사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) Amyloidogenic 펩티드에 적용
Summary
사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP)의 것은 metastable 단백질 혼합물의 올리고머 크기 분포의 특성을 허용합니다. 우리는 세 대표 amyloidogenic 펩티드 40 PICUP의 응용 프로그램을 보여줍니다 – 그리고 아밀로이드 β 단백질 및 칼시토닌의 42 잔여물 형태 및 제어 펩타이드 성장 호르몬 방출 인자.
Abstract
독성 oligomers로 amyloidogenic 단백질의 조립은 알츠하이머, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병, 유전 루게릭병, 그리고 2 형 당뇨병을 포함한 단백질 misfolding 질환의 pathogenesis에 있게한 이벤트입니다. 이러한 단백질 어셈블리의 metastable 특성 때문에, 그것은 전기, 크로마 토그래피, 형광, 또는 동적 광 산란과 같은 고전적인 방법을 사용하여 양적 자신의 올리고머의 크기 분포를 평가하기 어렵습니다. amyloidogenic 단백질 Oligomers은 oligomers가 단량체로 교제를 끊다 동시에 큰 어셈블리에 연결할하는 metastable 혼합물로 존재합니다. PICUP 교차하기 전에 존재 올리고머 크기 배포판 공유 결합 가교와 같은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS – PAGE) 또는 크기 배제 크로마 토그래피 (SEC)와 같은 분류 방법과 결합하면 PICUP이 제공하는 스냅샷의 올리고머의 인구 안정화 – 연결. 따라서, PICUP는 metastable 단백질 인구의 시각화 및 정량 분석을 가능하게하고 시퀀스 수정 및 oligomerization 사이의 조립 및 해독 관계를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다<sup> 1</sup>. Mechanistically, PICUP는 루의 사진 산화를 포함<sup> 2 +</sup> 트리스 (bipyridyl) 루 (II) 복잡한 (RuBpy)에 루에<sup> 3 +</sup> 전자 수용체의 존재에 가시 광선과 방사선에 의해. 루<sup> 3 +</sup> 단백질 급진적인 생성, 이웃 단백질 분자에서 전자를 추출 수있는 강력한 한 전자 산회제입니다<sup> 1,2</sup>. 부수는 불안정, 높은 반응 종이며, 따라서 내부 및 분자간 반응의 다양한 통하여 급속하게 사라집니다. 급진은 이후 수소 원자를 잃고 안정, covalently 링크된 이합체을 형성 dimeric 급진를 형성 다른 단백질 단량체와 반응하는 unpaired 전자의 높은 에너지를 활용할 수 있습니다. 이합체 다음 고차원 oligomers를 형성하는 단량체 또는 다른 dimers와 유사한 메커니즘을 통해 추가로 반응 수 있습니다. 다른 사진이나 화학 가교 방법에 PICUP 상대의 장점<sup> 3,4</sup> 짧은 (≤ 1 S) 비파괴 가시 광선에 대한 노출에 대한 필요가 포함<i> 예약상의</i> 기본 순서의 변경, 그리고 길이가 0 인 가교 공유 결합. 또한, PICUP는 수 간 연결 넓은 산도와 physiologic 매개 변수를 포함하여 온도 범위 내에서 단백질의. 여기, 우리는 세 amyloidogenic 단백질 40의 상호 연결에 PICUP의 응용 프로그램을 보여 – 42 – 잔류 아밀로이드 β 단백질의 변종 (Aβ40과 Aβ42) 및 칼시토닌 및 제어 단백질, 성장 호르몬 방출 인자 (GRF).
Protocol
Discussion
PICUP는 안정적인 단백질 단지 2 공부 원래 개발되었습니다. 방법은 Aβ 10, 프리온 질병 – 관련 PrP SC 11, 및 α – synuclein 12를 포함한 metastable 아밀로이드 단백질 어셈블리의 양적 연구 나중에 적용되었다. PICUP 실험을 디자인할 때 고려되어야하는 가장 중요한 요소는 시약의 stoichiometry, 조사 시간 및 샘플 준비 절차입니다. 후자 문제가 크게 실험 데이터의 해석에 영향을 미치는 반면 전…
Acknowledgements
이 작품은 공중 보건의 캘리포니아학과에서 래리 L. Hillblom 알츠하이머 협회 재단 IIRG – 07-58334, 07-65798에서와 NIH / NIA, 2005/2E에서 보조금 AG027818 및 AG030709 지원했다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Altro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Altro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Altro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Altro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Riferimenti
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