Photo-induite réticulation des protéines non modifiées (PICUP) appliqué à des peptides amyloïdogéniques
Summary
Photo-induit de réticulation des protéines non modifiées (PICUP) permet de caractériser la distribution de taille oligomère de mélanges de protéines métastable. Nous démontrons l'application de PICUP à trois peptides représentatifs amyloïdogéniques les 40 – et 42-résidus formes d'amyloïde β-protéine, et la calcitonine, et un peptide contrôle l'hormone de croissance facteur de libération.
Abstract
L'assemblage des protéines amyloïdogéniques en oligomères toxiques est un événement majeur dans la pathogenèse des maladies repliement des protéines, y compris la maladie d'Alzheimer, de Parkinson et les maladies de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique héréditaire, et diabète de type 2. En raison de la nature métastable de ces assemblages de protéines, il est difficile d'évaluer leur distribution en taille oligomère quantitativement en utilisant les méthodes classiques, telles que l'électrophorèse, la chromatographie diffusion de la lumière, la fluorescence, ou dynamique. Les oligomères de protéines amyloïdogéniques existent sous forme de mélanges métastable, dans lequel les oligomères se dissocient en monomères et d'associer en grandes assemblées simultanément. PICUP stabilise les populations oligomère par reticulation covalente et lorsqu'il est combiné avec des méthodes de fractionnement, tels que le sulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodecyl (SDS-PAGE) ou chromatographie d'exclusion stérique (SEC), offre des instantanés de PICUP les distributions de taille oligomère qui existaient avant la Croix -lier. Ainsi, PICUP permet la visualisation et l'analyse quantitative des populations en protéines métastable et peut être utilisé pour surveiller les relations d'assemblage et décrypter entre les modifications de séquence et d'oligomérisation<sup> 1</sup>. Mécaniste, PICUP implique la photo-oxydation de Ru<sup> 2 +</sup> Dans un tris (bipyridyle) Ru (II) complexes (RuBpy) à Ru<sup> 3 +</sup> Par irradiation avec une lumière visible en présence d'un accepteur d'électrons. Ru<sup> 3 +</sup> Est un puissant oxydant à un électron capable d'abstraire un électron d'une molécule de protéine voisins, générant une protéine radicale<sup> 1,2</sup>. Les radicaux sont instables et hautement réactives et donc des espèces disparaissent rapidement à travers une variété de réactions intra-et intermoléculaires. Un radical peut utiliser l'énergie élevés d'un électron non apparié à réagir avec un autre monomère de protéine formant un dimère, radical qui perd ensuite un atome d'hydrogène et de formes stables, de manière covalente liés dimère. Le dimère peut alors réagir davantage à travers un mécanisme similaire avec des monomères ou des dimères d'autres pour former des oligomères d'ordre supérieur. Avantages de relative PICUP d'autres photo-chimiques ou de méthodes de réticulation<sup> 3,4</sup> Inclure court (≤ 1 s) d'exposition à la non-destructive de la lumière visible, pas besoin de<i> Pré facto</i> Modification de la séquence native, et de longueur nulle reticulation covalente. En outre, PICUP permet de réticulation des protéines au sein de pH et de température, y compris les paramètres physiologiques. Ici, nous montrons l'application de PICUP de réticulation de trois protéines amyloïdogéniques les 40 – et 42-amyloïde β-résidus de protéines variantes (Aß40 et Aß42), et la calcitonine, et une protéine de contrôle, l'hormone de croissance Facteur (GRF).
Protocol
Discussion
PICUP a été développé à l'origine pour étudier les complexes protéiques stables 2. La méthode a été appliquée plus tard à l'étude quantitative de la protéine amyloïde métastable assemblées, y compris Aßi 10, prions et les maladies associées à la PrP Sc 11, et α-synucléine 12. Les facteurs les plus importants qui doivent être considérés lors de la conception d'une expérience PICUP sont la stoechiométrie des réactifs, temps d'irradiation, et la procédure …
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions et des AG027818 AG030709 du NIH / NIA, 2005/2E de la Fondation Larry L. Hillblom, IIRG-07-58334 de l'Association Alzheimer, et 07-65798 de la Californie ministère de la Santé publique.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Altro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Altro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Altro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Altro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Riferimenti
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
