Photo-geïnduceerde verknoping van ongeschikte Eiwitten (PICUP) Toegepast op Amyloidogenic Peptiden
Summary
Photo-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) maakt karakterisering van oligomeer grootte van de distributie in metastabiele eiwitmengsels. Tonen we de toepassing van PICUP aan drie representatieve amyloidogenic peptiden van de 40 – en 42-residu vormen van amyloid β-eiwit, en calcitonine, en een controle peptide groei-hormoon releasing factor.
Abstract
De assemblage van amyloidogenic eiwitten in toxische oligomeren is een rudimentaire gebeurtenis in de pathogenese van eiwit misfolding ziekten, waaronder Alzheimer, Parkinson en Huntington ziekten, erfelijke amyotrofe laterale sclerose, en type 2 diabetes. Vanwege de metastabiele aard van deze verzamelingen van eiwitten, is het moeilijk om hun oligomeer grootte-verdeling kwantitatief te beoordelen met behulp van klassieke methoden, zoals elektroforese, chromatografie, fluorescentie, of dynamische lichtverstrooiing. Oligomeren van amyloidogenic eiwitten bestaan als metastabiele mengsels, waarin de oligomeren dissociëren in monomeren en tegelijkertijd associate in grotere assemblages. PICUP stabiliseert oligomeer populaties door covalente cross-linking en in combinatie met fractionering methoden, zoals natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) of size-exclusion chromatografie (SEC), PICUP biedt snapshots van het oligomeer grootte distributies die bestond voordat kruis -linking. Vandaar dat PICUP maakt visualisatie en kwantitatieve analyse van metastabiele eiwit bevolking en kan gebruikt worden om de montage en ontcijferen relaties tussen volgorde wijzigingen en oligomerisatie te controleren<sup> 1</sup>. Mechanistisch, PICUP gaat om foto-oxidatie van Ru<sup> 2 +</sup> In een tris (bipyridyl) Ru (II) complex (RuBpy) naar Ru<sup> 3 +</sup> Door bestraling met zichtbaar licht in de aanwezigheid van een elektron acceptor. Ru<sup> 3 +</sup> Is een sterke een-elektron oxidator in staat is te abstraheren een elektron uit een naburige eiwitmolecuul, het genereren van een eiwit radicale<sup> 1,2</sup>. Radicalen zijn onstabiele, zeer reactieve stoffen en dus snel verdwijnen door een verscheidenheid aan intra-en intermoleculaire reacties. Een radicaal kan gebruik maken van de hoge energie van een ongepaard elektron om te reageren met een ander eiwit monomeer de vorming van een dimeer radicaal, die vervolgens verliest een waterstofatoom en vormt een stabiele, covalent gekoppelde dimeer. De dimeer kan dan verder reageren via een vergelijkbaar mechanisme met monomeren of andere dimeren naar een hogere orde oligomeren vormen. Voordelen van PICUP in vergelijking met andere foto-of chemische verknoping methoden<sup> 3,4</sup> Zijn korte (≤ 1 s) blootstelling aan niet-destructieve zichtbaar licht, geen behoefte aan<i> Pre facto</i> Aanpassing van de natieve sequentie, en de lengte nul covalente cross-linking. Daarnaast PICUP maakt cross-linking van eiwitten binnen de brede pH en temperatuur bereiken, inclusief fysiologische parameters. Hier tonen we de toepassing van PICUP tot verknoping van drie eiwitten amyloidogenic de 40 – en 42-residu amyloid β-eiwit varianten (Aβ40 en Aβ42) en calcitonine, en een controle eiwit, de groei-hormoon releasing factor (GRF).
Protocol
Discussion
PICUP is oorspronkelijk ontwikkeld om een stabiele eiwitcomplexen 2-studie. De methode werd later toegepast op de kwantitatieve studie van metastabiele amyloïde eiwit assemblages, waaronder Aß 10, prion en ziekte-geassocieerde PrP Sc 11, en α-synucleïne 12. De belangrijkste factoren die moeten worden genomen bij het ontwerpen van een PICUP experiment zijn de reagens stoichiometrie, bestraling tijd, en monstervoorbereiding procedure. De eerste twee punten kan verlangen empirische optimali…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies AG027818 en AG030709 van NIH / NIA, 2005/2E uit de Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 van de Alzheimer Association, en 07-65798 uit California Department of Public Health.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Altro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Altro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Altro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Altro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Riferimenti
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
