Photo-induzierte Vernetzung von unmodifizierten Proteins (picup) zu amyloidogene Peptide Applied
Summary
Photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine (picup) ermöglicht die Charakterisierung des Oligomers Größenverteilung in metastabilen Protein-Mischungen. Wir zeigen, Anwendung picup zu drei Vertreter amyloidogene Peptide der 40 – und 42-Rückstand bildet der Amyloid-β-Protein und Calcitonin, und eine Kontrollgruppe Peptid Wachstumshormon-Releasing-Faktor.
Abstract
Die Montage der amyloidogene Proteine in toxischen Oligomere ist ein wegweisendes Ereignis in der Pathogenese der Fehlfaltung Erkrankungen, darunter Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit, erblich amyotrophe Lateralsklerose, und Typ 2 Diabetes. Aufgrund der metastabilen Charakter dieser Protein-Baugruppen, ist es schwierig, ihre Oligomer Größenverteilung quantitativ zu erfassen mit klassischen Methoden wie Elektrophorese, Chromatographie, Fluoreszenz oder dynamische Lichtstreuung. Oligomere von amyloidogene Proteine existieren als metastabile Mischungen, in denen die Oligomere in Monomere dissoziieren und assoziieren zu größeren Baugruppen gleichzeitig. Picup stabilisiert Oligomer Populationen durch kovalente Vernetzung und wann mit Fraktionierung Methoden, wie Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Größenausschlusschromatographie (SEC) kombiniert wird, liefert picup Schnappschüsse des Oligomers Größe Distributionen, die vor dem Kreuz gab Vernetzung. Daher ermöglicht picup Visualisierung und quantitativen Analyse von metastabilen Protein Populationen und kann zur Montage und entschlüsseln Beziehungen zwischen Sequenz Modifikationen und Oligomerisierung überwachen<sup> 1</sup>. Mechanistisch beinhaltet picup Photo-Oxidation von Ru<sup> 2 +</sup> In einem Tris-(Bipyridyl) Ru (II)-Komplex (Rubpy) zu Ru<sup> 3 +</sup> Durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht in Gegenwart von Elektronen-Akzeptor. Ru<sup> 3 +</sup> Ist eine starke Ein-Elektronen-Oxidationsmittel in der Lage zu abstrahieren ein Elektron von einem benachbarten Eiweißmolekül, erzeugt ein Protein, radikale<sup> 1,2</sup>. Radikale sind instabile, hochreaktive Spezies und daher rasch verschwinden durch eine Vielzahl von intra-und intermolekularen Reaktionen. Ein Rest kann nutzen die hohe Energie eines ungepaarten Elektrons mit einem anderen Protein-Monomer Bildung eines dimeren Radikal, das später verliert ein Wasserstoffatom und bildet einen stabilen, kovalent verknüpftes Dimer reagieren. Das Dimer kann dann weiter reagieren durch einen ähnlichen Mechanismus mit Monomeren oder anderen Dimere höherer Ordnung Oligomere bilden. Vorteile der picup im Vergleich zu anderen Foto-oder chemische Vernetzung Methoden<sup> 3,4</sup> Sind kurze (≤ 1 s) Exposition gegenüber nicht-destruktive sichtbares Licht, keine Notwendigkeit für<i> Pre-facto-</i> Änderung der nativen Sequenz und der Länge Null kovalente Vernetzung. Darüber hinaus ermöglicht picup Quervernetzung von Proteinen in weiten pH-und Temperaturbereichen, einschließlich physiologischer Parameter. Hier zeigen wir Anwendung von picup zur Vernetzung von drei amyloidogene Proteine die 40 – und 42-Rückstände Amyloid β-Protein-Varianten (Aβ40 und Aß42) und Calcitonin, und eine Kontroll-Protein, Wachstumshormon-Releasing-Faktor (GRF).
Protocol
Discussion
Picup war ursprünglich eine stabile Protein-Komplexe 2-Studie entwickelt. Die Methode wurde später auf quantitative Studie von metastabilen Amyloid-Protein-Baugruppen, darunter Aß 10, Prionen und krankheits-assoziierte PrP Sc 11 und α-Synuclein 12 aufgebracht. Die wichtigsten Faktoren, die bei der Gestaltung eines picup Experiment werden müssen, sind das Reagenz Stöchiometrie, Bestrahlungszeit und Probenvorbereitung. Die ersten beiden Probleme erfordern empirische Optimierung, während die l…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AG027818 und AG030709 von NIH / NIA, 2005/2E aus dem Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 vom Alzheimer Association und 07-65798 vom California Department of Public Health unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Altro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Altro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Altro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Altro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Riferimenti
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
