip%3A+A+microfluidic+platform+for+stress+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Stress-Chip: A microfluidic platform for stress analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 14 (5), e0216283(2019).</li>
<li>Banse, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+lifespan+determination+across+Caenorhabditis+strains+and+species+reveals+assay-specific+effects+of+chemical+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">Automated lifespan determination across Caenorhabditis strains and species reveals assay-specific effects of chemical interventions.</a> Geroscience. 41 (6), 945-960 (2019).</li>
<li>Swindell, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+failure+time+models+provide+a+useful+statistical+framework+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Accelerated failure time models provide a useful statistical framework for aging research.</a> Experimental Gerontology. 44 (3), 190-200 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Qui forniamo un protocollo dettagliato e accessibile per l'esecuzione di un esperimento utilizzando l'ultima versione di Lifespan Machine. Abbiamo dimostrato che il passaggio critico per ottenere curve di sopravvivenza ben risolte è l'esclusione manuale di oggetti non vermi durante l'acquisizione post-immagine. L'annotazione manuale del tempo di morte ha un piccolo effetto sulla forma complessiva delle curve di sopravvivenza, dimostrando che la stima del tempo di morte completamente automatizzata è efficiente anche senza annotazione manuale (Figura 8). Al contrario, l'acquisizione di dati di invecchiamento comportamentale di alta qualità richiede un'annotazione più attenta dei tempi di morte, soprattutto negli individui longevi (Figura 9). Pertanto, la quantità di tempo necessaria per l'annotazione manuale dello storyboard dipenderà in ultima analisi dal risultato specifico misurato. Nel complesso, troviamo che quando si lavora con l'LSM, gli sforzi del ricercatore sono più cruciali durante la configurazione sperimentale e, in misura minore, durante l'analisi post-acquisizione dell'immagine. Infine, evidenziamo il valore dei saggi automatizzati ad alto rendimento nella produzione di dati di sopravvivenza e invecchiamento comportamentale altamente risolti, aumentando al contempo la produttività dei ricercatori e supportando la riproducibilità sperimentale.
L'LSM ospita i nematodi su piastre di agar, ricreando il classico saggio manuale della durata della vita in un contesto automatizzato. Altri strumenti sono stati sviluppati per automatizzare la misurazione della durata della vita in C. elegans utilizzando diversi metodi di confinamento dei nematodi. Questi includono approcci in cui i singoli nematodi sono alloggiati in mezzi solidi (WorMotel15) o all'interno di un dispositivo microfluidico (Lifespan-on-a-chip11) o quelli che tracciano una popolazione più ampia di animali utilizzando la microfluidica (WormFarm14). I vantaggi delle piattaforme microfluidiche includono la possibilità di un controllo ambientale preciso e in tempo reale e la rimozione automatizzata della progenie mediante esclusione dimensionale. Tuttavia, i suddetti dispositivi finora non si sono dimostrati facilmente scalabili, in quanto richiedono un'ampia gestione manuale e spesso si basano sull'acquisizione quotidiana di immagini o video attivata da uno sperimentatore. Altre piattaforme, come lo Stress-Chip39, utilizzano gli scanner piani modificati progettati per l'LSM per l'imaging di dispositivi microfluidici personalizzati.
A differenza di altri metodi, l'LSM dispone di ampie funzionalità di annotazione e convalida dei dati, consentendo così agli utenti di eseguire sistematicamente il controllo di qualità necessario per raccogliere dati sulla durata della vita ad alta risoluzione, precisi e accurati in un contesto ad alta produttività13. La tecnica è versatile grazie all'uso degli attuali protocolli di laboratorio basati su piastre di agar e offre un vantaggio unico per la scalabilità sperimentale grazie alla relativa facilità di allineamento di grandi gruppi di scanner piani. Sebbene l'LSM richieda un investimento iniziale di tempo per la creazione, il funzionamento e la formazione degli utenti sul software specializzato, questi costi sono bilanciati dalla produzione robusta e ad alta produttività di dati sulla durata della vita. Gruppi di macchine di 50 o più scanner sono stati distribuiti in diversi laboratori, funzionando ininterrottamente per più di un decennio40.
L'LSM ha delle limitazioni. Gli animali sono alloggiati in scanner durante la raccolta automatizzata dei dati di sopravvivenza, limitando così la capacità dei ricercatori di eseguire interventi sperimentali simultanei all'osservazione e richiedendo la sterilizzazione degli animali o l'avvio di esperimenti dopo la fase riproduttiva dei nematodi. Le variazioni di temperatura sono una rara eccezione alla limitazione degli interventi, in quanto la temperatura ambientale può essere modulata senza la necessità di aprire gli scanner e accedere agli animali. Nei casi in cui è necessario applicare interventi pratici ai nematodi di mezza età, una soluzione comune è quella di ritardare l'inizio dell'osservazione automatizzata fino a quando non è stata eseguita la necessaria manipolazione degli animali. Inoltre, c'è una variazione intrinseca nella posizione delle lastre all'interno e tra gli scanner. Questi possono essere soggetti a piccole differenze locali nelle condizioni ambientali (come la temperatura, la luce, la ventilazione, ecc.), che potrebbero influenzare C. Durata della vita di Elegans 19. Questa influenza ambientale può essere ulteriormente quantificata e studiata utilizzando modelli di regressione accelerata del tempo di guasto41. Un modo per mitigare questo effetto è semplicemente ridimensionare il numero di lastre e scanner per ottenere una misurazione rigorosa indipendente dalle fluttuazioni ambientali. Comunemente, le piastre della stessa condizione sono distribuite in modo casuale all'interno di ogni scanner e le dimensioni della popolazione superiori a 500 individui per condizione e tra gli scanner hanno dimostrato stime di sopravvivenza statisticamente robuste31.
Nel complesso, l'LSM consente la raccolta ad alta precisione e su larga scala di dati sulla sopravvivenza e sull'invecchiamento comportamentale e potrebbe consentire di eseguire screening precedentemente non fattibili in modo quantitativo. In questo modo, l'LSM contribuisce a un importante progresso tecnico per la raccolta standardizzata delle curve di sopravvivenza e fornisce un nuovo quadro per lo studio accoppiato della durata della vita e dell'invecchiamento comportamentale nei nematodi.

L'invecchiamento è un processo complesso e sfaccettato, caratterizzato da un declino della funzione fisiologica di un organismo, che porta ad un aumento del rischio di malattia e morte nel tempo1. La durata della vita, misurata come il tempo che intercorre tra la nascita o l'inizio dell'età adulta fino alla morte, fornisce un risultato inequivocabile dell'invecchiamento2 e un indicatore indiretto ma rigorosamente quantitativo per misurare il tasso relativo di invecchiamento tra le popolazioni3. Gli studi sull'invecchiamento spesso dipendono da misurazioni accurate della durata della vita, simili agli studi clinici, per confrontare i risultati tra una popolazione esposta a un intervento e un gruppo di controllo non esposto. Sfortunatamente, i problemi di riproducibilità pervadono la ricerca sull'invecchiamento, a volte a causa di esperimenti statisticamente sottodimensionati4 e spesso a causa della sensibilità intrinseca dei saggi sulla durata della vita a sottili variazioni nell'ambiente5. Gli esperimenti robusti richiedono repliche multiple di grandi popolazioni e questo processo beneficia in particolare della scalabilità sperimentale offerta dall'automazione6.
Le rigorose esigenze dei saggi sulla durata della vita derivano dall'imprevedibilità del processo di invecchiamento stesso. Gli individui isogenici ospitati in ambienti identici mostrano tempi di morte e tassi di declino fisiologicodiversi 7, suggerendo che la durata della vita comporta un alto grado di stocasticità 7,8. Pertanto, le grandi popolazioni sono tenute a misurare i cambiamenti quantitativi nel processo di invecchiamento, come i cambiamenti nella durata media o massima della vita, e a superare le distorsioni derivanti dalla variabilità individuale. Inoltre, la capacità di saggi ad alto rendimento sulla durata della vita è fondamentale per supportare gli studi sulle forme delle curve di sopravvivenza e sui modelli delle dinamiche dell'invecchiamento9.
Il nematode Caenorhabditis elegans è un modello inestimabile per la ricerca sull'invecchiamento grazie alla sua breve durata di vita, alla trattabilità genetica e al rapido tempo di generazione, che sottolineano la sua idoneità per saggi di invecchiamento e durata della vita ad alto rendimento. Tradizionalmente, la durata della vita in C. Elegans è stato misurato seguendo una piccola popolazione sincronizzata di circa 50-100 animali nel tempo su supporti solidi e annotando il tempo delle singole morti. Man mano che gli animali invecchiano e perdono mobilità, è necessario valutare manualmente i tempi di morte e controllare individualmente gli animali e controllare i piccoli movimenti della testa o della coda. Questo è di solito un processo noioso e laborioso, anche se sono stati fatti sforzi per accelerarlo 10,11,12. È importante sottolineare che la lentezza delle pipeline sperimentali ostacola i progressi nella nostra comprensione dell'invecchiamento e dell'efficacia degli interventi testati.
Per soddisfare le esigenze della ricerca sull'invecchiamento per i dati quantitativi, sono state sviluppate molte tecnologie per automatizzare la raccolta dei dati, tra cui una notevole gamma di approcci, dalle camere microfluidiche agli scanner piani 13,14,15,16,17,18. L'LSM si differenzia dagli altri metodi per la sua ampia ottimizzazione per la raccolta di dati di durata altamente precisi e accurati, che si ottiene attraverso lo sviluppo di attenti protocolli di calibrazione delle apparecchiature combinati con un'ampia suite software che consente agli utenti di convalidare, correggere e perfezionare le analisi automatizzate13. Sebbene il software possa, in linea di principio, essere applicato a diverse modalità di imaging, in pratica, la maggior parte degli utenti utilizza scanner piani modificati per consentire un controllo preciso della temperatura e dell'umidità ambientale, fattori di fondamentale importanza a causa del loro effetto principale sulla durata della vita19. L'LSM acquisisce immagini dei nematodi ogni 20 minuti a intervalli che vanno da giorni a mesi, a seconda delle condizioni ambientali e del genotipo. I dati prodotti hanno una risoluzione temporale molto più elevata rispetto ai dati dei saggi manuali e le immagini raccolte forniscono una registrazione visiva permanente della posizione del nematode per tutta la durata della vita. Utilizzando metodi di apprendimento automatico, i tempi di morte vengono assegnati automaticamente a ciascun individuo. Questi risultati possono essere convalidati rapidamente e manualmente utilizzando un software client chiamato "Worm Browser". Grazie al suo hardware e software, l'LSM è in grado di generare curve di sopravvivenza statisticamente indistinguibili dal punteggio manuale dei decessi per mano di ricercatori esperti, con l'ulteriore vantaggio di ridurre il carico di lavoro e aumentare la scalabilità13.
L'ultima versione dell'LSM consente anche lo studio dell'invecchiamento comportamentale raccogliendo dati morfologici e comportamentali durante tutta la vita del nematode e riportandoli insieme alla durata della vita di ciascun individuo. In particolare, l'LSM cattura il tempo di cessazione del movimento vigoroso (VMC) di ciascun animale, un punto di riferimento spesso utilizzato per quantificare la "durata della salute" di un individuo come distinto dalla sua durata di vita. Raccogliendo simultaneamente dati sulla durata della vita e sull'invecchiamento comportamentale, l'LSM supporta lo studio degli interventi che possono avere effetti differenziali su diversi esiti fenotipici dell'invecchiamento20. Una varietà di fenotipi osservabili macroscopicamente può essere utilizzata per studiare l'invecchiamento comportamentale, come il movimento del corpo o il pompaggio faringeo21, l'integrità dei tessuti22 e la velocità di movimento o la rotazione indotta da stimoli17. I confronti tra diversi fenotipi di invecchiamento possono supportare l'analisi della struttura causale dei processi di invecchiamento. Ad esempio, il confronto tra VMC e durata della vita è stato recentemente utilizzato per caratterizzare due distinti processi di invecchiamento in C. elegans23.
Sebbene inizialmente sviluppato per misurare la durata della vita in C. elegans, l'LSM supporta la raccolta di dati comportamentali e di sopravvivenza da una serie di specie di nematodi, tra cui C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri, e P. Pacifico23. La tecnologia facilita lo studio dell'effetto degli interventi biologici e ambientali sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress e sulla resistenza ai patogeni e può essere accoppiata a strumenti sperimentali come saggi mirati di interferenza dell'RNA o sistemi di degradazione delle proteine inducibili dall'auxina. Ad oggi, è stato utilizzato nella letteratura scientifica per una vasta gamma di applicazioni 6,24,25,26,27,28,29,30.
Qui, delineiamo un protocollo passo-passo per l'esecuzione di un esperimento Lifespan Machine utilizzando piastre di agar, dalle fasi iniziali della configurazione sperimentale all'output delle curve di sopravvivenza risultanti. Una caratteristica distintiva dell'LSM è che lo sforzo è altamente front-loaded, il che significa che la maggior parte del tempo del ricercatore viene speso durante la configurazione sperimentale e, in piccola misura, durante l'acquisizione post-immagine. La raccolta dei dati è completamente automatizzata per tutta la durata dell'esperimento e permette al ricercatore di avere un'esperienza "a mani libere". I passaggi qui descritti sono condivisi da molti tipi diversi di saggi di sopravvivenza: la stessa configurazione sperimentale viene eseguita per i saggi di durata della vita, termotolleranza, stress ossidativo e patogenesi. Nella sezione dei risultati rappresentativi, discutiamo un sottoinsieme di dati da un manoscritto pubblicato di recente per illustrare l'efficacia della pipeline di analisi ed evidenziare i passaggi più importanti durante l'analisi delle immagini23.

<table><tbody><tr><td>acido 1-naftaleneacetico (auxina)</td><td>Sigma</td><td>N0640</td><td>Solubilizzare l'auxina in idrossido di potassio 1M e aggiungere nell'agar fuso</td></tr><tr><td>5-fluoro-2-deossiuridina (FUDR)</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td>27.5 &mu; g/mL di FUDR è stato utilizzato per eliminare la progenie da popolazioni su batteri inattivati dai raggi UV</td></tr><tr><td>Detergente per vetri</td><td>Kristal-M</td><td>QB-KRISTAL-M125ml</td><td></td></tr><tr><td>Trattamento idrofobico antiappannamento per vetri</td><td>Rain-X Scheibenreiniger&nbsp;</td><td>C. 059140</td><td></td></tr><tr><td>Gomma opaca</td><td>Crafstman</td><td></td> locale <td>Taglio su un foglio di gomma EPDM ad alta resistenza</td></tr><tr><td>Vetro per scanner</td><td>Fornitore</td><td></td> di hardware locale <td>Lastra di vetro da 9" x 11,5" pollici</td></tr><tr><td>Piastre per scanner</td><td>Scienze</td><td>della vita 351006</td><td>50 mm x 9 mm, piastra di Petri in polistirene</td></tr><tr><td>Termometro di riferimento USB</td><td>Brando</td><td>ULIFE055500</td><td>&nbsp; Per la calibrazione della temperatura degli scanner</td></tr></tbody></table>

saggi sull'invecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita

High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assays Using the Lifespan Machine

Gli animali geneticamente identici tenuti in un ambiente costante mostrano un'ampia distribuzione della durata della vita, riflettendo un grande aspetto stocastico non genetico dell'invecchiamento conservato in tutti gli organismi studiati. Questa componente stocastica significa che per comprendere l'invecchiamento e identificare interventi di successo che prolungano la durata della vita o migliorano la salute, i ricercatori devono monitorare contemporaneamente grandi popolazioni di animali da esperimento. Il tradizionale punteggio manuale dei decessi limita la produttività e la scala necessarie per i test di ipotesi su larga scala, portando allo sviluppo di metodi automatizzati per i saggi ad alta produttività. Lifespan Machine (LSM) è una piattaforma di imaging ad alto rendimento che combina scanner piani modificati con software di elaborazione delle immagini e convalida dei dati personalizzati per il monitoraggio dei nematodi per tutta la vita. La piattaforma costituisce un importante progresso tecnico in quanto genera dati sulla durata della vita altamente risolti temporalmente da grandi popolazioni di animali su una scala senza precedenti e con una precisione statistica e un'accuratezza pari ai saggi manuali eseguiti da ricercatori esperti. Recentemente, l'LSM è stato ulteriormente sviluppato per quantificare i cambiamenti comportamentali e morfologici osservati durante l'invecchiamento e metterli in relazione con la durata della vita. In questo articolo viene descritto come pianificare, eseguire e analizzare un esperimento automatizzato sulla durata della vita utilizzando LSM. Evidenziamo inoltre i passaggi critici necessari per il successo della raccolta di dati comportamentali e curve di sopravvivenza di alta qualità.

La riproducibilità sperimentale nei saggi di durata della vita è impegnativa e richiede sia condizioni sperimentali strettamente controllate che grandi popolazioni per ottenere una risoluzione statistica sufficiente 4,36. L'LSM è particolarmente adatto per il rilevamento di grandi popolazioni di animali in un ambiente costante con un'elevata risoluzione temporale. Per dimostrare la capacità dell'LSM, evidenziare le fasi cruciali dell'analisi e aiutare i ricercatori a dare priorità ai loro sforzi di lavoro, presentiamo un sottoinsieme di dati provenienti da un esperimento ottimaleprecedentemente pubblicato 23. A causa della natura di questo esperimento come test dose-risposta, è stato necessario un numero considerevole di animali per rilevare in modo affidabile le alterazioni della durata della vita. A mano, questo esperimento richiederebbe un intenso impegno di tempo da parte di più ricercatori o, se ridimensionato, porterebbe a risultati sottodimensionati. Il set di dati ha misurato i cambiamenti quantitativi nella durata della vita dopo la rimozione del gene della subunità della RNA polimerasi II (b) (RPB-2), necessario per la trascrizione dell'RNA messaggero. Utilizzo del sistema auxin-inducibile37 in C. elegans, il locus endogeno di RPB-2 è stato marcato con una sequenza di degron per ubiquitilare condizionatamente e degradare RPB-2 utilizzando diverse concentrazioni di auxina (acido α-naftaleneacetico). L'esperimento è stato eseguito su AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] con cer135 corrispondente al tag AID inserito in CRISPR rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG23. Le condizioni sperimentali erano ad una temperatura di 20 °C e utilizzando NEC937 inattivato ai raggi UV (OP50 ΔuvrA; KanR)38E. Coli. Gli ermafroditi sono stati sterilizzati trasferendo i nematodi durante la fase finale L4 su piastre contenenti 5-fluoro-2-deossiuridina (FUdR). I nematodi sono stati trasferiti durante il secondo giorno dell'età adulta in piastre contenenti diverse concentrazioni di auxina. Nello studio originale, gli autori hanno dimostrato che in presenza di auxina, la degradazione di RPB-2 ha ridotto la durata della vita in modo dose-dipendente23. 
Qui, dimostriamo il contributo che la convalida e l'annotazione dei dati post-esperimento apportano all'output finale della curva di sopravvivenza (Figura 8). Nelle ultime fasi dell'analisi delle immagini all'interno dello storyboard di Worm Browser, abbiamo confrontato le curve di sopravvivenza grezze prodotte prima dell'annotazione dello storyboard con le curve di sopravvivenza prodotte dopo l'esclusione manuale di oggetti non worm e anche con le curve di sopravvivenza prodotte dopo l'annotazione sia degli oggetti non worm che dei tempi di morte individuali (Figura 8A-C). Abbiamo scoperto che le curve di sopravvivenza iniziali prodotte prima dell'annotazione dello storyboard (Figura 8A) erano distorte dall'inclusione impropria di oggetti non vermiformi, che era più evidente nelle code delle curve di sopravvivenza. Prima dell'annotazione manuale, le curve di sopravvivenza includevano tutti gli oggetti rilevati dalla macchina come potenziali oggetti worm, circa la metà dei quali, a causa del tasso di falsi positivi intenzionalmente elevato, erano oggetti non worm e dovevano essere esclusi manualmente (Figura 8D). Questo è dovuto alla progettazione, poiché gli algoritmi sono calibrati per avere un tasso di falsi positivi relativamente elevato al fine di evitare falsi negativi, poiché è molto più facile escludere gli oggetti inclusi in modo errato piuttosto che cercare e recuperare gli oggetti esclusi in modo errato. Dopo aver escluso gli oggetti non vermi durante l'annotazione manuale dello storyboard, le curve di sopravvivenza risultanti erano di risoluzione molto più elevata (Figura 8B,E) e un'ulteriore annotazione manuale dei tempi di morte sullo storyboard ha prodotto cambiamenti non superiori a ~4% nella durata media stimata. Dimostriamo, quindi, che la rimozione di oggetti non-worm durante la pipeline di analisi dell'immagine del LSM è il passo cruciale per ottenere curve di sopravvivenza ben risolte.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65462/65462fig08.jpg"> Figura 8: L'effetto della convalida manuale dei dati sulle curve di sopravvivenza. La degradazione di RPB-2 accorcia il C. Durata della vita degli elegans in presenza di auxina (K-NAA: acido α-naftalenacetico) in modo dose-dipendente. (A) Curve di sopravvivenza tracciate dall'output grezzo LSM dopo il controllo di qualità delle lastre e senza annotazione manuale degli oggetti worm sullo storyboard di Worm Browser. (B) Curve di sopravvivenza tracciate dopo l'annotazione manuale degli oggetti worm sullo storyboard. (C) Curve di sopravvivenza tracciate dopo l'annotazione manuale degli oggetti del verme e dei tempi di morte sullo storyboard. (D) Riepilogo di tutti gli oggetti rilevati dall'LSM. Gli oggetti worm censurati includevano oggetti esclusi automaticamente (ad esempio, a causa di worm che si spostavano al di fuori dell'area scansionata) o manualmente dallo sperimentatore (ad esempio, a causa dello scoppio di worm). (E) Rappresentazione tabellare della durata media stimata dopo l'annotazione manuale dell'oggetto verme (a sinistra) e l'annotazione aggiuntiva del tempo di morte manuale (a destra). Differenza percentuale nella durata media della vita tra gruppi vicini di diverse concentrazioni di auxina e la potenza statistica di rilevamento. Tutti i grafici sono stati tracciati con il software statistico JMP. I dati per questa figura sono stati adattati con il permesso di Oswal et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65462/65462fig8v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Andando oltre la durata della vita come singolo punto finale per lo studio dell'invecchiamento, abbiamo quindi considerato l'invecchiamento comportamentale e indagato quali passaggi dell'analisi delle immagini post-sperimentali fossero più cruciali per misurarlo. Concentrandoci sulla relazione tra la cessazione del movimento vigoroso (VMC) e la durata della vita, abbiamo confrontato l'output LSM in diverse fasi dell'analisi e della convalida delle immagini (Figura 9A-D). Abbiamo scoperto che gli oggetti non worm mostravano una relazione unica tra l'apparente VMC e la durata della vita, con i due che venivano annotati come se si verificassero quasi contemporaneamente in ogni oggetto (Figura 9A). Al contrario, i veri nematodi di solito hanno smesso di muoversi vigorosamente diversi giorni prima del loro momento di morte (Figura 9A). Questa differenza nella relazione tra VMC e durata fornisce un ulteriore mezzo per identificare ed escludere rapidamente gli oggetti non worm.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65462/65462fig09.jpg"> Figura 9: L'effetto della convalida manuale dei dati sull'analisi della cessazione del movimento vigoroso (VMC). (A) Dati di invecchiamento comportamentale senza annotazione manuale degli oggetti worm sullo storyboard di Worm Browser, che visualizzano la relazione tra i tempi di morte e i tempi VMC negli oggetti non worm (in nero) rispetto agli oggetti worm (in rosso). (B) Dati sull'invecchiamento comportamentale tracciati dopo l'annotazione manuale degli oggetti worm sullo storyboard. (C) Dati sull'invecchiamento comportamentale tracciati dopo l'annotazione manuale degli oggetti vermi e dei tempi di morte sullo storyboard. (D) Rappresentazione tabellare della durata media della vita residua (ARL; ottenuta dall'intercettazione tra l'età di morte e l'età VMC) in diverse fasi della pipeline di analisi delle immagini e differenza percentuale nell'ARL tra l'annotazione dell'oggetto worm e l'ulteriore annotazione del tempo di morte. (E) Rappresentazione grafica degli ARL stimati nelle diverse fasi dell'analisi post-acquisizione dell'immagine e la loro relazione con la durata della vita del verme (che dipende dalla concentrazione di auxina: acido α-naftaleneacetico). L'adattamento della spline è stato eseguito utilizzando un metodo di spline cubica. Tutti i grafici sono stati tracciati con il software statistico JMP. I dati per questa figura sono stati adattati con il permesso di Oswal et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65462/65462fig9v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Abbiamo scoperto che l'annotazione e l'esclusione di oggetti non worm utilizzando il Worm Browser era sufficiente per fornire una stima approssimativa della relazione tra la VMC e i tempi di morte (Figura 9A-C), ricapitolando le dinamiche attese del declino fisiologico nei nematodi23. Per esplorare ulteriormente questo aspetto, abbiamo considerato lo stesso set di dati della RNA polimerasi II e abbiamo stimato la durata media della vita residua (ARL) dopo VMC per ciascuna sottopopolazione come intercettazione di un modello di regressione lineare che mette in relazione la durata della vita con VMC. Per comprendere l'effetto dell'annotazione dei dati sull'ARL, è stato ricalcolato l'ARL dopo ogni passaggio dell'annotazione dei dati (Figura 9E). Abbiamo scoperto che l'annotazione manuale dei tempi di morte nell'analisi dell'invecchiamento comportamentale era particolarmente importante nei vermi più longevi, in questo caso, quelli esposti alle concentrazioni più basse di auxina (Figura 9D,E). In contrasto con il suo effetto minimo sulle curve di sopravvivenza, l'annotazione manuale dei tempi di morte ha avuto un effetto sostanziale sulla relazione quantitativa tra la VMC e la durata della vita, aumentando l'ARL stimato, ad esempio a 0 μM di auxina, da 8,09 giorni a 10,42 giorni dopo l'annotazione del tempo di morte; ciò rappresenta una differenza ARL del 29%. Pertanto, abbiamo scoperto che la relazione tra VMC e tempi di morte spiegati da ARL era molto più sensibile all'annotazione manuale dei tempi di morte rispetto alle misurazioni dei tempi di morte per la sola durata della vita. Questa sensibilità può essere spiegata dalla durata relativa dell'ARL e dalla durata della vita; gli stessi aggiustamenti al tempo di morte saranno di solito piccoli rispetto alla durata della vita, ma grandi rispetto all'ARL. Pertanto, gli aggiustamenti ai tempi di morte avranno un effetto relativo maggiore sull'ARL rispetto alla durata della vita.
File supplementare 1: Struttura del file di pianificazione dell'esperimento Lifespan Machine. Il programma dell'esperimento è composto da tre parti. Innanzitutto, vengono incluse le informazioni di base sull'esperimento, ad esempio il nome e la specifica di acquisizione. Da questa parte, in genere è necessario modificare solo il nome dell'esperimento per ogni nuovo esperimento. La seconda parte del documento viene generata esportando le aree di scansione dal Worm Browser e specifica la posizione fisica delle aree di scansione per ogni scanner ("asuna", "bulma", "moscow", "rio", "yuno" e "yuki" in questo esempio). Questi vengono sostituiti per ogni nuovo esperimento e vengono copiati dai file TXT generati per ogni scanner singolarmente durante il passaggio 4.1.2.3. La terza parte del documento fornisce informazioni sulla durata dell'esperimento, che dovrebbe essere modificata per ogni nuovo esperimento, e sulla frequenza di acquisizione. Il dispositivo eseguirà la scansione di ogni area definita una alla volta a intervalli specificati per la durata dell'intero esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65462/Supplementary%20text%201.txt" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

La piattaforma di imaging "The Lifespan Machine" automatizza l'osservazione permanente di grandi popolazioni. Mostriamo i passaggi necessari per eseguire saggi sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress, sulla patogenesi e sull'invecchiamento comportamentale. La qualità e la portata dei dati consentono ai ricercatori di studiare gli interventi sull'invecchiamento nonostante la presenza di variazioni biologiche e ambientali.

Saggi sull'invecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita

Genetically identical animals kept in a constant environment display a wide distribution of lifespans, reflecting a large non-genetic, stochastic aspect ...

Nel nostro laboratorio studiamo i determinanti fisiologici e molecolari dell'invecchiamento e della durata della vita, e lo facciamo in modo quantitativo. Per questo, usiamo il nematode C.elegans come modello geneticamente trattabile per il rapido invecchiamento e lo usiamo con una combinazione di strumenti come la Lifespan Machine. La riproducibilità è una questione importante nella ricerca sull'invecchiamento.Per ovviare a questo problema, sono spesso necessarie grandi popolazioni di animali per misurare i cambiamenti robusti nella durata della vita e, pertanto, questo processo beneficia davvero di protocolli automatizzati ad alto rendimento. Molte persone hanno usato la Lifespan Machine per molti scopi diversi e ne sono davvero felici. Per le nostre applicazioni, i due risultati più significativi sono, in primo luogo, nel 2016, la nostra scoperta del ridimensionamento temporale come risultato comune di molti interventi sull'invecchiamento.E in secondo luogo, nel 2022, la nostra scoperta che la durata della salute e della vita sono determinate da distinti cali fisici sottostanti. La Lifespan Machine adatta i protocolli comunemente usati per raccogliere dati sulla sopravvivenza e sull'invecchiamento comportamentale da grandi popolazioni di nematodi. Grazie all'automazione e all'alta frequenza di acquisizione delle immagini, elimina il noioso processo quotidiano dei saggi di sopravvivenza manuali e raccoglie set di dati precedentemente irraggiungibili sul comportamento dei nematodi.

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