Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas
Summary
Foto-induzida ligação cruzada de proteínas não modificadas (picup) permite a caracterização da distribuição de tamanho de oligômero em misturas de proteínas metaestável. Demonstramos aplicação de picup a três peptídeos representante amiloidogênicas a 40 – e 42 resíduos de formas de amilóide β-proteína, e calcitonina, peptídeo e um controle do fator de crescimento hormônio liberador.
Abstract
O conjunto de proteínas amiloidogênicas em oligômeros tóxicos é um evento seminal na patogênese de doenças proteína misfolding, incluindo Alzheimer, Parkinson e doenças de Huntington, esclerose amiotrófica hereditária lateral, e diabetes tipo 2. Devido à natureza metaestável destes conjuntos de proteínas, é difícil avaliar a sua distribuição de tamanho de oligômero quantitativamente usando métodos clássicos, tais como eletroforese, cromatografia de espalhamento de luz, fluorescência, ou dinâmico. Oligômeros de proteínas amiloidogênicas existir como misturas metaestável, em que os oligômeros se dissociam em monômeros e associar em conjuntos maiores simultaneamente. Picup estabiliza populações oligômero por covalente cross-linking e quando combinado com métodos de fracionamento, como eletroforese em gel de sulfato de sódio dodecil de poliacrilamida (SDS-PAGE) ou tamanho-exclusão cromatografia (SEC), picup fornece instantâneos das distribuições de tamanho de oligômero que existia antes de cruz -linking. Assim, picup permite a visualização e análise quantitativa das populações de proteína metaestável e pode ser usado para monitorar a montagem e decifrar as relações entre modificações seqüência e oligomerização<sup> 1</sup>. Mecanicamente, picup envolve foto-oxidação de Ru<sup> 2 +</sup> Num (bipyridyl) Ru tris complexo (II) (RuBpy) a Ru<sup> 3 +</sup> Por irradiação com luz visível na presença de um receptor de elétrons. Ru<sup> 3 +</sup> É um oxidante de um elétron forte, capaz de abstrair um elétron de uma molécula de proteína vizinhos, gerando uma proteína radical<sup> 1,2</sup>. Os radicais são instáveis e altamente reativos e, portanto, as espécies desaparecem rapidamente através de uma variedade de reações intra e intermoleculares. Um radical pode utilizar a energia de alta de um elétron desemparelhado reagir com outro monômero formando uma proteína dimérica radical, que, posteriormente, perde um átomo de hidrogênio e forma uma estável, dímero covalentemente ligadas. O dimer pode então reagir ainda mais através de um mecanismo semelhante com monômeros ou dímeros para formar oligômeros de ordem superior. Vantagens de parente picup para outros foto-química ou cross-linking métodos<sup> 3,4</sup> Incluem a exposição (≤ 1 s) curta para não-destrutiva da luz visível, sem necessidade de<i> Pré facto</i> Modificação da seqüência nativa, e de comprimento zero covalente cross-linking. Além disso, permite picup ligação cruzada de proteínas dentro pH de largura e faixas de temperatura, incluindo parâmetros fisiológicos. Aqui, demonstramos a aplicação de picup cross-linking de três proteínas amiloidogênicas a 40 – e 42 resíduos de amilóide β proteínas variantes (Aβ40 e Aβ42) e calcitonina, e uma proteína de controle, fator de crescimento hormônio liberador (GRF).
Protocol
Discussion
Picup foi desenvolvido originalmente para estudar complexos de proteína estável 2. O método foi aplicado mais tarde para estudo quantitativo de assembléias amilóide metaestável proteína, incluindo Aâ 10, prion e doenças associadas ao PrP Sc 11, e α-sinucleína 12. Os fatores mais importantes que devem ser considerados ao projetar um experimento picup estão a estequiometria reagente, tempo de irradiação, eo procedimento de preparação da amostra. As duas primeiras questões podem exig…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações e AG027818 AG030709 de NIH / NIA, 2005/2E da L. Larry Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 da Associação Alzheimer, e 07-65798 da Califórnia Departamento de Saúde Pública.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Altro | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Altro | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Altro | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Altro | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Riferimenti
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
