Name: in vivo Imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Scopri l'imaging del calcio in vivo per analizzare le risposte neuronali dei gangli della radice dorsale lombare-6 a stimoli somatici e viscerali nel topo. Questo metodo avanzato consente di studiare i meccanismi del dolore viscerale e gli effetti analgesici dell'agopuntura con risoluzione cellulare.

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Questo studio è stato finanziato dal National Key R&D Program of China (n. 2022YFC3500702), dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82230123, 82174281).

Questo protocollo sugli animali è stato approvato dai Comitati Etici per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, Accademia Cinese delle Scienze Mediche, ed è conforme alla Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da esperimento per garantire un uso e un disagio minimo degli animali. I topi Pirt-cre sono stati gentilmente donati dal Dr. Xinzhong Dong della Johns Hopkins University (Baltimora, MD). I topi Rosa26-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). La seguente procedura è ottimizzata per entrambi i sessi di topi di peso compreso tra 20 e 35 g. L'età raccomandata per i topi sottoposti all'operazione era compresa tra 8 e 14 settimane. Per mostrare le principali popolazioni di neuroni DRG sono stati adottati indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come i topi Pirt-GCaMP6s, o topi C57 normali iniettati per via intratecale con GECI virali. Topi geneticamente modificati iniettati per via intratecale con GECI virali o incrociati con topi Rosa26-GCaMP mostrerebbero la popolazione specifica di neuroni DRG. Camici da laboratorio, guanti e maschere sono stati indossati per tutto il protocollo. Dopo l'esperimento, i topi sono stati soppressi con inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale.
1. Configurazione pre-operatoria
<ol>
	<li>Verificare che il dispositivo di ventilazione per anestesia (vedi Tabella dei materiali) sia stato installato correttamente.</li>
	<li>Assicurarsi che il sistema di imaging (vedere la Tabella dei materiali) sia stato pre-aperto e funzioni correttamente. 
	NOTA: Le procedure operative e di imaging sono state condotte in sequenza, mentre il processo di analisi può essere completato offline in un secondo momento.</li>
</ol>
2. Anestetizzazione
<ol>
	<li>Iniettare intraperitonealmente nel topo una soluzione di tribromoetanolo (1,25%, 250 mg/kg, vedere la Tabella dei materiali)13,14,15. Valutare la profondità dell'anestesia tramite un pizzico di dita dei piedi prima di procedere.</li>
	<li>Radere i peli nella zona lombare e nella parte cervicale ventrale.</li>
	<li>Posizionare il mouse in posizione supina sul termoforo (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Applicare un unguento sugli occhi dell'animale per evitare che si secchino. 
	NOTA: La profondità dell'anestesia è stata mantenuta fino a quando il topo non ha mostrato alcuna risposta a un pizzico della zampa posteriore durante tutte le procedure chirurgiche e di registrazione. Se l'animale mostrava segni di dolore, venivano somministrati altri 0,2 ml di soluzione di tribromoetanolo per via intraperitoneale, oppure veniva somministrato isoflurano allo 0,5% per via intratracheale dopo l'applicazione del ventilatore per prevenire le contrazioni muscolari e garantire la profondità dell'anestesia.</li>
</ol>
3. Tracheotomia
<ol>
	<li>Praticare un'incisione sulla linea mediana di circa 2 cm nella pelle della gola, utilizzando una lama chirurgica, dallo sterno al mento.</li>
	<li>Estendere l'incisione e spingere delicatamente da parte le ghiandole sottomascellari, garantendo la piena esposizione dei muscoli digastrici situati sotto le ghiandole, che corrono longitudinalmente lungo il centro della trachea.</li>
	<li>Una volta vista la cucitura della muscolatura paratracheale al centro dei muscoli, esporre la trachea separando delicatamente la muscolatura e ritraendola.</li>
	<li>Creare un'incisione trasversale sulla trachea, abbastanza grande da ospitare la cannula della trachea (diametro esterno 1,3 mm, lunghezza 13 mm, con un adattatore a Y, vedi Tabella dei materiali) diretta verso il polmone (Figura 1A).</li>
	<li>Coprire la trachea con i muscoli paratracheali e le ghiandole sottomascellari, quindi suturare i tessuti circostanti alla pelle strato per strato utilizzando suture chirurgiche 5-0.</li>
</ol>
4. Esposizione delle vertebre lombari
<ol>
	<li>Posizionare l'animale in posizione prona sul termoforo.</li>
	<li>Creare un'incisione sulla linea mediana di circa 7 cm nella parte bassa della schiena, che si estende dalla vertebra lombare-5 a quella sacrale-1.</li>
	<li>Esporre con cura i processi spinosi delle tre vertebre spostando lateralmente i muscoli longissimus lumborum.</li>
	<li>Esporre i tre processi articolari successivi e i processi mamillari, con il segmento di registrazione al centro delle vertebre, spostando da parte le parti interne del longissimus lumborum bilaterale, i muscoli dorsali della colonna vertebrale cervicale e i muscoli della semispina cervicale dorsale (Figura 1B). 
	NOTA: I processi articolari e i processi mamillari delle tre vertebre sono stati esposti per consentire al morsetto spinale di fissare l'animale senza spostamenti durante la registrazione.</li>
</ol>
5. Esposizione del ganglio della radice dorsale
<ol>
	<li>Immobilizzare in modo sicuro l'animale con una pinza dentata (vedi Tabella dei materiali) sui processi articolari bilaterali delle vertebre vicine. Quindi, usa il forcipe rongeur per rimuovere i processi articolari e mamillari sinistro o destro delle vertebre lombari-6.</li>
	<li>Esporre con cura il DRG lombare-6 sinistro o destro dopo aver eliminato i tessuti connettivi sopra di esso, mantenendo l'epinevrio intatto sul lato sinistro o destro delle vertebre lombari-6.</li>
	<li>Garantire le condizioni attive del DRG esposto coprendo le aree esposte con piccoli batuffoli di cotone imbevuti di soluzione salina. 
	NOTA: Cambiare i batuffoli di cotone fino a quando non ci sono perdite di sangue sottili vicino al DRG esposto e al tessuto circostante, poiché ciò potrebbe influire sull'imaging chiaro dei neuroni DRG. Sostituire i batuffoli di cotone inumiditi con soluzione salina fino a quando non ci sono perdite rosse o gialle di liquidi tissutali.</li>
</ol>
6. Immobilizzazione e ventilazione
<ol>
	<li>Posiziona l'animale con il DRG lombare-6 esposto su un termoforo sul palco di un morsetto spinale personalizzato16,17 (Figura 1C).</li>
	<li>Fissare l'animale utilizzando due morsetti sulla colonna vertebrale delle vertebre vicine per ridurre al minimo il movimento durante il test (Figura 1D).</li>
	<li>Continuare a cambiare i batuffoli di cotone inumiditi con soluzione salina fino a quando l'area chirurgica non è sufficientemente pulita (Figura 1E).</li>
	<li>Monitorare la ventilazione e la pulsossimetria durante l'esperimento. 
	NOTA: Immobilizzare le colonne vertebrali utilizzando il morsetto spinale personalizzato, quindi regolare l'angolazione del cuscinetto in modo che l'obiettivo del microscopio sia perpendicolare al DRG. Effettuare le regolazioni necessarie per allineare l'obiettivo e il DRG utilizzando i regolatori angolari.</li>
</ol>
7. Configurazione hardware e software per l'imaging
<ol>
	<li>Inserire la colonna vertebrale personalizzata clamp nel tavolino del microscopio progettato su misura (Figura 1F,G).</li>
	<li>Posizionare un obiettivo pneumatico a lunga distanza di lavoro 10x/0,32 di un microscopio confocale (vedere la Tabella dei materiali) sopra il DRG esposto per l'imaging (Figura 1G).</li>
	<li>Cattura z-stack in time-lapse del DRG L-6 intatto con una risoluzione di 25 μm/passo e una risoluzione di 512 x 512 o 1024 x 1024 pixel. La durata di una scansione in stack dell'intero DRG varia da 5 a 15 s in base a fattori quali la perpendicolarità della posizione del DRG rispetto alla lente dell'obiettivo, la profondità e la velocità di ogni fase di scansione e la risoluzione dell'imaging.</li>
	<li>Eseguire la scansione XYZT del DRG con 4-8 stack, che includono 1-3 stati basali, 2-3 stimoli di agopuntura o distensione colorettale viscerale (CRD) e 1-2 stati post-stimoli.</li>
</ol>
8. Agopuntura/stimoli viscerali e imaging
<ol>
	<li>Applicare stimoli di spazzolamento o pizzicamento alle aree della parte bassa della schiena, degli arti posteriori o delle zampe posteriori dell'animale per valutare il campo ricettivo più sensibile dei neuroni DRG ripresi (Figura 1H).</li>
	<li>Somministrare gli stimoli dell'agopuntura manualmente o con uno stimolatore di agopuntura e nervo disponibile in commercio (Figura 1F) (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Indurre stimoli viscerali utilizzando la distensione colorettale (CRD) con un manometro dell'aria autocostruito (Figura 1H). 
	NOTA: Testare il campo recettivo più sensibile dei neuroni DRG ripresi spazzolando o pizzicando le aree ricettive del DRG lombare-6. Se questi stimoli causano cambiamenti di fluorescenza durante la registrazione dello stack XYZT, seleziona i punti di agopuntura in queste aree, come il punto di agopuntura lombare BL25 (Dachangshu)18. Scegli i punti di agopuntura (come mostrato in Figura 2) che hanno la pelle e il muscolo all'interno del campo ricettivo dell'innervazione lombare-6.</li>
</ol>
9. Analisi ed elaborazione dei dati
<ol>
	<li>Valutare le risposte evocate al calcio utilizzando un microscopio confocale misurando l'aumento della fluorescenza verde della GCaMP neuronale in seguito al legame con il calcio intracellulare in seguito a stimoli somatici o viscerali.</li>
	<li>Traccia manualmente le cellule visibili e determina le dimensioni delle cellule e l'intensità relativa della fluorescenza utilizzando il software di imaging (Figi, vedi Tabella dei materiali). Definisci i neuroni piccoli, medi e grandi come aventi diametri soma rispettivamente di <20 μm, da 20 a 30 μm e >30 μm, sulla base di studi precedenti17,19.</li>
	<li>Esprimere l'intensità della fluorescenza come rapporto tra l'aumento della fluorescenza massima evocata e il livello basale (ΔF/F0) o il rapporto tra la fluorescenza massima evocata e il livello basale (Ft/F0), dove F0 rappresenta l'intensità massima di fluorescenza misurata durante il periodo di riferimento.</li>
	<li>Misurare la percentuale di neuroni attivati e l'intensità dei transienti di calcio evocati per valutare i cambiamenti nella reattività neuronale a seguito di stimoli somatici o CRD.</li>
	<li>Definisci l'attivazione di una cellula come un aumento dell'intensità di fluorescenza (ΔF) ≥30% del basale (F0). 
	NOTA: Prima di tracciare le celle visibili, regolare la luminosità delle immagini al livello massimo per facilitare l'identificazione dei bordi delle celle. Non tracciare le cellule in caso di incertezza. Rivedi il filmato registrato avanti e indietro per assicurarti che nessuna cella venga trascurata.</li>
</ol>

Advanced Imaging of Dorsal Root Ganglion Neurons for Sensory Modality Research

<ol><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+tactile+acuity+in+chronic+low+back+pain+is+linked+with+structural+neuroplasticity+in+primary+somatosensory+cortex+and+is+modulated+by+acupuncture+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Reduced tactile acuity in chronic low back pain is linked with structural neuroplasticity in primary somatosensory cortex and is modulated by acupuncture therapy.</a> Neuroimage. 217, 116899(2020).</li>
<li>Wei, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+activates+inhibitory+neural+circuits+in+the+somatosensory+cortex+to+relieve+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture activates inhibitory neural circuits in the somatosensory cortex to relieve neuropathic pain.</a> iScience. 24 (2), 102066(2021).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Referred+somatic+hyperalgesia+mediates+cardiac+regulation+by+the+activation+of+sympathetic+nerves+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Referred somatic hyperalgesia mediates cardiac regulation by the activation of sympathetic nerves in a rat model of myocardial ischemia.</a> Neuroscience Bulletin. 38 (4), 386-402 (2022).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+hypersensitivity+as+an+indicator+of+visceral+inflammation+via+c-nociceptor+axon+bifurcation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Cutaneous hypersensitivity as an indicator of visceral inflammation via c-nociceptor axon bifurcation.</a> Neuroscience Bulletin. 37 (1), 45-54 (2021).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+population+of+dorsal+root+ganglion+neurons+unravels+novel+mechanisms+of+visceral+pain+sensitization+and+referred+somatic+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in population of dorsal root ganglion neurons unravels novel mechanisms of visceral pain sensitization and referred somatic hypersensitivity.</a> Pain. 162 (4), 106801081(2021).</li>
<li>Huang, T. Y., Belzer V Fau - Hanani, M., Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+dorsal+root+ganglia%3A+possible+contribution+to+visceral+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in dorsal root ganglia: possible contribution to visceral pain.</a> European Journal of Pain. 14 (1), 49.e1-49.e11 (2010).</li>
<li>Wang, Y. L., Su, Y. S., He, W., Jing, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+relieved+visceral+and+referred+hindpaw+hypersensitivity+in+colitis+rats+by+inhibiting+tyrosine+hydroxylase+expression+in+the+sixth+lumbar+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture relieved visceral and referred hindpaw hypersensitivity in colitis rats by inhibiting tyrosine hydroxylase expression in the sixth lumbar dorsal root ganglia.</a> Neuropeptides. 77, 101957(2019).</li>
<li>Weng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+diminishes+P2X2+and+P2X3+purinergic+receptor+expression+in+dorsal+root+ganglia+of+rats+with+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture diminishes P2X2 and P2X3 purinergic receptor expression in dorsal root ganglia of rats with visceral hypersensitivity.</a> Neural Regeneration Research. 8 (9), 802-808 (2013).</li>
<li>Spencer, N. J., Hibberd, T. J., Lagerström, M., Otsuka, Y., Kelley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+pain+-+Novel+approaches+for+optogenetic+control+of+spinal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Visceral pain - Novel approaches for optogenetic control of spinal afferents.</a> Brain Research. 1693 (Pt B), 159-164 (2018).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+single-fiber+recording+and+intact+dorsal+root+ganglion+with+attached+sciatic+nerve+to+examine+the+mechanism+of+conduction+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo single-fiber recording and intact dorsal root ganglion with attached sciatic nerve to examine the mechanism of conduction failure.</a> Journal of Visualized Experiments. 150, e59234(2019).</li>
<li>Ma, C., Nie, H., Gu, Q., Sikand, P., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+responses+of+cutaneous+C-mechanosensitive+neurons+in+mouse+to+punctate+chemical+stimuli+that+elicit+itch+and+nociceptive+sensations+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">In vivo responses of cutaneous C-mechanosensitive neurons in mouse to punctate chemical stimuli that elicit itch and nociceptive sensations in humans.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (1), 357-363 (2012).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neuroscience Bulletin. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Yao, L., Ye, Q., Liu, Y., Yao, S., Yuan, S., Xu, Q., Deng, B., Tang, X., Shi, J., Luo, J., Wu, J., Wu, Z., Liu, J., Tang, C., Wang, L., Xu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroacupuncture+improves+swallowing+function+in+a+post-stroke+dysphagia+mouse+model+by+activating+the+motor+cortex+inputs+to+the+nucleus+tractus+solitarii+through+the+parabrachial+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Electroacupuncture improves swallowing function in a post-stroke dysphagia mouse model by activating the motor cortex inputs to the nucleus tractus solitarii through the parabrachial nuclei.</a> Nat Commun. 14 (1), 810 PMID: 36781899; PMCID: PMC9925820 (2023).</li>
<li>Tian, D., Liu, B., Huang, S., Shi, W., Tian, Y., Yang, Y., Zhang, D., Zhang, Z., Bu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+Ileus+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postoperative Ileus Murine Model.</a> J Vis Exp. (209), PMID: 39072642 (2024).</li>
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<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+cluster+firing%2C+a+distinct+form+of+sensory+neuron+activation%2C+drives+spontaneous+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain.</a> Neuron. 110 (2), 209-220 (2022).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2Y12+receptor+as+a+new+target+for+electroacupuncture+relieving+comorbidity+of+visceral+pain+and+depression+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">P2Y12 receptor as a new target for electroacupuncture relieving comorbidity of visceral pain and depression of inflammatory bowel disease.</a> Chinese Medicine. 16 (1), 139(2021).</li>
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<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> Journal of Visualized Experiments. 192, e64826(2023).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 59, e2760(2012).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+dorsal+root+ganglia+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice.</a> Nature Communications. 10 (1), 3087(2019).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Si ritiene che l'analgesia dell'agopuntura sia modulata da processi integrativi nel DRG, che coinvolgono un'interazione tra gli impulsi afferenti dalle regioni del dolore e gli impulsi dai punti di agopuntura. Qui, descriviamo una procedura elaborata per l'imaging DRG L6. I vantaggi dell'imaging sono molteplici, tra cui una notevole risoluzione spaziale, la possibilità di imaging ad alta efficienza di grandi aree di neuroni contemporaneamente e la capacità di monitorare specifici sottotipi cellulari e domini subcellulari utilizzando sonde di targeting genico21. Nel midollo spinale, sono state sviluppate molteplici tecniche di laminectomia per l'imaging in vivo dell'attività dei neuroni spinali22,23. Sebbene il DRG si trovi in prossimità del midollo spinale, l'imaging in vivo delle cellule DRG rimane più impegnativo a causa della sua posizione circondata da tessuto connettivo e muscoli. Uno studio precedente ha mostrato un approccio per rilevare le risposte neurali di L5 DRG sotto stimoli somatici24. Poiché i neuroni DRG L5 ricevono per lo più afferenze somatiche invece di afferenze viscerali, rimangono domande sulle procedure chirurgiche per esaminare l'attività dei neuroni DRG che ricevono input somatici e viscerali.
Il metodo qui descritto consente l'imaging stabile del calcio in neuroni geneticamente definiti del DRG durante l'applicazione della stimolazione dell'agopuntura e della stimolazione viscerale in topi intatti. Come accennato nella maggior parte delle tecniche in vivo , la stabilità dell'imaging ottenibile dipende fortemente dal dispositivo di stabilizzazione spinale e da un'anestesia adeguata25. In questo studio, è stato utilizzato un adattatore spinale su misura dotato di regolatori angolari per inclinare comodamente la colonna vertebrale per ottenere immagini nitide del DRG. Un paio di pinze Adson sono state modificate per fungere da morsetti per vertebre spinali attaccati ai bracci articolari, lasciando spazio sufficiente per abbassare una lente d'aria sopra il DRG esposto. È possibile applicare pinze alternative, se necessario, per diversi segmenti del midollo spinale per offrire una migliore stabilità. Si consiglia di sospendere leggermente il midollo spinale e il suo campo di imaging dai morsetti, il che riduce anche lo spostamento respiratorio. Un'altra strategia importante per ridurre al minimo le fluttuazioni durante l'imaging è l'uso di anestesia con cannula tracheale e miorilassanti combinati con la ventilazione meccanica.
Questo studio può anche essere adattato per l'imaging a due fotoni, che può fornire una migliore risoluzione cellulare nei tessuti più profondi. Recentemente, Chen et al. hanno sviluppato una tecnica di imaging che consente ai ricercatori di esaminare l'attività dei neuroni nel DRG di topi svegli per periodi prolungati26. Tuttavia, non è ancora prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori a causa della difficoltà nella preparazione chirurgica. Inoltre, sebbene il metodo qui descritto non sia adatto per l'imaging DRG per settimane in topi svegli, presenta vantaggi nell'applicazione del farmaco e nella stimolazione della radice dorsale poiché la pelle dell'animale può essere cucita a un anello per contenere una piscina per la perfusione di ACSF.
Ci sono anche alcune limitazioni a questo protocollo. Limitare la registrazione ai segmenti della radice dorsale lombare limita l'applicabilità di questa tecnica a vari segmenti gangliari che innervano diversi organi in tutto il corpo, come per lo studio degli organi toracici mediante la registrazione dei DRG toracici. I video di imaging del calcio sono stati analizzati utilizzando il software di imaging. L'analisi dei dati di imaging del calcio presenta delle sfide, come il rilevamento cellulare e l'estrazione del segnale Ca2+ . Gli script scritti su misura in MATLAB sembrano essere uno strumento efficace, ma richiedono che il ricercatore abbia un background di programmazione.

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Erratum: In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

L'agopuntura, parte integrante della medicina tradizionale cinese, ha ottenuto un riconoscimento globale principalmente per la sua efficacia nella gestione del dolore, compreso l'alleviamento del dolore viscerale cronico1. Negli ultimi decenni, la nostra conoscenza dei meccanismi nervosi centrali alla base dell'analgesia dell'agopuntura ha subito una crescita considerevole1,2. Tuttavia, poca attenzione è stata prestata all'esplorazione dei ruoli funzionali dei neuroni dei gangli delle radici dorsali (DRG) nell'indurre l'effetto analgesico dell'agopuntura nella nocicezione viscerale. Gli studi analgesici sulla nocicezione viscerale e sull'agopuntura sono potenzialmente condotti sui neuroni sensoriali primari utilizzando tecniche elettrofisiologiche o altri metodi di registrazione neurale3,4. Tale ricerca aiuta a comprendere la relazione tra input somatici e viscerali da specifici tessuti bersaglio o organi bersaglio, offrendo preziose informazioni sulle condizioni legate all'agopuntura, al dolore viscerale, alla regolazione del sistema nervoso autonomo e alle condizioni mediche correlate.
Essendo i neuroni di primo ordine nel sistema somatosensoriale, i neuroni in DRG sono indicati come neuroni sensoriali primari che hanno un ruolo importante nel trasdurre le informazioni sull'ambiente esterno e sullo stato interno in segnali elettrici e trasmettere segnali al sistema nervoso centrale (SNC). Numerosi studi hanno suggerito che la nocicezione viscerale è stata trasmessa in modo dominante dai neuroni sensoriali i cui corpi cellulari sono nel DRG5,6. Sebbene numerose ricerche abbiano chiarito il meccanismo cellulare e molecolare dei neuroni DRG nell'effetto analgesico indotto dall'agopuntura sul dolore viscerale7,8, esiste pochissima letteratura sulle sue caratteristiche funzionali a causa di difficoltà tecniche9. Diversi metodi per registrare l'attività neurale nel DRG, come la registrazione delle fibre periferiche, la registrazione dell'elettrofisiologia a singola cellula e l'imaging del calcio in vivo, possono essere utilizzati per registrare i modelli e le proprietà dei potenziali d'azione passati lungo gli assoni10. La registrazione del DRG con elettrodi di vetro è stata una delle tecniche più utilizzate per studiare la correlazione tra attività neuronali e diversi stimoli in vivo11. Tuttavia, i metodi tradizionali come la registrazione elettrofisiologica non possono esaminare in modo efficiente un numero sufficiente di cellule e sottotipi cellulari specifici distinti per identificare i neuroni responsivi viscerali in vivo.
Oltre a codificare la sensazione periferica, i neuroni DRG svolgono un ruolo significativo nella trasmissione dei segnali di agopuntura al sistema nervoso centrale. La registrazione elettrofisiologica tradizionale è già stata ampiamente applicata per esplorare la regolazione dell'agopuntura sulle attività anomale dei neuroni DRG indotte dal dolore patologico11. È necessario osservare segmenti appropriati di DRG in relazione all'innervazione sensoriale. Il DRG lombare (L) 6 è stato generalmente osservato per studiare la modulazione del colon4.
I recenti progressi nello sviluppo di metodi ottici e genetici rendono possibile studiare l'attività di grandi popolazioni di neuroni geneticamente marcati simultaneamente12. Tuttavia, mancano ancora metodi dettagliati di imaging del calcio per monitorare l'attività neuronale nella DRG sotto stimolazione viscerale e somatica. Quindi, questo protocollo spiega le procedure per l'osservazione in vivo della responsività dei neuroni L6 DRG alla stimolazione intracolonica e dell'agopuntura. Il metodo qui descritto può essere utilizzato anche per rilevare le caratteristiche dei neuroni sensoriali somatici e viscerali.
L'ampia applicazione e promozione dell'imaging del calcio fornisce uno strumento molto efficace e pratico per la ricerca sull'agopuntura. Considerando i vantaggi dell'imaging del calcio sopra menzionati, questo metodo avrebbe dovuto essere diffuso e applicato nella ricerca sull'agopuntura. Tuttavia, l'utilizzo dell'imaging del calcio nella ricerca sull'agopuntura è ancora relativamente raro. La ragione principale di questa limitazione può essere la difficoltà delle procedure operative e di registrazione. Lo scopo principale di questo articolo è quello di fornire una panoramica di alcuni punti critici nella conduzione delle registrazioni di imaging del calcio dei neuroni L6 DRG nei topi. Soprattutto, speriamo di promuovere l'avanzamento e lo sviluppo della ricerca sull'agopuntura utilizzando questo strumento all'avanguardia in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sistema di anestesia&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td></td> Leica <td>STELLARIS 8</td><td></td></tr><tr><td>DC Regolatore di temperatura</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>DC Regolatore di temperatura Pad riscaldante</td><td>FHC</td><td>40-90-2-05</td><td></td></tr><tr><td>Fiji Software</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Strumenti</td> <td>di scienza fine14558-11</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs Strumenti per la</td><td>scienza fine</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>Spugne di gelatina</td><td>Coltene</td><td>274-007</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Han' s Stimolatore nervoso per agopunti</td><td>Jason Scientific</td><td>HANS-200A</td><td></td></tr><tr><td>Cannula per intubazione</td><td>Apparecchio Harward</td><td>73-2737</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD</td><td>R510</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Topi Pirt-cre</td><td>Johns Hopkins University</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rosa-GCaMP6s&nbsp; topi (AI96)</td><td>Jax Laboratory</td><td>28866</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore spinale</td><td>N/A</td><td>N/A Forbici</td> a molla <td>su misura</td></tr><tr><td></td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanolo</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15019-10</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali

In Vivo Calcium Imaging of Dorsal Root Ganglia Neurons' Response to Somatic and Visceral Stimuli

Viene descritta una tecnica per l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) del lumbar-6 in un topo da laboratorio vivo e anestetizzato, insieme al protocollo per l'imaging del calcio in vivo del DRG esposto in risposta a vari stimoli viscerali e somatici. Per catturare i transitori di Ca2+ sono stati utilizzati topi Pirt-GCaMP6 o topi C57BL6 iniettati per via intratecale con virus AAV confezionati con GCaMP6. L'ampiezza di questi transitori indica sensibilità a specifiche modalità sensoriali. Le fibre afferenti hanno origine dagli organi interni, con corpi cellulari neuronali primari nei gangli spinali o vagali. Gli studi sulla nocicezione viscerale e sull'analgesia dell'agopuntura possono potenzialmente essere condotti sui neuroni sensoriali primari utilizzando tecnologie di imaging avanzate come l'imaging del calcio in vivo, consentendo la registrazione di insiemi di attività neuronale nell'animale intatto durante la stimolazione o l'intervento. Sono state registrate le risposte degli insiemi di neuroni DRG a stimoli somatici e viscerali applicati ai loro corrispondenti campi recettivi. Questa tecnica illustra come le popolazioni neuronali reagiscono a vari tipi di stimoli somatici e viscerali. È possibile confrontare in modo completo le risposte dell'ensemble neuronale a diversi stimoli, che è un approccio particolarmente prezioso nella ricerca sul dolore viscerale e sui meccanismi segmentali della stimolazione somatica, come l'agopuntura.

Seguendo il protocollo sopra descritto, è stato esposto il ganglio della radice dorsale lombare-6 di un topo transgenico Pirt-GCaMP6s, e sono stati applicati stimoli viscerali di distensione del colon-retto (CRD) o stimoli somatici di agopuntura al colon-retto o al campo recettivo. Questo esperimento aveva lo scopo di osservare il numero e i tipi di neuroni attivati da diversi stimoli viscerali CRD e stimoli somatici.
Come mostrato in Figura 2A, la maggior parte dei neuroni nel ganglio della radice dorsale lombare-6 non mostra fluorescenza GFP nelle condizioni di base. Questa fluorescenza di base può essere influenzata da due fattori: il livello di espressione di GCaMP e il possibile danno arrecato al ganglio della radice dorsale durante l'intervento chirurgico. Stimoli CRD hanno determinato un rapido e transitorio aumento della fluorescenza di GCaMP, e sono aumentati sia il numero che l'intensità dei segnali GFP, come si può osservare in Figura 2B. Cambiamenti simili si sono verificati in Figura 2C quando è stato applicato l'elettroagopuntura (EA) in BL25 (Dachangshu)18. BL25 si trova a 3 mm dal margine laterale della linea dorsale mediana del quarto inferioreth colonna vertebrale lombare, comunemente utilizzata in caso di disturbi intestinali inferiori20. Le cellule selezionate e numerate sono cerchiate in Figura 2D utilizzando il software di imaging.
Come descritto nel protocollo precedente, variazioni dell'intensità di fluorescenza superiori a una soglia di ≥30% di F0 sono state considerate risposte positive. Sono stati aggiunti colori pseudocromatici per mostrare l'immagine sovrapposta dei neuroni che hanno risposto sia al CRD (rosso) che all'EA (verde) nella Figura 2E. È presente un neurone sovrapposto che ha risposto sia a CRD che a EA, indicato dalla freccia nella Figura 2E. La mappa termica e il grafico a linee in Figura 2F e Figura 2H rappresentano le risposte di tutti i neuroni cerchiati nel software di imaging al CRD. Figura 2G mostra un istogramma con i diversi diametri dei neuroni responsivi al CRD. La mappa termica e il grafico a linee in Figura 2I e Figura 2K rappresentano le risposte di tutti i neuroni cerchiati nel software di imaging all'EA a BL25. Figura 2J mostra un istogramma con i diversi diametri dei neuroni responsivi all'EA. Oltre ad analizzare il numero e le intensità fluorescenti dei neuroni responsivi, è possibile analizzare le diverse risposte dei neuroni nel ganglio della radice dorsale di diverse dimensioni quando vengono applicati diversi stimoli, come mostrato in Figura 2G,J.
Una volta identificato un singolo neurone, è inoltre possibile analizzare le risposte della stessa cellula o di cellule adiacenti a diversi stimoli. Ciò consente di esaminare le interazioni spaziali e temporali tra diversi stimoli viscerali e somatici a livello del ganglio della radice dorsale (DRG).
<img alt="Chirurgia su topo con setup per imaging, esposizione del nervo, microscopio confocale, ventilatore in un diagramma sperimentale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65975/65975fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Procedura chirurgica per il ganglio della radice dorsale lombare-6. (A) La tracheotomia dell'animale sperimentale. (B) Vista superiore che mostra tre vertebre esposte, con il lato sinistro rivolto in direzione rostrale e il lato destro in direzione caudale. (C) La pinza vertebrale personalizzata. Si noti il cuscinetto regolabile, che permette un allineamento preciso del ganglio della radice dorsale esposto e dell'obiettivo per l'imaging, mantenuto a un angolo perpendicolare. Le pinze vertebrali sono controllate da unità a sfera universali, che facilitano la regolazione fine del ganglio registrato e dell'obiettivo. (D) Applicazione della pinza vertebrale ed esposizione del ganglio della radice dorsale prima dell'imaging. (E) Immagini ingrandite che mostrano da vicino il ganglio della radice dorsale lombare-6 sinistro esposto. (F) Rappresentazione del ventilatore per l'anestesia e della piattaforma personalizzata utilizzata in questa procedura. (G) Il processo di imaging del ganglio della radice dorsale attraverso l'obiettivo del microscopio. (H) Una rappresentazione schematica della stimolazione somatica e viscerale durante la registrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65975/65975fig01largev4.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Imaging del calcio e analisi dei dati dell'attivazione neuronale; mappe di calore, grafici della fluorescenza, CRD, EA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65975/65975fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Immagini rappresentative e analisi dell'imaging del calcio in vivo di neuroni del ganglio della radice dorsale lombare-6. (A-C) Immagini rappresentative mostrano neuroni del ganglio della radice dorsale lombare-6 durante la condizione basale, dopo stimolazione da CRD e successivamente a stimolazione BL25 EA. (D) Le immagini illustrano cellule etichettate e numerate all'interno di un singolo ganglio della radice dorsale lombare-6 dopo il tracciamento cellulare effettuato mediante il software di imaging. (E) Immagini sovrapposte mostrano gruppi di neuroni del ganglio della radice dorsale lombare-6 che rispondono a entrambi gli stimoli, CRD (in rosso) ed EA (in verde). Le barre della scala = 100 µm. (F), (H), (I), (K) Mappe di calore e grafici a linee mostrano le variazioni dell'intensità di fluorescenza nelle cellule tracciate in risposta agli stimoli CRD ed EA. (G), (J) Rappresentazione del numero di cellule responsivi di diverse dimensioni agli stimoli CRD ed EA. Le barre di errore indicano la media ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65975/65975fig02largev3.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Il presente protocollo delinea l'imaging del calcio in vivo per misurare le risposte di insiemi di neuroni DRG lombari-6 a stimoli somatici e viscerali. Confronti approfonditi possono essere effettuati tra i neuroni che rispondono a diversi stimoli. Questo protocollo è prezioso per studiare i meccanismi del dolore viscerale e della stimolazione somatica, come l'agopuntura.

in vivo Imaging del calcio della risposta dei neuroni dei gangli della radice dorsale a stimoli somatici e viscerali

A technique is described for surgically exposing the dorsal root ganglion (DRG) of the lumbar-6 in a live, anesthetized laboratory mouse, along with the ...

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Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari in gangli radicali dorsali intatti. J. Vis. Exp. (2023). Il video mostra una tecnica di imaging del calcio in vivo per monitorare l'attività neuronale nei gangli della radice dorsale (DRG) di un topo transgenico. I neuroni DRG esprimono un indicatore di calcio che aumenta l'intensità della fluorescenza dopo il legame con il calcio. Gli stimoli meccanici o termici applicati a una...

Imaging del calcio in vivo di insiemi neuronali nei gangli della radice dorsale intatti di un topo

Con il suo piccolo corpo trasparente, ben documentato neuroanatomia e una serie di tecniche genetiche suscettibili e...

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In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

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Questo studio presenta una manipolazione chirurgica per esporre il T-DRG in topi anestetizzati per l'imaging del calcio in vivo , insieme a registrazioni ECG sincrone. Questo metodo rappresenta uno strumento all'avanguardia per lo studio della stimolazione elettrica dei nervi periferici e degli input degli organi viscerali toracici, nonché delle loro interazioni a livello sensoriale primario.

Imaging del calcio dei gangli della radice dorsale toracica (DRG) in vivo e registrazione ECG per lo studio della stimolazione dei nervi periferici

Questo protocollo descrive l'imaging in vivo del calcio GCaMP di neuroni del ganglio trigemino (TG) intatti. Questa descrizione include la chirurgia dell'esposizione ai TG, l'imaging al microscopio confocale in vivo dei neuroni TG, l'applicazione di stimoli somatici durante l'imaging microscopico dei neuroni TG e l'analisi dei dati di imaging del calcio GCaMP in vivo .

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Vi presentiamo un metodo per immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale. L'approccio può essere utilizzata per identificare specifici siti di legame fattore di trascrizione e di importanti modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA per la rigenerazione degli assoni danneggiati sia nel sistema nervoso periferico e centrale.

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Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

GABAergica inibizione presinaptica è un potente meccanismo inibitorio nel midollo spinale importante per il motore e l'integrazione del segnale sensoriale in reti midollo spinale. Sottostante afferenti primari depolarizzazione può essere misurata mediante registrazione dei potenziali radice dorsale (DRP). Qui mostriamo un metodo di registrazione in vivo di DRP nei topi.

Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Gangli spinali (DRG) sono strutture che contengono i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico. Quando dissociato, possono essere co-coltura con cellule staminali derivate da tessuto adiposo SC-like (ASC), che fornisce un modello valido per lo studio in vitro rigenerazione e mielinizzazione nervo, imitando l'ambiente in vivo presso il sito di lesione.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Scopri l'imaging del calcio in vivo per analizzare le risposte neuronali dei gangli della radice dorsale lombare-6 a stimoli somatici e viscerali nel topo. Questo metodo avanzato consente di studiare i meccanismi del dolore viscerale e gli effetti analgesici dell'agopuntura con risoluzione cellulare.

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